Ćwiczenie 2. Fotometryczne oznaczanie zawartości białka

Transkrypt

1 Ćwiczenie 2. Fotometryczne oznaczanie zawartości białka Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie zasad, na których oparte są waŝniejsze metody oznaczania białka, związane z cechami jego budowy. Celem równoległym jest zapoznanie się, na przykładzie metody Lowry ego i współpracowników, z fotometryczną analizą ilościową często wykorzystywaną w badaniach biochemicznych. Metoda ta moŝe być zastosowana np. do oznaczania białka w mleku. Wprowadzenie Metody oznaczania zawartości białka oparte są na charakterystycznych cechach jego budowy. Najczęściej wykorzystywane są następujące cechy białek: 1) obecność azotu w składzie pierwiastkowym, 2) obecność reszt aminokwasów aromatycznych (fenyloalaniny, tyrozyny, tryptofanu) w składzie aminokwasowym, 3) występowanie wiązań peptydowych, 4) występowanie wolnych grup aminowych. Metody fotometryczne oznaczania białka W metodach fotometrycznych wykorzystuje się zjawisko pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego przez róŝne substancje. Pomiar absorpcji światła przy określonej częstotliwości drgań (długości fali) moŝe być miarą ilości substancji absorbującej i jest podstawą fotometrycznej analizy ilościowej. Do oznaczeń wykorzystuje się widmo określonych związków lub barwnych produktów powstałych w wyniku reakcji chemicznych, które moŝna mierzyć metodami spektrofotometrycznymi i kolorymetrycznymi. Zdolność pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego określonej częstotliwości przez daną substancję zaleŝy od jej struktury, a zwłaszcza od występowania i rozmieszczenia wiązań nienasyconych (głównie podwójnych). Na przykład, wiązania podwójne sprzęŝone absorbują światło w granicach 19 3 nm, a więc w zakresie nadfioletu, przy czym pierścień pirymidynowy wykazuje maksimum przy 255 nm, układ purynowy przy 265 nm, a pierścień fenylowy przy 28 nm. Substancje barwne pochłaniają fale świetlne w zakresie widma widzialnego (38 78 nm) o barwie dopełniającej do tej, która jest dostrzegana przez oko ludzkie, np. barwa czerwona jest dopełniająca do niebieskiej, fioletowa do Ŝółtej, a zielona do pomarańczowej. Stopień pochłaniania światła (wygaszenie) jest proporcjonalny do stęŝenia substancji pochłaniającej, a zaleŝność ta jest tym bardziej ścisła, im mniejsza jest rozpiętość długości fali w wiązce światła padającego. Prawa fizyczne z tym związane są więc aktualne w pełni tylko w świetle monochromatycznym, tzn. o ściśle określonej długości fali. Dlatego teŝ w przyrządach pomiarowych wysokiej klasy spektrofotometrach, w celu uzyskania wiązki światła monochromatycznego stosuje się pryzmaty kwarcowe o znacznej zdolności rozszczepiania widma. Natomiast w fotometrach średniej klasy uŝywane są w tym celu znacznie tańsze siatki dyfrakcyjne. Do praw fizycznych, na których oparte są ilościowe metody fotometryczne, naleŝą: prawo Lamberta, prawo Beera oraz ich połączenie. Prawo Lamberta ujmuje wprost proporcjonalną zaleŝność między grubością warstwy badanego roztworu (d) a ilością pochłoniętego przez ten roztwór światła, wyraŝoną jako 1

