ZASTOSOWANIA SPEKTROMETRII MAS W CHEMII ORGANICZNEJ I BIOCHEMII

Transkrypt

1 ZASTOSOWANIA SPEKTROMETRII MAS W CHEMII ORGANICZNEJ I BIOCHEMII WYKŁAD I PODSTAWY SPEKTROMETRII MAS Prof. dr hab. Witold Danikiewicz Instytut Chemii Organicznej PAN Warszawa

2 ZAKRESY PROMIENIOWANIA ELEKTROMAGNETYCZNEGO, WYKORZYSTYWANEGO WNAJWAŻNIEJSZYCH METODACH SPEKTRALNYCH Hz fale radiowe mikrofale IR VIS UV X γ NMR IR UV-VIS Rtg m

3 WIDMO EI KWASU OCTOWEGO Jony fragmentacyjne O Intensywność względna C H 3 C O M = 60 H Jon molekularny m/z

4 Abundance WIDMO EI CHOLESTEROLU #229209: Cholest-5-en-3-ol (3.beta.)- (CAS) $$ Lanol $$ Dyth HO m/z-->

5 DWA SPOSOBY PREZENTACJI WIDM MASOWYCH raw data centroid Intensity (%age) Intensity (%age) Low Resolution M/z Low Resolution M/z widmo nieprzetworzone (raw data spectrum) widmo po procedurze centroidowania (centroid spectrum)

6 PYTANIA, NA KTÓRE MOŻE ODPOWIEDZIEĆ SPEKTROMETRIA MAS 1. Jaka jest masa cząsteczkowa związku? Metody: widmo EI 70 ev i np. 12 ev lub łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, MALDI) w celu otrzymania jonu molekularnego. 2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych, badanie profilu izotopowego. 3. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI, badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej, dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych, wymiana izotopowa, otrzymywanie i badanie pochodnych. Identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm. 4. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów, stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego lub braku zgodności widm (+) i (-). 5. Jaki jest skład mieszaniny związków? Metody: chromatografia gazowa lub cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS, LC/MS) analiza jakościowa i ilościowa.

7 H, 2 DOKŁADNE MASY ATOMOWE I SKŁADY IZOTOPOWE NAJLŻEJSZYCH PIERWIASTKÓW , , He, , , Li, , , Be, , B, , , C, , , N, , , O, , , , F, , Ne, , , , 8.82 Na, , Mg, , , , Al, , Si, , , , 3.12 P, , S, , , , , Cl, , , 24.6

8 PROFILE IZOTOPOWE JONÓW W FUNKCJI ICH MASY C 3 H 7 NO 2 C 6 H 12 N 2 O 3 C 15 H 33 N 5 O 9 C 30 H 68 N 10 O 19 C 60 H 138 N 20 O 39 C 150 H 348 N 50 O Masa nominalna Masa monoizotopowa Masa średnia

9 Przykład widma związku cynoorganicznego

10 SCHEMAT BLOKOWY SPEKTROMETRU MAS Analizator masy Źródło jonów Detektor Komputer Układ wprowadzania próbki Rejestracja i przetwarzanie wyników

11 ŚREDNIA DROGA SWOBODNA CZĄSTKI W GAZIE L [ cm] P [ mmhg] P [mmhg] L mm mm mm mm cm cm m m m

12 WPROWADZANIE PRÓBEK DO SPEKTROMETRU MASOWEGO Ciśnienie atmosferyczne Ciało stałe lotne Ciało stałe nielotne Ciecz czysta lotna Ciecz czysta nielotna Roztwór niezjonizowany Źródło jonów Jony Wysoka próżnia ( < 10-5 mm Hg) Analizator masy Roztwór zjonizowany Gaz

13 ANALIZATORY MASY STOSOWANE W SPEKTROMETRII MAS Analizator magnetyczny (magnet analyser, B) Analizator magnetyczny + analizator elektryczny i analizator elektryczny + analizator magnetyczny (BE i EB) Analizator kwadrupolowy (Quadrupole analyser, Q) Pułapka jonowa (Ion Trap lub Quadrupole Ion Trap, IT lub QIT) Analizator czasu przelotu (Time of Flight analyser, TOF) Jonowy rezonans cyklotronowy (Ion Cyclotron Resonance, ICR)

