Ćwiczenie 1 Analiza jakościowa w chromatografii gazowej Wstęp

Transkrypt

1 Pracownia dyplomowa III rok Ochrona Środowiska Licencjat (OŚI) Ćwiczenie 1 Analiza jakościowa w chromatografii gazowej Wstęp Chromatografia jest metodą fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazą ruchomą (poruszającą się w określonym kierunku) a fazą nieruchomą (stacjonarną) układu chromatograficznego. Różny podział składników mieszaniny pomiędzy obie fazy powoduje zróżnicowanie prędkości migracji i rozdzielenie składników (Rys. 1). Rys. 1. Mechanizm procesu chromatograficznego. Substancje i charakteryzują się zróżnicowanymi współczynnikami retencji k. Faza ruchoma porusza się wewnątrz kolumny, natomiast faza stacjonarna stanowi wypełnienie kolumny lub jest osadzona na wewnętrznych ściankach kolumny. W chromatografii gazowej (GC - gas chromatography) fazą ruchomą jest gaz; fazą stacjonarną może być: ciało stałe: adsorbent, wtedy mamy do czynienia z chromatografią adsorpcyjną (GSC - gas-solid chromatography), ciecz osadzona na stałym nośniku w postaci jednorodnego filmu (warstwy), wtedy mamy do czynienia z chromatografią podziałową (GLC - gas-liquid chromatography). 1

2 Związki chemiczne z większym powinowactwem do fazy stacjonarnej są selektywnie zatrzymywane przez fazę nieruchomą i poruszają się wzdłuż kolumny znacznie wolniej. Związki z mniejszym powinowactwem do fazy stacjonarnej poruszają się wzdłuż kolumny szybciej i tym samym opuszczają kolumnę, czyli eluują z kolumny, jako pierwsze. Równowaga podziału pomiędzy fazy ma charakter dynamiczny, czyli cząsteczki substancji nieustannie przechodzą od fazy ruchomej do stacjonarnej i z powrotem. Podstawowym parametrem określającym podział substancji X pomiędzy dwie fazy jest stała podziału K, którą można wyrazić równaniem Nernsta: c c s K = (1) m gdzie: cs oznacza stężenie substancji X w fazie stacjonarnej, cm oznacza stężenie substancji X w fazie ruchomej. Innym ważnym parametrem jest współczynnik retencji k, który jest miarą czasu, w jakim substancja X przebywa w fazie stacjonarnej, w stosunku do czasu, w którym przebywa ona w fazie ruchomej. Określa on, ile razy dłużej dana substancja jest zatrzymywana przez fazę stacjonarną niż potrzebowałaby na przejście przez kolumnę z prędkością poruszania się fazy ruchomej. Związki chemiczne charakteryzujące się różnymi współczynnikami retencji mogą zostać rozdzielone na kolumnie chromatograficznej (Rys. 1). liczba moli substancji X w fazie stacjonarnej k = (2) liczba moli substancji X w fazie ruchomej Efekt rozdziału chromatograficznego jest wykreślany w postaci chromatogramu, który przedstawia wykres wskazań sygnału uzyskanego w detektorze w funkcji czasu lub w funkcji objętości fazy ruchomej. Zapis stężenia pojedynczej substancji w funkcji czasu ma postać krzywej Gaussa i nosi nazwę piku (ang. peak czyli szczyt). Typowy chromatogram przedstawiony jest na Rys. 2. Rys. 2. Chromatogram i sposób pomiaru podstawowych wielkości chromatograficznych 2