2 logarytm stosunku natęŝenia światła padającego (I o ) do natęŝenia światła przechodzącego (I), przedstawiony równaniem: log I = k d I Natomiast prawo Beera określa wprost proporcjonalną zaleŝność między stęŝeniem substancji (c) a ilością światła pochłoniętego, wyraŝoną jak poprzednio jako log I o /I, co przedstawia równanie: log I = k c I Połączone prawo Lamberta i Beera ujmuje zaleŝność między ilością światła pochłoniętego a stęŝeniem (c) i grubością (d) barwnego roztworu: log I k c d A I = = Wartość log I o /I jest miarą wygaszania światła przez barwny roztwór i nosi nazwę ekstynkcji (E) lub absorbancji (A); k, k', k'' oznaczają współczynniki proporcjonalności. Współczynnik proporcjonalności k nosi nazwę molowego współczynnika absorbancji. Jest on stały dla danej substancji i rozpuszczalnika. MoŜna ten współczynnik ustalić mierząc absorbancję (A) roztworu barwnego o stęŝeniu 1 mola i o określonej grubości warstwy (najczęściej 1 cm). W metodzie fotometrycznej pomiar polega na bezpośrednim odczycie absorbancji warstwy badanego roztworu o stałej grubości. W tych warunkach stęŝenie substancji jest wprost proporcjonalne do absorbancji, czyli A = log I o /I = k d c. Zamiast stosowania molowego współczynnika absorbancji k na ogół jest wygodniej wykreślić tzw. krzywą wzorcową dla oznaczanej substancji. Wykreśla się ją odkładając na osi rzędnych wartość absorbancji kilku róŝnych znanych stęŝeń badanego związku, a na osi odciętych odpowiadające im stęŝenia substancji. Krzywe wzorcowe wyraŝone w wartościach absorbancji powinny mieć kształt linii prostej. Pomiary fotometryczne dokonywane są za pomocą fotometrów lub spektrofotometrów wyposaŝonych w tzw. fotoogniwa lub fotokomórki, które słuŝą do pomiarów natęŝenia światła przechodzącego przez roztwór pochłaniający (badany) oraz przez próbę odniesienia (najczęściej czysty rozpuszczalnik). Pomiar próby odniesienia (kontrolnej) zwykle słuŝy do wyzerowania przyrządu, gdyŝ nastawia się go według tej próby na w wypadku pomiaru absorbancji. Przyrządy są wyskalowane na pomiar absorbancji, a wskazań dokonuje sprzęŝony z tą skalą miernik. Opis zasad wybranych metod oznaczania zawartości białka stosowanych w laboratoriach biochemicznych. Metoda Lowry ego i współpracowników. Bardzo popularnym sposobem oznaczania ilości białka jest metoda Lowry'ego i współpracowników, która stanowi temat ćwiczenia. W metodzie tej wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań peptydowych oraz obecność aminokwasów aromatycznych. Metoda ta składa się z 2 etapów, w pierwszym zachodzi reakcja biuretowa (tworzenie barwnych kompleksów przez wiązania peptydowe i jony miedziowe w środowisku zasadowym). W drugim etapie metody reakcja biuretowa jest wzmocniona reakcją z odczynnikiem Folina-Ciocalteu, w której kwasy: fosforomolibdenowy i fosforowolframowy ulegają redukcji do odpowiednich tlenków z udziałem głównie tyrozyny 2

3 i tryptofanu. StęŜenie barwnego (fioletowego) kompleksu moŝna mierzyć w zakresie widma widzialnego długości 6 7 nm. Podobnie jak w innych metodach kolorymetrycznych stęŝenie białka odczytuje się z krzywej wzorcowej. Przy tym dla uzyskania właściwych wyników niezmiernie waŝny jest dobór białka wzorcowego do sporządzania tej krzywej. Powinno ono zawierać w cząsteczce ilości tyrozyny, tryptofanu moŝliwie zbliŝone do badanego białka. Zaletą metody jest znaczna jej czułość (jest to metoda bardziej czuła od metody spektrofotometrycznej), moŝna bowiem oznaczyć ilość białka juŝ od 1 µg w