Politechnika Śląska Wydział Chemiczny Katedra Technologii Chemicznej Organicznej i Petrochemii INSTRUKCJA Metody analizy związków chemicznych: UPLC-MS
U/HPLC Wprowadzenie Chromatografia cieczowa, w swoich wielu postaciach, jest szeroko stosowana jako metoda preparatywna i analityczna. Służy ona do rozdziału mieszanin związków pomiędzy dwie nie mieszające się ze sobą fazy. Jedna z tych faz jest ciekłą fazą ruchomą, druga natomiast fazą nieruchomą (stacjonarną). Składniki próbki poruszają się w układzie chromatograficznym tylko wtedy, gdy znajdują się w fazie ruchomej. Składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy stacjonarnej poruszają się wolniej niż składniki, które mają większe powinowactwo do fazy ruchomej. Rozdział jest wynikiem różnic w szybkości migracji składników, który jest rezultatem różnic w podziale składników między dwie fazy. Faza stacjonarna, którą może być ciało stałe, jak np. silikażel, ciecz osadzona na nośniku, żywica jonowymienna, znajduje się w kolumnie wykonanej ze stali nierdzewnej, przez którą przepływa ciekła faza ruchoma. Ultra lub wysokosprawna chromatografia cieczowa (U/HPLC) ma szerokie zastosowanie, w szczególności służy do analizy związków mało lotnych lub nietrwałych termicznie. Główne dziedziny zastosowań chromatografii cieczowej to: chemia farmaceutyków, środków żywności, biochemia oraz chemia związków stosowanych w przemyśle ciężkim. Techniki w chromatografii cieczowej 1. Chromatografia ciecz-ciecz (podziałowa) W chromatografii ciecz-ciecz stosuje się ciekłe fazy stacjonarne, które albo osadzone są na drobnoziarnistym obojętnym nośniku, albo też są chemicznie związane z jego powierzchnią. Rozpuszczona w fazie ruchomej analizowana próbka ulega podziałowi pomiędzy fazą stacjonarną a fazą ruchomą. Stopień podziału pomiędzy obie fazy zależy od jej współczynnika podziału. W wyniku zróżnicowanych wartości współczynników podziału składników próbki i wynikających z tego ich różnych prędkości migracji wzdłuż kolumny, następuje rozdział mieszaniny. Istnieją dwa rodzaje technik chromatograficznych: normalna (NP z ang.normal phase) i z odwróconymi fazami (RP z ang.reversed phase). W normalnej chromatografii ciecz-ciecz, fazą stacjonarną jest polarna ciecz, np. glikol, natomiast fazą ruchomą jest stosunkowo mało polarna ciecz, np. heksan. Technika ta jest wykorzystywana do rozdzielania polarnych związków, które mają większe powinowactwo do polarnej fazy stacjonarnej. Jeżeli faza stacjonarna jest niepolarna, np. węglowodór alifatyczny przyłączony do stałego nośnika, to technikę tę określa się mianem chromatografii z odwróconymi fazami, które jest dominująca w UPLC i HPLC.