3 Możemy określić na nim: czas retencji t R - czas mierzony od momentu wprowadzenia próbki na kolumnę do momentu pojawienia się na wyjściu z kolumny maksimum stężenia danego związku chemicznego czyli maksimum piku L t R = x ( 1 + k) (3) u gdzie: L - długość kolumny chromatograficznej, u - średnia, liniowa prędkość przepływu gazu nośnego, k - współczynnik retencji, zerowy czas retencji t M (czas martwy ) - czas przebywania w kolumnie substancji, która nie ma powinowactwa do fazy stacjonarnej np. metanu; czas zerowy jest równy czasowi przepływu fazy ruchomej przez kolumnę, zredukowany czas retencji t R - jest różnicą pomiędzy czasem retencji a zerowym czasem retencji t = t t (4) R R M współczynnik retencji k tr tm k = (5) tm szerokość piku mierzoną u podstawy piku w lub szerokość piku mierzoną na określonej wysokości piku np. w połowie wysokości w 1/2h, liniową prędkość przepływu fazy ruchomej u przez kolumnę można łatwo wyznaczyć eksperymentalnie poprzez analizę chromatograficzną substancji niezatrzymywanej na kolumnie np. metanu i zmierzenie czasu przejścia jej przez kolumnę czyli czasu zerowego (t M ). L u = (6) t M Wielkość, którą można łatwo wyznaczyć, a która zależy od rodzaju rozdzielanych substancji i rodzaju fazy ruchomej jest retencja względna r a,s (zwana inaczej względnym czasem retencji). Określa się ją jako stosunek retencji dwóch substancji chromatografowanych, z których jedna jest wzorcem (s), a retencja drugiej (a) jest zbliżona do retencji wzorca: r a,s = t Ra / t Rs = k a / k s (7) Wartość r a,s może być większa lub mniejsza od 1. Im bardziej r a,s jest różne od 1, tym lepiej dwie substancje rozdzielają się. Kolejnym ważnym parametrem chromatograficznym jest współczynnik rozdzielania 3

4 (zwany także współczynnikiem selektywności), który jest miarą rozdzielenia dwóch sąsiednich pików na chromatogramie, dla których t R2 > t R1 : K k t 2 2 α = = = K k t 1 1 R 2 R 1 t t Współczynnik rozdzielania ma zawsze wartość większą od 1. M M (8) 1.2. Analiza jakościowa Analiza jakościowa dotyczy identyfikacji sygnałów chromatograficznych odpowiadających poszczególnym składnikom próbki i opiera się na: a) wielkościach retencyjnych, b) fizykochemicznego badania frakcji z zastosowaniem detektorów jakościowych c) wydzieleniu poszczególnych składników mieszaniny (chromatografia preparatywna) w celu ustalenia ich struktury innymi metodami (metoda najrzadziej stosowana) Analiza jakościowa w oparciu o wielkości retencyjne W trakcie analizy jakościowej opartej na wielkościach retencyjnych porównuje się czas retencji piku identyfikowanej substancji z czasem retencji piku wzorca, chromatografowanych w jednakowych warunkach. Badania zwykle polegają na potwierdzeniu lub wykluczeniu obecności danego związku w analizowanej mieszaninie. Jeżeli na chromatogramie substancji badanej nie występuje pik o czasie retencji równym retencji substancji wzorcowej oznacza to iż związek wzorcowy jest nieobecny w analizowanej mieszaninie. Z kolei jeśli taki sygnał występuje obecność substancji wzorcowej nie jest przesądzona, gdyż wiele związków należących do różnych klas związków chemicznych może mieć identyczny lub prawie identyczny czas retencji. Potwierdzeniem obecności takiego związku wzorcowego w analizowanej mieszaninie jest wykonanie analizy na innych wypełnieniach kolumn. Innym dogodnym rozwiązaniem jest korzystanie ze względnych czasów retencji, opisanych wzorem (7). Względny czas retencji zmienia się tylko ze zmianą temperatury lub fazy stacjonarnej, ale jest niezależny od wielu warunków eksperymentu. Najkorzystniej gdy analit i wzorzec występują w tej samej próbce. Wadą powyższych metod jest to, że niektóre wzorce mogą być trudno dostępne. 4