próbie, a zaleŝność proporcjonalną między intensywnością zabarwienia roztworu a stęŝeniem białka obserwuje się nawet przy większych stęŝeniach do 2 µg. Wadą metody jest błąd oznaczenia wynikający z trudności doboru odpowiedniego białka wzorcowego w stosunku do białka oznaczanego (np. trypsyna daje 3x większe natęŝenie barwy niŝ Ŝelatyna). Inną wadą jest zawyŝanie wyników oznaczania w wyciągach nie dializowanych z powodu redukcji odczynnika Folina przez wolne aminokwasy, niewielkie peptydy, fenole nitrofenole, w mniejszym stopniu przez puryny i pirymidyny, kwas moczowy oraz niektóre detergenty. Z kolei związki takie jak ZnSO 4, (NH 4 ) 2 SO 4, CCl 3 COOH, HClO 4, aceton, etanol, sacharoza, zaleŝnie od stęŝenia obniŝają intensywność barwy. Metoda z zastosowaniem kwasu bicynchoninowego (BCA). Metoda podobna do metody Lowry ego, jony Cu 2+ ulegają redukcji w środowisku zasadowym do Cu + i następnie reagują z BCA. Czułość tej metody jest podobna do metody Lowry ego, zaletą jest to, Ŝe przebiega jednoetapowo, a produkt reakcji przyjmuje intensywne czerwone zabarwienie, które moŝna mierzyć prze długości fali 562 nm. Metodę tą moŝna z powodzeniem stosować w obecności detergentów, mocznika, chlorku guanidyny, które przeszkadzają w metodzie Lowry ego. Wadą tej metody jest to, Ŝe duŝe stęŝenie cukrów redukujących przeszkadza prawidłowym oznaczeniu stęŝenia białka. Metoda Bradford, z zastosowaniem błękitu Coomassie. Jest to prostsza, czulsza (od 1 µg białka w próbie) i szybsza metodą niŝ metoda Lowry ego. Polega na reakcji reszt aminokwasowych argininy, lizyny oraz w mniejszym stopniu histydyny i aminokwasów aromatycznych (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina) w białkach z formą anionową błękitu Coomassie G-25. Intensywność zabarwienia kompleksu białko barwnik mierzy się przy długości fali 595 nm bezpośrednio po wykonaniu reakcji. W warunkach standardowych w tej metodzie barwnik nie wiąŝe się z wolnymi amiokwasami (argininą i lizyną) oraz z peptydami o masie cząsteczkowej niŝszej niŝ 3 Da. Wadą tej metody jest duŝa zmienność absorbancji (A 595 ) dla róŝnych rodzajów białek, dla identycznych stęŝeń wagowych tych białek np. 1mg/1ml wynikająca z pomiaru w białku reszt aminokwasów aromatycznych, których zawartość w róŝnych białkach jest niejednakowa. Inną wadą jest zawyŝanie wyników przez detergenty, polifenole, amfolity, oraz zasady obecne w środowisku reakcji. Z kolei związki takie jak chlorowodorek guanidyny, askorbinian sodu, konkurując z barwnikiem o białko obniŝają intensywność barwy kompleksu. Spektrofotometryczna metoda oznaczania białka. Większość związków aromatycznych ma zdolność pochłaniania światła nadfioletowego o długości fali 28 nm. Obecność reszt aminokwasów aromatycznych (przede wszystkim tyrozyny i tryptofanu, a w duŝo mniejszym stopniu fenyloalaniny i mostków disiarczkowych) w białkach nadaje ich roztworom tę zdolność, co jest wykorzystywane jako podstawa spektrofotometrycznej metody ich oznaczania. Wadą tej metody jest duŝa zmienność absorbancji (A 28 ) dla róŝnych rodzajów białek, wynikająca z niejednakowej procentowej zawartości aminokwasów w białkach. Inną wadą metody spektrofotometrycznej jest moŝliwość zawyŝenia odczytu przez kwasy nukleinowe obecne w próbie i inne barwniki, związki fenolowe absorbujące światło przy tej długości fali. Zaletą metody jest jej prostota i szybkość pomiaru, co ma szczególne znaczenie w preparatyce enzymatycznej. Stosując tę metodę moŝna oznaczyć w próbie białko o stęŝeniu od 1 µg. 3