14 ANALIZATOR MAGNETYCZNY Elektromagnes r Źródło jonów Detektor V r = m z 2V eb 2 M W AMD 604: B = 1.7 T, r = 60 cm, V = 8000 V M max = 6000 u B r = W analizatorze magnetycznym V promień toru jonu zależy zarówno od jego masy (ściślej: m/z), jak i energii

15 SPEKTROMETR O PODWÓJNYM OGNISKOWANIU I GEOMETRII BE Analizator magnetyczny Szczelina pośrednia Analizator elektryczny Komory zderzeń Szczelina wyjściowa Źródło jonów Szczelina wejściowa Powielacz elektronów

16 SPEKTROMETR MAS TYPU AMD 604

17 ANALIZATOR KWADRUPOLOWY

18 wiązka światła lasera V Próbka na blaszce stalowej Spektrometr MALDI TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight) Laser wiązka jonów droga wiązki jonów = l Detektor Zależność czasu przelotu jonu od jego masy t = l v ev = mv = 2 l 2eV m 2 m = = v = 2eV 2 l t l 2eV 2 2eV m m Znaczenie symboli: m masa jonu (kg) e ładunek elementarny (C) V napięcie przyspieszające (V) v prędkość liniowa jonu (m/s) t czas przelotu jonu (s) l droga wiązki jonów (m)

19 Schemat spektrometru czasu przelotu (TOF) z reflektorem jonów źródło jonów elementy ogniskujące reflektor jonów detektor

20 SCHEMAT SPEKTROMETRU MASOWEGO Z ORTOGONALNYM ANALIZATOREM CZASU PRZELOTU SPEKTROMETR GCT FIRMY MICROMASS

21 PODSTAWOWE METODY JONIZACJI STOSOWANE W SPEKTROMETRII MAS Jonizacja elektronowa (Electron Ionization, EI) Jonizacja chemiczna (Chemical Ionization, CI) Bombardowanie szybkimi atomami (Fast Atom Bombardment, FAB) oraz bombardowanie szybkimi jonami (Fast Ion Bombardment, FIB). Obie metody (chociaż druga częściej) określane są też mianem spektrometrii jonów wtórnych w ciekłej matrycy (Liquid Matrix Secondary Ion Mass Spectrometry, LSIMS) Jonizacja polem (Field Ionization, FI) i desorpcja polem (Field Desorption, FD) Termosprej (Thermospray, TS lub Thermospray Ionization, TSI) Elektrosprej, elektrorozpylanie (Electrospray, ES lub Electrospray Ionization, ESI) Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (Atmosferic Pressure Chemical Ionization, APCI) Desorpcja promieniowaniem laserowym z użyciem matrycy (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI) Jonizacja plazmą wzbudzaną indukcyjnie (Inductively Coupled Plasma Ionization, ICP)

22 ŹRÓDŁO JONÓW DO EI I CI miejsce wprowadzania próbki (prostopadle do płaszczyzny rysunku) elektroda odpychająca katoda + obudowa komory jonizacyjnej (U A = 8000 V) magnes N S - magnes - soczewki ogniskujące elektroda przyspieszająca (U = 0 V) szczelina wejściowa wiązka jonów (do analizatora) E = zeu A Czas przebywania próbki w źródle jonów: ok s

23 ŹRÓDŁO JONÓW W SPEKTROMETRZE AMD 604

24 ŹRÓDŁO JONÓW W SPEKTROMETRZE AMD 604

25 SONDA DO WPROWADZANIA BEZPOŚREDNIEGO ogrzewanie i pomiar temperatury obudowa pręt szlifowany końcówka chłodzenie wodne lub powietrzne probówka (aluminiowa lub kwarcowa)

26 SONDA DO WPROWADZANIA BEZPOŚREDNIEGO

27 Abundance WIDMO EI CHOLESTEROLU #229209: Cholest-5-en-3-ol (3.beta.)- (CAS) $$ Lanol $$ Dyth HO m/z-->

28 ELECTROSPRAY (ESI)

29 John B. Fenn ur r. Nobel 2002

30 Nobel 2002 M. Mann, S. Shen i J. B. Fenn Electrospray Mass Spectrometry w: Mass Spectrometry in the Biological Sciences: A Tutorial, Ed. M. L. Gross, Kluver Academic Publishers, Dordrecht 1992.