5 Często do analizy jakościowej używa się indeksów retencji zwanych indeksami Kováts a. Indeks retencji Kováts a substancji badanej jest równy 100 x liczba atomów węgla hipotetycznego n-alkanu mającego taki sam zredukowany czas retencji jak badana substancja (wzór 9 i 10). Zgodnie z konwencją alkany mają w każdej temperaturze i dla każdej fazy ciekłej indeks równy licznie atomów węgla x 100, a więc np. dla n-pentanu 500, n-oktanu 800. Do określenia indeksów retencji związku wybiera się dwa n-alkany, których czasy retencji leżą poniżej i powyżej czasu retencji nieznanej substancji. Te alkany dodaje się następnie do próbki i razem z nią analizuje. Jeżeli analiza alkanów i próbki musi przebiegać oddzielnie, należy przeprowadzać obydwa badania bezpośrednio jedno po drugim. Indeks retencji Kováts a substancji analizowanych w warunkach izotermicznych oblicza się zgodnie z poniższym równaniem: RI X logt' = 100z logt' X ) z+ 1) logt' logt' z) z) (9) gdzie : t x) zredukowany czas retencji substancji badanej t z) zredukowany czas retencji n-alkanu o (z) atomach węgla w łańcuchu t z+1) zredukowany czas retencji n-alkanu o (z+1) atomach węgla w łańcuchu Z wzoru wynika, że t z) < t R (x) < t R (z+1) Indeks retencji w programowanej temperaturze oblicza się stosując poniższe równanie: LTPRI X t' = 100z t' X ) z+ 1) t' t' z) z) (10) Indeks retencji Kováts a jest w znacznym stopniu niezależny od warunków analizy i przez to jest parametrem charakterystycznym dla danego związku w danej temperaturze i w obecności określonej fazy ciekłej. Podczas wyznaczania indeksów retencji należy zachować stały przepływ gazu nośnego, niską temperaturę początkową oraz stosować taką ilość dozowanej próbki, aby pik analitu był symetryczny. W przypadku wyznaczania indeksu w programowanej temperaturze wielkość ta zależy jedynie od fazy stacjonarnej, a nie zależy od parametrów kolumny, czasu retencji analitu, zakresu programowania temperatury i natężenia przepływu gazu nośnego. Warunki chromatograficzne: początkowa i końcowa temperatura kolumny, wartość liniowego narostu temperatury oraz natężenie przepływu gazu 5

6 nośnego, powinny być tak dobrane, aby odstępy czasowe pomiędzy kolejnymi n-alkanami były jednakowe. Praktyka laboratoryjna wskazuje, że wartości indeksów Kovats a wyznaczone dla substancji na fazach niepolarnych różnią się o 1 jednostkę, podczas gdy z zastosowaniem faz polarnych o 2-3 jednostki, a nawet 5 dla faz najbardziej polarnych. Błędy te wynikają głównie z ograniczonej stabilności faz ciekłych. W szeregach homologicznych obserwuje się zależność pomiędzy parametrami retencji i wielkościami takimi jak liczba atomów węgla, liczba grup CH 2 i temperatura wrzenia. Jeżeli wykreśli się zależność logarytmu zredukowanego czasu retencji w funkcji liczby atomów węgla, to otrzymane proste są charakterystyczne dla każdego szeregu homologicznego związków analizowanych w warunkach izotermicznych w danej temperaturze i dla danej fazy ciekłej (Rys. 2). W przypadku analiz w programowanej temperaturze zachodzi prostoliniowa zależność zredukowanego czasu retencji w funkcji liczby atomów węgla. Rys. 2. Zależność pomiędzy zredukowanym czasem retencji i liczbą atomów węgla w szeregu homologicznym. W sprzyjających warunkach, na podstawie wyznaczonego indeksu substancji badanej, można przyporządkować nieznany związek do danego szeregu homologicznego, a tym samym dokonać jego identyfikacji. Pewność wyniku można osiągnąć przez porównanie uzyskanych wartości retencji z wynikami otrzymanymi na kolumnie o innej polarności. Wykonując analizę jakościową należy pamiętać, że retencja może zmieniać się nawet przy małych zmianach warunków analizy. W niektórych przypadkach zmiana ta nie jest jednakowa dla wszystkich składników próbki i położenie jednych w stosunku do drugich 6