4 Odczynniki 1. Odczynnik miedziowy: a) 2-proc. roztwór węglanu sodowego w,1-molowym wodorotlenku sodowym, b) 2-proc. wodny roztwór winianu sodowo-potasowego, c) 1-proc. wodny roztwór CuSo 4 5 H 2 O; przed uŝyciem w cylindrze miarowym na 1 ml zmieszać 98 ml roztworu a) z 1 ml roztworu b) i 1 ml roztworu c). 2. Odczynnik Folina wykonanie patrz. str Wzorcowe roztwory albuminy o stęŝeniach 2, 4, 8, 14 i 2 µg/ml. 4) Rozcieńczony roztwór albuminy technicznej jako zadanie kontrolne. Wykonanie 1. Sporządzanie krzywej wzorcowej. Do probówek odmierzyć w 2 powtórzeniach po 1 ml z 5 kolejnych roztworów wzorcowych białka (3), a do próby kontrolnej zamiast białka odmierzyć 1 ml wody. Do wszystkich probówek dodać po 5 ml odczynnika miedziowego (1), wymieszać i po 1 min dodać po,5 ml odczynnika Folina (2) i całość wymieszać. Po 2 min zmierzyć intensywność zabarwienia w fotometrze (przy 67 nm) nastawiając przyrząd na zero wobec próby kontrolnej. Na podstawie uzyskanych wartości absorbancji (A) wykreślić krzywą zaleŝności absorbancji od stęŝenia białka w próbie. Absorbancja StęŜenie białka [µg/ml] Rys. 1 Przykładowa krzywa wzorcowa opisująca zaleŝność absorbancji od stęŝenia białka. 2. Oznaczanie zawartości białka w badanym roztworze. Roztwór białka otrzymany w kolbce miarowej na 1 ml naleŝy dopełnić do kreski wodą destylowaną i dokładnie wymieszać. Do 2 probówek odmierzyć po 1 ml roztworu z kolbki, do 1 próbówki odmierzyć 1 ml H 2 O destylowanej (próba kontrolna) i dalej postępować jak przy sporządzaniu krzywej wzorcowej. Opracowanie wyników Studenci wykonują krzywą wzorcową na papierze milimetrowym lub korzystając z programu komputerowego, nanosząc na wykres średnią z 2 pomiarów dla kaŝdego stęŝenia białka. NiezaleŜnie w sprawozdaniu naleŝy podać odczyty absorbancji obu powtórzeń dla badanego roztworu białka oraz wyliczoną wartość średnią. Przy oznaczaniu zawartości białka naleŝy z wartości absorbancji odczytać na krzywej stęŝenie białka, a następnie na podstawie 4

5 proporcji w całej próbie obliczyć procentową zawartość białka w badanym materiale. Sposób przygotowania roztworu z tego materiału podany będzie przez prowadzącego ćwiczenia. Pytania 1. Wymienić cechy budowy białek, które są wykorzystywane przy ich ilościowym oznaczaniu. 2. Scharakteryzować zasady, na których opierają się poszczególne metody oznaczania zawartości białka. 3. Określić przydatność poszczególnych metod w ilościowym oznaczaniu białek. 4. Dlaczego przy oznaczaniu białka metodą spektrofotometryczną lub kolorymetryczną konieczne jest podanie rodzaju białka uŝytego do wyznaczania współczynników przeliczeniowych lub sporządzenia krzywej wzorcowej? 6. Obliczyć, jakiemu stęŝeniu związku odpowiada wartość absorbancji (A) =,1, jeŝeli molowy współczynnik absorbancji wynosi Dlaczego w metodach fotometrycznych dokładność oznaczenia zaleŝy między innymi od czystości padającej wiązki światła, jak się tę czystość osiąga? 8. Omów zasadę poznanej na ćwiczeniach metody ilościowego oznaczania zawartości białka. Jaką zaleŝność przedstawiała sporządzona na ćwiczeniach krzywa wzorcowa? 5