Ze względu na możliwość zastosowania różnorodnych faz stacjonarnych, chromatografia cieczciecz jest najbardziej uniwersalną techniką chromatografii cieczowej. Wykorzystuje się ją zarówno do rozdzielania związków polarnych, jak i niepolarnych. Podstawą rozdziału jest rodzaj i liczba obecnych w cząsteczce podstawników oraz różnice mas cząsteczkowych. 2. Chromatografia ciecz-ciało stałe (adsorpcyjna) W chromatografii ciecz-ciało stałe rozdział następuje pomiędzy ciekłą fazą ruchomą a stałą fazą ruchomą a stacjonarną, na której odwracalnie adsorbują się cząsteczki rozdzielanych substancji. Zaletą chromatografii ciecz-ciało stałe jest wysoki stopień selektywności, jaki można za pomocą tej techniki uzyskać np. rozdzielenie izomerów m- i p-dibromobenzenu. Metoda ta umożliwia rozdzielenie mieszanin na klasy związków mające te same grupy funkcyjne. Substancje różniące się tylko długością łańcucha alkilowego będą słabo rozdzielane. Technika ta jest stosowana do analiz związków niejonowych, o średniej masie cząsteczkowej od 200 do 2000 u, rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych. Daje ona dobre wyniki w analizach związków różniących się rodzajem i liczbą grup funkcyjnych, np. barwników, witamin, amin, fenoli, amidów, kwasów tłuszczowych, alkoholi. 3. Chromatografia jonitowa Chromatografia jonitowa jest pewną formą chromatografii adsorpcyjnej. Wymiana jonów polega na zastąpieniu jednego jonu jonem innego rodzaju. Faza stacjonarna składa się ze sztywnego podłoża, na którego powierzchni rozmieszczone są ładunki dodatnie, będące centrami jonowymiennymi. Podstawą rozdziału są różnice w sile oddziaływań międzycząsteczkowych pomiędzy jonami próbki a centrami wymiany. Chromatografia jonitowa stosowana jest przede wszystkim w analizach związków zjonizowanych lub ulegających jonizacji. Jej główną dziedziną zastosowań jest biochemia. 4. Chromatografia żelowa (sączenie molekularne, GPC z ang. Gel Permeation Chromatography albo SEC- z ang.sizeexclusinchromatography) Rozdział substancji w tej technice następuje w zależności od wielkości i kształtu ich cząsteczek. Większe cząsteczki migrują przez kolumnę szybciej niż mniejsze i są eluowane jako pierwsze. Wynika to z faktu, że cząsteczki o rozmiarach odpowiadających rozmiarom porów fazy stacjonarnej dyfundują w głąb ziaren żelu. W chromatografii żelowej stosuje się różnego rodzaju żele jako fazy stacjonarne np. dekstranowe, silikażele, agarozowe, polistyrenowo - diwinylobenzenowe (PS-DVB).
Chromatografia żelowa stosowana jest głównie do analiz związków o dużych masach cząsteczkowych (>2000 u). Za pomocą tej techniki można analizować polimery organiczne, biopolimery. Teoretyczne podstawy chromatografii Chromatograficzny rozdział składników mieszaniny następuje wskutek różnic w ich współczynnikach podziału (K) pomiędzy fazą ruchomą a stacjonarną: K = C s C m (1) gdzie: C s to równowagowe stężenie składnika w fazie stacjonarnej C m to równowagowestężenie składnika w fazie ruchomej Czas, jaki upływa między zadozowaniem próbki a pojawieniem się maksimum piku rozpatrywanego składnika próbki, nazywa się czasem retencji t R. Czas retencji jest funkcją prędkości fazy ruchomej i objętości eluentu potrzebnego do wymycia składnika z kolumny, tzw. objętości retencji (V R ), zdefiniowanej jako: V R =Ft R (2) gdzie: F to objętościowa prędkość przepływu fazy ruchomej Objętość fazy ruchomej (objętość martwa) w kolumnie wynosi: V m = Ft m (3) Podstawowe równanie dla chromatografii ma postać: gdzie: V m to objętość fazy ruchomej w kolumnie V R = V m + KV S (4) V S to objętość fazy stacjonarnej w kolumnie Ważnym parametrem w chromatografii jest współczynnik retencji:
k = n s n m = C s V s C m V m = K V s V m (5) gdzie: n s to liczba moli substancji rozpuszczonej w fazie stancjonarnej n m, to liczba moli substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej lub po przekształceniu, podstawiając do równania (5) równania (2), (3) i (4), otrzymuje się: k = t R t m t m (6) k współczynnik retencji (kiedyś współczynnik pojemnościowy): Miara siły oddziaływania danego związku z systemem chromatograficznym Określa jak długo dany związek przebywa w fazie stacjonarnej w porównaniu z fazą ruchomą k nie zależy od wielkości kolumny, szybkości przepływu fazy ruchomej Zależy od tzw. chemii : rodzaju fazy stacjonarnej, rodzaju fazy ruchomej, temperatury t m czas martwy czas przebywania związku inertnego na kolumnie Zależy od tzw. fizycznych, mechanicznych parametrów: długości, średnicy kolumny, gęstości upakowania fazy stacjonarnej, szybkości przepływu. Aparatura: Typowy schemat blokowy układu do chromatografii cieczowej U/HPLC wygląda następująco: 1 2 3 4 6 7 5 1 zbiornik, 2 pompa, 3 system dozowania próbek, 4 kolumna chromatograficzna, 6 detektor, 7 rejestrator (komputer)
U/HPLC/MS Spektrometr masowy (MS) w sprzężeniu z chromatografią cieczową znajdują szerokie zastosowanie w szerokim zakresie badań, np. chemii organicznej, chemii analitycznej, biochemii, farmacji, diagnostyki medycznej, ochronie środowiska, geochemii, mineralogii, geochronologii. Mogą być zastosowane np. do pomiaru wieku skał i szkieletów, identyfikacji zakazanych farmaceutyków zażywanych przez sportowców, do oznaczania ilościowego śladowych składników w półprzewodnikach, do pomiaru mas białek. Połączenie chromatografii ze spektrometrią mas jest ważne w chemii analitycznej ze względu na uzupełniające się cechy obu technik. Sprzężenie chromatografii ze spektrometrią mas dostarcza bardzo skutecznego narzędzia do jakościowej, jak i również ilościowej charakterystyki złożonych mieszanin przez wykorzystanie najpierw zdolności rozdzielczej chromatografii w celu otrzymania czystych składników, a następnie zdolności spektrometrii mas do identyfikacji rozdzielonych związków. Problemem przy połączeniu chromatografu cieczowego i spektrometru mas (LC/MS) jest to, że wylot chromatografu znajduje się pod ciśnieniem atmosferycznym, podczas gdy źródła jonów typowych spektrometrów mas działają pod niskim ciśnieniem. Powoduje to, że wprowadzenie wycieku z chromatografu do spektrometru mas musi być na ogół połączone z jednoczesnym usuwaniem większości eluentu. Substancja rozpuszczona wychodząca z cieczowej kolumny chromatograficznej jest bardzo rozcieńczona. Przepływ wody 1 mlmin -1 odpowiada w przybliżeniu 1250 mlmin -1 par. Nadmiar eluatu nie tylko tworzyłby nie tylko niepożądane tło w widmie masowym, lecz także utrudniałoby utrzymanie odpowiedniej próżni w spektrometrze masowym.w eluacie występować mogą również nielotne związki nieorganiczne, np. w przypadku stosowania buforów. Ponadto, jeśli w chromatografii cieczowej stosuje się elucję gradientową, to skład rozpuszczalnika zmienia się podczas analizy. Z tych względów trudności techniczne wynikające z połączenia (interfejsowania) chromatografii cieczowej i spektrometrii mas przewyższają te dla połączenia GC/MS. Mimo to LC/MS jest metodą o potencjalnie większych możliwościach zastosowania niż GC/MS. Chromatografia cieczowa jest odpowiednią techniką dla dużych, polarnych, jonowych, termicznie nietrwałych i nielotnych związków. Spektrometr masowy można zmierzyć masę cząsteczki dopiero przekształca cząsteczki z jonów w fazie gazowej. Aby to zrobić, to przekazuje ładunek elektryczny do cząsteczek i przetwarza strumień wynikowy jonów naładowanych na proporcjonalny prąd elektryczny, który następnie odczytuje dane systemu. System danych konwertuje prąd do informacji cyfrowej, wyświetlając je jako widmo masowe.