31 MECHANIZM PRZECHODZENIA JONÓW DO FAZY GAZOWEJ W TECHNICE ELECTROSPRAY ETAP 1 Tworzenie aerozolu podczas wypływu cieczy z kapilary w polu elektrycznym kapilara gaz rozpylający

32 MECHANIZM PRZECHODZENIA JONÓW DO FAZY GAZOWEJ W TECHNICE ELECTROSPRAY ETAP 2 (powtarza się wielokrotnie) Odparowanie rozpuszczalnika z kropli i jej rozerwanie ( eksplozja kulombowska ) po przekroczeniu bariery Raleigha odparowanie rozpuszczalnika "eksplozja kulombowska" po przekroczeniu bariery Raleigha

33 MECHANIZM PRZECHODZENIA JONÓW DO FAZY GAZOWEJ W TECHNICE ELECTROSPRAY ETAP 3 Desorpcja jonu z kropli do fazy gazowej w wyniku działania pola elektrycznego (średnica kropli ok. 10 nm) desorpcja jonu w wyniku działania pola elektrycznego

34 SCHEMAT ŹRÓDŁA JONÓW ELECTROSPRAY W SPEKTROMETRZE API 365 Ciśnienie atmosferyczne Dysza Płytka osłonowa Zbierak Pierścień Q Kapilara stalowa ~ 2 Torr 8 x 10-3 Torr Tworzenie się jonów Pompa wstępna Pompa turbomolekularna Gaz osłonowy (N 2 )

35 Widma EI i ESI nadkaprylanu metylu EI 70 ev % Intensity [M O 2 CH 3 ] M = 174 O O O CH M/z M+Na + ESI w MeOH M+H % Intensity M+Na Mass (m/z)

36 WIDMO ESI ZWIĄZKU O MAŁEJ CZĄSTECZCE (MeOH, jony dodatnie) Spec #1[BP = 817.4, 2132] 2M + Na Ph O 80 N O Ph % Intensity M + H + M + Na OH M = 397 O M + K Mass (m/z)

37 Widma ESI w trybie jonów dodatnich i ujemnych pochodnej binaftylu o masie 344 u, zawierającej grupy OH i COOH % Intensity F? ? F 279.1? F? Spec #1[BP = 201.0, 724] F Mass (m/z) ESI (+) [2M + Na + ] COOH (OH) (OH) m n Spec #1[BP = 343.1, 2675] [M H + ] ESI (-) 2675 % Intensity Mass (m/z)

38 JONIZACJA CHEMICZNA POD CIŚNIENIEM ATMOSFERYCZNYM (APCI)

39 Cechy charakterystyczne metod ESI i APCI zakres mas (do 2000 dla APCI) związki polarne (ESI) i niepolarne (APCI) wprowadzane w roztworach lotnych rozpuszczalników współpraca z analizatorami magnetycznymi, kwadrupolowymi, pułapkami jonowymi i TOF: możliwość badania fragmentacji wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych oraz wykonywania dokładnych pomiarów masy możliwość bezpośredniej współpracy z HPLC mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki

40 MALDI - TOF

41 Koichi Tanaka ur r. Nobel 2002

42 Spektrometr MALDI TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight) wiązka światła lasera V Laser wiązka jonów droga wiązki jonów = l Detektor Zależność czasu przelotu jonu od jego masy t = l v ev = mv = 2 l 2eV m 2 m = = v = 2eV 2 l l 2eV t 2eV m 2 m Próbka na blaszce stalowej Znaczenie symboli: m masa jonu (kg) e ładunek elementarny (C) V napięcie przyspieszające (V) v prędkość liniowa jonu (m/s) t czas przelotu jonu (s) l droga wiązki jonów (m)

43 Mechanizm jonizacji w technice MALDI Impuls laserowy trafia w powierzchnię próbki (a) przekazując jej energię, która powoduje stopienie i odparowanie cząsteczek obojętnych i jonów z małego obszaru próbki (b). Po kilku nanosekundach cząsteczki obojętne zostają odpompowane, a cząstki naładowane (jony) są wciągane polem elektrycznym do analizatora spektrometru masowego (c).

44 Matryce stosowane w technice MALDI

45 Widmo MALDI-TOF β-galaktozydazy M+H Da

46 Widmo MALDI-TOF białka (M = Da)

47 Widma ESI i MALDI polistyrenu z dodatkiem CF 3 COOAg ESI MALDI

48 Cechy charakterystyczne metody MALDI zakres mas związki polarne, stałe lub nielotne ciecze mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki MALDI współpracuje praktycznie tylko z analizatorami TOF metody badania fragmentacji ciągle wymagają dopracowania możliwość pełnej automatyzacji wprowadzania próbek i rejestrowania widm