7 może ulegać zmianie. Analizując nowe próbki trzeba mieć pewność, że wszystkie składniki poprzednio chromatografowanej próbki zostały usunięte z kolumny. Piki takich substancji można łatwo rozpoznać, ponieważ są znacznie szersze niż piki sąsiednie. Piki odpowiadające substancjom, które nie występują w badanej próbce, mogą pochodzić z zanieczyszczeń układu chromatograficznego lub rozpuszczalnika użytego do sporządzenia roztworu próbki. W tym ostatnim przypadku należy sprawdzić czystość rozpuszczalnika, analizując jego ilość odpowiadającą tej, którą wprowadza się do kolumny z próbką Analiza jakościowa oparta na fizykochemicznym badaniu frakcji z zastosowaniem detektorów jakościowych Połączenie chromatografii gazowej z metodami spektroskopowymi: a) spektrometrią mas - zestaw GC-MS b) spektroskopią w podczerwieni IR zestaw GC-IR c) absorpcyjną spektroskopią atomową AAS zestaw GC-AAS, d) emisyjną spektroskopią atomową AES zestaw GC-AES pozwala na identyfikację związków organicznych (GC-MS, GC-IR) i metaloorganicznych (GC-AAS i GC-AES). Dzięki technikom łączonym uzyskujemy dodatkową informację stukturalną np. odpowiednie do danej techniki spektroskopowej widmo substancji badanej. Najprostszym sposobem identyfikacji substancji jest zastosowanie metody połączenia chromatografii gazowej z spektrometrią mas (GC-MS). Identyfikacja składników analizowanej mieszaniny odbywa się wówczas nie tylko na podstawie czasów retencji, ale też na podstawie widm mas analizowanych substancji. Należy zaznaczyć, iż próbka nie powinna zawierać izomerów, które mają często zbliżone lub identyczne widma mas. 2. Część eksperymentalna 2.1. Cel Celem ćwiczenia jest nabycie umiejętności obsługi chromatografu gazowego oraz wykonanie analizy jakościowej za pomocą chromatografii gazowej Wykonanie Analiza chromatograficzna w warunkach izotermicznych Chromatograf GC z detektorem FID, Kolumna chromatograficzna RTX-5 30 m, 0,25 mm średnica wewnętrzna, 0,25 µm grubość fazy stacjonarnej, Temperatura kolumny: 120 C, Temperatura dozownika: 220 C, Temperatura detektora: 7

8 220 C, Dzielnik przepływu: 1:20, Gaz nośny: argon, stały przepływ 1 ml/min, Powietrze: 350 kpa Wodór: 35 kpa, Czas analizy: 11 min Analiza chromatograficzna w programie temperaturowym Chromatograf GC z detektorem FID, Kolumna chromatograficzna RTX-5 30 m, 0,25 mm średnica wewnętrzna, 0,25 µm grubość fazy stacjonarnej, Program temperaturowy: C, narost 3 C/min, Temperatura dozownika: 220 C, Temperatura detektora: 220 C, Dzielnik przepływu: 1:20, Gaz nośny: argon, stały przepływ 1 ml/min, Powietrze: 350 kpa, Wodór: 35 kpa, Czas analizy: 22 min Ekstrakcja olejku eterycznego ze skórek owoców cytrusowych Ekstrahować około 0,1 g części pomarańczowej skórki (nie albedo) za pomocą 3 ml heksanu mieszając przez około 5 min i pozostawić na około 5 min a następnie zdekantować. Jeżeli będzie to konieczne to zatężyć ekstrakt w strumieniu azotu Analiza jakościowa poprzez porównanie czasu retencji analitu z czasem retencji wzorca wyznaczonych w tych samych warunkach chromatograficznych Należy wykonać analizę próbki badanej oraz analizę roztworu wzorcowego. Odczytać z chromatogramów i porównać czasy retencji. Zidentyfikować analit Wyznaczenie indeksów Kováts a w warunkach programowanej temperatury Należy wykonać analizę próbki badanej oraz analizę roztworu wzorcowego: mieszaniny 5-ciu n-alkanów od n-c 8 do n-c 12 i wyznaczyć indeksy. Wykreślić krzywą zależności pomiędzy zredukowanymi czasami retencji i liczbą atomów węgla w szeregu homologicznym n- alkanów na podstawie analizy roztworu wzorcowego: t R = f (C) Wyznaczenie indeksów Kováts a w warunkach izotermicznych Należy wykonać analizę próbki badanej oraz analizę roztworu wzorcowego: mieszaniny 5-ciu n-alkanów od n-c 8 do n-c 12 i wyznaczyć indeksy. Wykreślić krzywą zależności pomiędzy logarytmami zredukowanych czasów retencji i liczbą atomów węgla w szeregu homologicznym n-alkanów na podstawie analizy roztworu wzorcowego: log t R = f ( C) 8

9 Odczynniki i sprzęt laboratoryjny roztwór wzorcowy mieszaniny n-alkanów: n-c 8, n-c 9, n-c 10, n-c 11, n-c 12, roztwór wzorcowy limonenu, roztwór wzorcowy α-pinenu, chlorek metylenu do mycia strzykawki, strzykawka do GC 10 µl - 2 szt, zlewka 10 ml 4 szt naczynko zakręcane 1,5 ml 4 szt pipeta 5 ml, pompka do pipet, heksan 50 ml nóż Literatura 1. Walenty Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej PWN, W-wa, Ryszard Kocjan (red.). Chemia analityczna. Podręcznik dla studentów. Tom 2. PZWL, W-wa, Witkiewicz Zygfryd, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa,