1.Wstęp. Ćwiczenie nr 9 Zatężanie z wody związków organicznych techniką SPE (solid phase extraction)

Transkrypt

1 1.Wstęp Ćwiczenie nr 9 Zatężanie z wody związków organicznych techniką SPE (solid phase extraction) W analizie mikrośladowych ilości związków organicznych w wodzie bardzo ważny jest etap wstępny, tj. etap prawidłowego przygotowania próbki przed dalszą analizą np. chromatograficzną. Wiąże się to z wyodrębnieniem mikroskładników z matrycy i ich zatężeniem aż do uzyskania stężenia wystarczającego do ich oznaczenia. Wśród wielu metod zatężania dużym zainteresowaniem cieszy się metoda wykorzystująca zjawisko adsorpcji na sorbentach stałych ze względu na szybkość i możliwość automatyzacji analizy, dokładność i odtwarzalność, a przy doborze odpowiedniego sorbentu selektywność. W ekstrakcji do ciała stałego, znanej powszechnie pod nazwą angielską solid phase extraction (SPE), wykorzystuje się proces adsorpcji związku (lub grupy związków) np. z matrycy wodnej do sorbentu, a następnie desorpcji oznaczanych związków do ekstrahentu, którym jest odpowiednio dobrany rozpuszczalnik organiczny. Sorpcja z wody jest dynamicznym procesem, który polega na przechodzeniu cząsteczek substancji organicznych z jednej fazy do drugiej. Substancje organiczne rozpuszczone w wodzie są rozdzielone pomiędzy wodę a sorbent zgodnie ze współczynnikiem podziału. W procesie adsorpcji odgrywają rolę dwa mechanizmy: sorpcja na powierzchni złoża i oddziaływanie oznaczanych związków (analitu) z wodą (matrycą). Mechanizm adsorpcji powierzchniowej jest zależny od oddziaływań pomiędzy analitem a aktywnymi centrami na powierzchni sorbentu. Oddziaływania jakie mogą między nimi zachodzić i odpowiadająca im energia przedstawiana jest w tabeli 1. Tabela 1. Energia oddziaływań zachodzących w procesie SPE Oddziaływania Energia [kj/mol] Dyspersyjne 5-20 Dipol - dipol indukowany 8-25 Dipol - dipol Wiązanie wodorowe Wiązanie jonowe Wiązanie kowalencyjne Im wyższa jest energia wyzwalana w procesie retencji, tym trudniejsze jest wymywanie (elucja) analitów. Dobranie właściwego sorbentu polega na znalezieniu kompromisu pomiędzy retencją a elucją. W praktyce wybór sorbentu można oprzeć na zasadzie podobne

2 sorbuje podobne. Jednakże w procesie SPE występują nie tylko oddziaływania pomiędzy analitem a sorbentem. Wzajemne oddziaływania zachodzą również pomiędzy pozostałymi składnikami matrycy, wodą i sorbentem. Rysunek 1 przedstawia system wzajemnych oddziaływań zachodzących w procesie SPE. Rysunek 1. Schemat oddziaływań w układzie ciało stałe matryca próbki wodnej S sorbent, A - analit, W - woda, SM - składnik matrycy Wysoką wydajność sorpcji można osiągnąć w przypadku występowania silnych oddziaływań w układzie analit sorbent, przy równocześnie słabych oddziaływaniach w układach analit woda i sorbent woda. Wydajność sorpcji można zwiększyć poprzez zmniejszenie oddziaływań analit woda, stosując np. efekt wysalania, co w praktyce wiąże się z dodaniem obojętnych elektrolitów (NaCl, KCl). Wysokie stężenie składników matrycy (konkurujących z analitem w procesie sorpcji) może być przyczyną przekroczenia pojemności złoża. W takim przypadku należy użyć więcej złoża lub zastosować złoże selektywne, na którym zostaną zaadsorbowane tylko substancje oznaczane. Charakterystycznym parametrem w SPE jest pojemność złoża, związana ze zdolnością sorbowania składników próbki. Pojemność złoża to maksymalna, możliwa w danych warunkach ilość substancji, jaka może ulec sorpcji na stałym sorbencie. Pojemność złoża zależy od ilości aktywnych centrów na powierzchni, a więc od typu sorbentu oraz od właściwości sorbowanych substancji, tj. od charakteru chemicznego i wielkości cząsteczki. Równanie 1 przedstawia wzór, pozwalający wyznaczyć pojemność sorbentu. q C C V 0 M e (1) q - pojemność sorpcyjna złoża [mg/g], C 0 - stężenie początkowe składnika próbki [mg/l],