MS Na widmie MS mogą pojawiają się charakterystyczne sygnały w postaci pików. Wyróżnia się pik o największej intensywności, tzw. pik podstawowy. Względem tego piku oznacza się abundancję względną pozostałych sygnałów. Ponadto, wyróżnia się szereg typów pików: molekularny pik odpowiedzialny za masę analizowanego związku. U podstaw jego otrzymania leży wybicie elektronu z cząsteczki. Masa elektronu jest znikoma i nierozpatrywana. pseudomolekularny pik jonu, który otrzymuje się w momencie przyłączenia się lub ubytku w analizowanym związku cząsteczki niosącej ładunek, np. protonu. fragmentacyjny pik posiadający masę mniejszą niż pik molekularny czy pseudomolekularny, powstający na wskutek ich rozpadu dzięki nadmiarowi energii dostarczonemu w toku jonizacji izotopowy pik, którego występowanie uwarunkowane jest obecnością izotopów pierwiastków. Wykorzystuje się te piki do ustalania wzoru sumarycznego nieznanych substancji. Obecność opisanych powyżej typów sygnałów zależna jest nie tylko od samej budowy analitu, ale przede wszystkim od rodzaju źródła jonizacji. Co za tym bezpośrednio idzie sposobu i ilości dostarczonej energii w samym procesie. Wybrane metody jonizacji próbki Tabela 1. Czynniki wywołujące jonizację Czynnik Elektrony Reakcje jonów Pola elektryczne Pola elektryczne w połączeniu z rozpylaniem Szybko poruszające się atomy Szybko poruszające się jony Fotony Produkty rozszczepienia jądrowego Przykład metody jonizacji EI (jonizacja elektronami) CI (jonizacja chemiczna), APCI (jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym) FI (jonizacja polem), FD (desorpcja polem), EHI (jonizacja elektrohydrodynamiczna) Termosprej, elektrosprej FAB (bombardowanie szybkimi atomami) SIMS (spektrometria mas jonów wtórnych) Desorpcja laserowa, MPI Desorpcja plazmowa
Jonizacja elektronami (EI z ang. Elektron Impact Ionization) Jest to pierwsza z metoda jonizacji stosowanych w spektrometrii masowej. Metodę tę można stosować jedynie dla substancji wykazujących pewną minimalną lotność w temperaturze, w której są one jeszcze stabilne. Elektrony energetyczne z rozgrzanego filamentu (włókna żarowego) przyspieszane są w polu elektrycznym i przechodzą przez komorę jonową o małej objętości, która zawiera próbkę gazową. Taki elektron ora cząsteczka (M) z odparowanej próbki reagują ze sobą, jeśli znajdą się dostatecznie blisko, aby elektron mógł przekazać wystarczającą ilość swojej energii cząsteczce obojętnej, co może spowodować oderwanie elektronu z cząsteczki i utworzenie jonu molekularnego: M + e - -> M +* + 2e - Nadmiar energii przekazany cząsteczce jest wykorzystywany na zrywanie wiązań, dzięki czemu powstają piki pochodzące od jonów molekularnych, w zależności od struktury chemicznej związku. Jonizacja chemiczna (CI z ang. Chemical Ionization) W metodzie jonizacji chemicznej wykorzystuje się tzw. jony pierwotne, powstające w wyniku bombardowania elektronami cząsteczek gazu reagującego. Gazem reagującym jest najczęściej metan, izobutan, amoniak, woda lub gazy szlachetne. Należy do metod łagodnej jonizacji, ponieważ przyspieszone elektrony nie ulegają bezpośredniej kolizji z cząsteczką analitu, a z gazem (metanem) wypełniającym komorę jonizatora. Następnie cząsteczki metanu oddają energię na badany związek powodując jego wtórną jonizację. Otrzymuje się jony pseudomolekularne poprzez addycję elektrofilową. Metodę tą charakteryzuje mniejszy stopień fragmentacji niż w przypadku EI. Aparatura: Typowy schemat blokowy spektrometru mas wygląda następująco: 1 2 3 4 5 1 układ wprowadzający próbkę, 2 źródło jonów, 3 analizator (rozdział jonów), 4 detektor, 5 rejestrator (komputer)
Przygotowano na podstawie: 1. R. A. W. Johnstone, M. E. Rose, Spektrometria mas, PWN, Warszawa 2001 2. Metod spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych. WNT, Warszawa, 1995