3 C e - stężenie równowagowe [mg/l], V - objętość próbki [l], M masa złoża [g]. Orientacyjnie przyjmuje się, że pojemność sorpcyjna złoża wynosi od 1 do 5 % masy sorbentu, w zależności od mechanizmu procesu ekstrakcji. Na ogół stężenia substancji występujących w próbkach środowiskowych są na poziomie od ng/l do µg/l. Zakładając stały przepływ przez kolumnę SPE rozpuszczalnika o stałym stężeniu zawartych w nim oznaczanych substancji można, podobnie jak w procesie chromatograficznym, wyznaczyć krzywe elucji. Pozwala to na określenie objętości przebicia kolumny. Powierzchnia adsorbentu wysyca się cząsteczkami zatężanej substancji aż na złożu nie może zatrzymać się już więcej badanej substancji. Po przebiciu kolumny dalsze przepuszczanie roztworu powoduje wzrost stężenia analitu w wycieku aż do osiągnięcia stężenia substancji w wyjściowym roztworze. Na rysunku 2 pokazano krzywą przebicia złoża. Rysunek 2. Krzywa przebicia kolumny SPE Krzywa przebicia złoża ma kształt całki krzywej Gaussa. Objętość przebicia złoża można przedstawić równaniem 2: V B objętość przebicia, V R objętość retencji, V odchylenie standardowe. V V 2 (2) B R V

4 Objętość retencji analitu V R można wyznaczyć graficznie (zgodnie z rysunkiem 2) lub analitycznie z równania 3: V V 1 k (3) R o V o objętość martwa, k współczynnik retencji. Współczynnik retencji k jest definiowany jako stosunek liczby moli substancji sorbowanej na złożu kolumny do liczby moli substancji znajdującej się w fazie ruchomej. Wartość V można wyznaczyć z zależności (4): V Vo 1 1 k (4) 2 N N liczba półek teoretycznych. Przyjmuje się, że minimalna sprawność złoża kolumny do SPE wynosi około 11 półek teoretycznych. Z powyższych równań wynika, że proces ekstrakcji zależy od wartości k, związanej z właściwościami sorpcyjnymi złoża kolumienki oraz czynnikami geometrycznymi, tj. rozmiarami, kształtem i wielkością ziaren sorbentu. Dla danego układu sorpcyjnego objętość przebicia można regulować zmieniając rozmiary złoża kolumienki. Jednak wzrost masy złoża nie zawsze jest zjawiskiem korzystnym. Bardzo ważnym parametrem w technice SPE jest współczynnik wzbogacenia (zatężenia). Można go wyrazić za pomocą równania (5): f f współczynnik zatężenia, Vp V R (5) V p objętość próbki przepuszczonej przez kolumnę, d V d objętość rozpuszczalnika użytego do desorpcji, R odzysk, R= m w /m 0 (m w -ilość substancji wyekstrahowanej, m 0 ilość substancji przepuszczonej przez kolumnę) Odzysk R można określić jako stosunek ilości substancji wyekstrahowanej do ilości przepuszczonej przez kolumnę. Nie zawsze dana kolumienka pozwala na pełne odzyskiwanie

5 zaadsorbowanych substancji, ale też w metodzie SPE nie jest to problem najważniejszy. Ważne, aby wyznaczyć R, im bliższy jest 1, tym oczywiście korzystniej. Na rysunku 3 przedstawiono zasadę ekstrakcji do ciała stałego. Istota zatężania w procesie SPE polega na przeprowadzeniu związków z dużej objętości matrycy (wody) do znacznie mniejszej objętości eluatu (rozpuszczalnika organicznego) V p V d W woda, A analit, R rozpuszczalnik 1 spieki polipropylenowe, 2 wypełnienie kolumienki (sorbent) Rysunek 3. Zasada ekstrakcji w SPE Praca z kolumienką SPE składa się na z kilku etapów, są to: aktywacja złoża, kondycjonowanie, zatężanie (dozowanie próbki), usuwanie zanieczyszczeń i wody, wymywanie (elucja). Aktywacja złoża Aktywacja złoża wykonywana jest w celu zapewnienia maksymalnego kontaktu fazy ciekłej ze stałą. Hydrofobowe sorbenty nie są zwilżane przez wodę, co mogłoby spowodować słabsze odzyski i brak powtarzalności wyników. Aby temu zapobiec stosuje się rozpuszczalniki mniej polarne i przemywa kilkakrotnie nimi złoże.

6 Kondycjonowanie złoża W procesie kondycjonowania usuwa się pozostały rozpuszczalnik po aktywacji, przepuszczając przez złoże wodę specjalnej czystości (pozbawioną zanieczyszczeń organicznych), przygotowując w ten sposób złoże na przyjęcie zatężanych substancji z próbki wodnej. Dozowanie próbki Przy przygotowywaniu złoża do przyjęcia próbki, czyli przy kondycjonowaniu złoża należy zwrócić uwagę, aby złoże nie zostało wysuszone. Dozowanie próbki powinno odbywać się z tak dobraną prędkością przepływu, aby zapewnić odpowiedni czas kontaktu próbki z sorbentem. Objętość próbki natomiast powinna być tak dobrana, aby nie nastąpiło przebicie złoża. Usuwanie zanieczyszczeń i wody Po przepuszczeniu próbki, w celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogłyby przeszkadzać w oznaczeniu badanych substancji, zaleca się płukanie złoża wodą specjalnej czystości lub wodą zmieszaną z rozpuszczalnikiem. Następnie złoże należy dobrze osuszyć, aby ułatwić proces desorpcji. Woda może być usuwana np. pod ciśnieniem strumieniem powietrza, strumieniem azotu, poprzez odwirowanie lub przechowywanie kolumienki w eksykatorze Wymywanie (elucja) Proces desorpcji polega na wymywaniu zaadsorbowanych substancji ze złoża odpowiednio dobranym rozpuszczalnikiem, ewentualnym jego zatężeniu a następnie dalszej analizie np. chromatograficznej. Dobór odpowiedniego eluentu jest bardzo istotny. Siła adsorpcji cząsteczek eluentu powinna znacznie przewyższać oddziaływania występujące między substancją oznaczaną i powierzchnią adsorbentu. Efektywność wymywania zaadsorbowanej substancji z powierzchni sorbentu określa się pojęciem mocy elucyjnej rozpuszczalnika E 0. Szereg eluotropowy to doświadczalnie ustalona kolejność rozpuszczalników ułożonych zgodnie ze wzrostem mocy elucyjnej E 0. Przyjmuje się umownie, że E 0 ma wartość zerową dla tlenku glinu, gdy rozpuszczalnikiem jest n-pentan. W tabeli 2 przedstawiono moc eluotropową najczęściej stosowanych rozpuszczalników. Podane wartości dotyczące E 0 uzyskano na żelu krzemionkowym. Następstwo rozpuszczalników w szeregu jest takie, iż adsorpcja z rozpuszczalników leżących na początku szeregu jest największa. Im eluent jest bliżej końca szeregu, tym większa jest jego moc elucyjna. Szereg eluotropowy na modyfikowanych krzemionkach jest odwrotny - moc elucyjna rozpuszczalników z początku szeregu będzie większa (moc elucyjna dla modyfikowanej krzemionki jest zaznaczona na czerwono)

7 Tabela 2. Moc elucyjna (eluotropowa) najczęściej stosowanych rozpuszczalników Rozpuszczalnik E 0 Miesza się z wodą Polarność Heksan 0.00 nie niepolarny Izooktan 0.01 nie Tetrachlorek węgla 0.11 nie Chloroform 0.26 nie Chlorek metylu 0.32 nie Tetrahydrofuran 0.35 tak Eter etylowy 0.38 nie Octan etylu 0.38 słabo Aceton 0.47 tak Dioksan-1, tak Acetonitryl 0.50 tak Izopropanol 0.63 tak Metanol 0.73 tak Woda >0.73 tak Kwas octowy >0.73 tak polarny Wybór rozpuszczalnika pełniącego rolę eluentu określony jest zależnością między E 0 oraz polarnością oznaczanej substancji. Do usuwania zaadsorbowanych silnie i średnio polarnych związków z polarnych sorbentów (np. SiO 2 ) zaleca się stosowanie metanolu ze względu na jego dużą moc eluotropową ( E 0 = 0.73). Natomiast do elucji substancji niepolarnych z powierzchni sorbentów niepolarnych (np. krzemionka modyfikowana grupami n-alkilowymi) może służyć chlorek metylenu ( E 0 = 0.32).Moc elucyjną rozpuszczalnika można regulować poprzez sporządzanie odpowiednich mieszanin. Zmianę wartości E 0 od 0 do 0.73 osiąga się przez tworzenie odpowiednich mieszanin binarnych rozpuszczalników, zwykle heksanu, chlorku metylenu, eteru etylowego, acetonitrylu i metanolu. Binarne mieszaniny o wartości E 0 większej od 0.6 są na ogół używane jako rozpuszczalniki substancji niepolarnych do ich sorpcji na niepolarnych złożach, takich jak żele krzemionkowe zmodyfikowane okta- lub oktadecylosilanem.

8 Sorbenty stosowane w SPE: Do zatężania zanieczyszczeń z wody stosuje się głównie następujące typy sorbentów : sorbenty węglowe, sorbenty polimeryczne, jonity, sorbenty zawierające metale, fazy chemicznie związane. Najczęściej używane są krzemionki modyfikowane grupami alkilowymi i arylowymi. Istotnymi cechami chemicznie modyfikowanych żeli krzemionkowych jest ich duża pojemność sorpcyjna, duża szybkość ustalania się równowagi sorpcyjnej, wytrzymałość mechaniczna, łatwość desorpcji wielu związków małymi objętościami rozpuszczalników. Chemicznie związane fazy organiczne zmieniają polarność krzemionki. Dzięki temu fazy chemicznie związane mogą być używane do zatężania zarówno związków polarnych jak i niepolarnych. Do najczęściej używanych faz niepolarnych (hydrofobowych) należą fazy oktylowa i oktadecylowa. 2. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką przygotowania próbki do analizy metodą zatężania do ciała stałego, wyznaczenie odzysku oraz współczynnika zatężenia. 3. Przebieg ćwiczenia Student wykonuje zatężenie techniką SPE związków organicznych z wodnej próbki przygotowanej przez prowadzącego o objętości 100 ml Woda preparowana izomerami DDT (Rysunek 4) C14H 9Cl5 ciężar czasteczkowy: ,1,1-trichloro-2,2-bis-(4-chlorofenylo)etan op'ddt, pp'ddt p DDT

9 pp DDT Rysunek 4. Wzory chemiczne zatężanych związków Wykonanie zatężenia próbek techniką SPE z wykorzystaniem systemu do ekstrakcji SPE i kolumienek typu SPE-500, C18 o objętości złoża 500 mg, modyfikowana krzemionka fazą oktadecylową (Rysunek 5) Rysunek 5. Sprzęt stosowany w ćwiczeniu 1. Kondycjonowanie kolumienki o objętości złoża 500mg: Dwukrotnie po 3 ml MeOH (Metanol specjalnej czystości) Dwukrotnie po 3 ml wodą specjalnej czystości (woda z Millipora) Uwaga: nie dopuścić do wysuszenia złoża 2. Przepuścić przez złoże próbkę badaną z prędkością nie większą niż 5 ml/min. (500 ml preparowanej próbki wody, przygotowana przez prowadzącego) 3. Przepłukać kolumienkę ok. 3 ml czystej wody 4. Osuszyć kolumienkę powietrzem (pod ciśnieniem ok min), wodę po przejściu przez kolumienkę usunąć z urządzenia systemu SPE, wstawić mianowane naczyńka szklane, przeznaczone do zbierania eluatu)

10 5. Wymyć ekstrakt z kolumienki 2x1 ml mieszaniną binarną eter/heksan (1:1) (czystości chromatograficznej) 6. Odparować powietrzem rozpuszczalnik do objętości 1ml (wykonać to wykorzystując urządzenie systemu SPE) 7. Analiza GC/ECD (przy pomocy prowadzącego) 4. Zadania obliczeniowe dla studenta Po uzyskaniu danych od prowadzącego Obliczyć odzysk oraz wyznaczyć współczynnik zatężenia, Obliczyć stężenie pestycydów (potrzebne dane dotyczące wzorców oraz próbki student uzyskuje od prowadzącego)