Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego HPLC-2 Nowoczesne techniki analityczne

Transkrypt

1 Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego HPLC-2 Nowoczesne techniki analityczne 1) OZNACZANIE ROZKŁADU MASY CZĄSTECZKOWEJ POLIMERÓW Z ASTOSOWANIEM CHROMATOGRAFII ŻELOWEJ; 2) PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Z ZASTOSOWANIEM SPE I KONTROLA OBECNOŚCI ORAZ OZNACZANIE ZAWARTOŚCI SACHAROZY W MIODZIE WSTĘP Chromatografia żelowa (GPC Gel Permeation Chromatography, albo SEC Size Exclusin Chromatography) jest techniką rozdzielania substancji, w której wykorzystuje się niejonowy mechanizm sita molekularnego, nazwany też mechanizmem wykluczania molekularnego. W odróżnieniu od innych rodzajów chromatografii, w chromatografii żelowej rozdziela się substancje prawie wyłącznie wg rozmiarów ich cząsteczek w roztworze. Wykorzystuje się zróżnicowanie dostępności molekuł do porów o zróżnicowanych średnicach, a w konsekwencji zróżnicowanie w przestrzeni porów wewnątrz ziaren wypełnienia kolumny - drogi i czasu dyfuzji cząsteczek różniących się wielkością i w konsekwencji masą molekularną. Chromatografia żelowa może być też stosowana do oznaczania zawartość tych składników próbki, które posiadają wydatnie wyższą, albo niższą masę cząsteczkową od pozostałej części próbki. Bywa też wykorzystywana w procesie przygotowania próbki, szczególnie, w celu oddzielenia substancji o wyższych masach molekularnych od substancji oznaczanych, np. wyodrębnienie frakcji zawierającej WWA, pestycydy, czy sole metali ciężkich z frakcji lipidów i fosfolipidów, albo kwasów humusowych itp. Ważne i wciąż rosnące zastosowanie ma też chromatografia jonowymienna i jonowa, szczególnie w kontroli czystości różnego typu wód, a także ścieków. Dotyczy to przede wszystkim oznaczania zawartości anionów nieorganicznych i organicznych, a także metali alkalicznych, ziem alkalicznych, metali ciężkich, inhibitorów korozji itp. Stosuje się silne, średnio mocne i słabe anionity oraz kationity. Szczególnie w przypadku rozdzielania substancji organicznych wykorzystuje się często słabe, albo bardzo jonity i oddziaływania jon dipol, jon dipol indukowany oraz dipol dipol. Z wykorzystaniem bardzo słabych anionitów można w ten sposób rozdzielać i oznaczać m.in. kwasy karboksylowe, cukry, amino-cukry, aldehydy i alkohole. CEL ĆWICZENIA Celem pierwszej części ćwiczenia jest wyznaczanie rozkładu masy cząsteczkowej polimerów na podstawie zależności funkcyjnej pomiędzy wartością log M (masy cząsteczkowej) i czasem retencji wzorcowych polimerów (na podstawie specyficznego typu krzywej kalibracyjnej). W drugiej części ćwiczenia studenci mają za zadanie skontrolować czy próbka miodu jest sfałszowana (czy zawiera sacharozę) oraz oznaczyć zawartość sacharozy i dwóch podstawowych cukrów (glukozy i fruktozy) obecnych w miodzie. Dodatkowym celem jest przygotowanie próbki - oddzielenie wosków i innych składników hydrofobowych - z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE - solid phase ekstraction), a także wykonanie kalibracji dla trzech rodzajów cukrów z wykorzystaniem metody krzywej kalibracyjnej 1

2 MATERIAŁY I SPRZĘT - Roztwory standardów polimerów o znanej wartości średniej masy cząsteczkowej i minimalnej dyspersji rozkładu masy cząsteczkowej, w tetrahydrofuranie; Roztwory próbek polimerów w tetrahydrofuranie; tetrahydrofuran, jako eluent; glukoza, fruktoza, sacharoza o czystości ponad 99 % oraz roztwory kalibracyjne; Próbki miodu i ich roztwory w wodzie; acetonitryl do HPLC, woda destylowana, albo o podobnej czystości; - Aparat chromatograficzny do chromatografii żelowej: pompa Merck Hitachi L-6200, dozowanie próbki dozownik zaworowy z pętlą 20 μl, kolumna do chromatografii żelowej w warunkach liofilowych wypełnienie LiChrogel PS MIX, dp = 5 μm, wymiary kolumny 250 mm (długość) x 7 mm (średnicy wewnętrzna) detektor refraktometryczny, integrator; zestaw sprzętowy do SPE, pompka próżniowa, kolumienki SPE typu RP 18 (0.5 g); Waga analityczna - Kolby miarowe 25, albo 10 ml; Pipeta automatyczna; - Strzykawka 100, albo 50 μl (produkcji Hamilton, albo SGE). OZNACZANIE ROZKŁADU MASY MOLEKULARNEJ Próbkę polimeru przeznaczonego do badania rozkładu masy cząsteczkowej rozpuszcza się w fazie ruchomej (w tetrahydrofuranie). Określoną objętość tego roztworu wstrzykuje się do kolumny chromatograficznej typu HPLC, wypełnionej kulistymi cząstkami kopolimeru styren diwinylobenzen o wysokim stopniu usieciowania. Kolumna umożliwia selektywne rozdzielenie substancji różniących się masą cząsteczkową. Wylot kolumny jest połączony z detektorem refraktometrycznym, którego sygnał jest proporcjonalny do stężenia oraz do masy cząsteczkowej substancji eluowanych z kolumny. Otrzymany pik chromatograficzny zostaje podzielony kilka do kilkunastu fragmentów o zbliżonych powierzchniach. Każdemu z fragmentów zostaje przypisany czas retencji, odpowiadający położeniu środka ciężkości odpowiedniego fragmentu. Uzyskane wartości czasu retencji poszczególnych fragmentów piku są porównywane są z odpowiadającymi im wartościami czasu retencji i logarytmu masy cząsteczkowej na przygotowanej wcześniej krzywej kalibracyjnej, uzyskanej dla niskodyspersyjnych standardów polimerów. Wagowy udział poszczególnych frakcji o określonych masach molekularnych w próbce badanego polimeru wyznacza się w przybliżeniu na podstawie udziałów powierzchni poszczególnych fragmentów piku do całkowitej jego powierzchni. W celu dokładnego określenia wagowego rozkładu stężenia należy, dodatkowo, zastosować metodę normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi, określonymi na podstawie wykresu c M = f(a M ), gdzie: c M to stężenie roztworu niskodyspersyjnego polimeru o średniej masie molekularnej M, A M to powierzchnie odpowiedniego piku próbki kalibracyjnej. WARUNKI ROZDZIELANIA Przepływ fazy ruchomej 0,8 ml / min Temperatura pokojowa Ciśnienie ok. 30 atm. 2

3 WYKONANIE ĆWICZENIA 1. Wzorcowanie a). Sporządzić roztwory nisko dyspersyjnych standardów polimerów o średnich masach molekularnych: Da, 580 Da w THF (stężenie końcowe roztworu ok. 2 mg / ml) oraz Da, Da, Da, 2450 Da (stężenie końcowe ok. 3 mg / ml); b).ustawić stałą prędkość przepływu eluentu (THF) 0,8 ml / min. c).ustabilizować warunki rozdzielania po zapewnieniu wypełnienia kanału odniesienia detektora RI aktualnie stosowanym eluentem (konieczne uzyskanie stabilnej linii podstawowej detektora wahania wskazań na wyświetlaczu mniejsze od 0,2 jednostek względnych); d). Po ustaleniu warunków oznaczania, nastrzyknąć kolejno roztwory wzorcowych polimerów w THF; e).zarejestrować chromatogramy i odczytać czas retencji oraz powierzchnię piku każdego wzorca. 2. Wykonanie oznaczenia rozkładu masy molekularnej próbki polimeru a). Zważyć ok. 0,2 g polimeru o nieznanej masie cząsteczkowej (np. styropian, fragment sztućca, albo obudowy polistyrenowej) do kolby miarowej o poj. 10 ml i dopełnić do kreski THF. b). Po ustabilizowaniu warunków oznaczania, identycznych jak te, które stosowano podczas wzorcowania, dozować do kolumny roztwór próbki i rozpocząć zbieranie danych. c). Z uzyskanego chromatogramu odczytać czas retencji (czas położenia maksimum piku) oraz czas elucji początku i końca oraz czas położenia ok. ¼, 1/3, ½, 2/3, ¾ powierzchni piku analizowanego polimeru. OPRACOWANIE WYNIKÓW 1. Sporządzić wykres zależności czasu retencji od log M wzorcowych polimerów (krzywa kalibracyjna); 2. Na podstawie wartości czasu retencji poszczególnych fragmentów piku badanego polimeru, wyznaczyć z równania krzywej kalibracyjnej odpowiadające im wartości masy cząsteczkowej oraz orientacyjny przebieg krzywej rozkładu masy cząsteczkowej badanego polimeru przy założeniu, że czułość detektora RI nie zależy od masy cząsteczkowej (metoda normalizacji prostej ); 3. Na podstawie zależności powierzchni pików standardów polimerowych o różnych masach cząsteczkowych od ich stężenia w próbce dozowanej do kolumny wyznaczyć skorygowany przebieg krzywej rozkładu masy cząsteczkowej badanego polimeru z zastosowaniem metody normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi (znana zależność funkcyjna c M = f(a M ). Uwaga! Kalibracja z zastosowaniem nisko-dyspersyjnych standardów polistyrenu jest często wykorzystywana także do wyznaczania rozkładu masy cząsteczkowej innych polimerów, niż polistyren. Wówczas wyniki mogą mieć, jednak, tylko orientacyjny charakter. W celu otrzymania wyników dokładnych należy zastosować do kalibracji nisko dyspersyjne 3

4 standardy tego samego typu polimeru, którego rozkład masy cząsteczkowej jest badany, albo wykorzystać takie metody detekcji, które pozwalają na wyznaczenie bezwzględnej wartości masy molekularnej. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI (USUNIĘCIE FRAKCJI WOSKÓW Z ZASTOSOWANIEM SPE), KONTROLA OBECNOŚCI SACHAROZY I OZNACZENIE ZAWARTOŚCI PODSTAWOWYCH CUKRÓW W MIODZIE METODĄ HPLC RID / NH2 Próbkę miodu o masie 0,5 g rozpuścić w 5 cm3 wody. Roztwór miodu przesączyć przez kolumienkę SPE typu C18 w celu usunięcia wosków i steroli. Kolumienkę przed użyciem należy kondycjonować ok. 10 ml fazy ruchomej (acetonitryl : woda 80:20 v/v). Po naniesieniu badanego roztworu na kolumienkę, należy dodatkowo przepłukać ją 10 ml wody do HPLC. Tak przygotowany roztwór rozcieńczyć 8 krotnie i poddać analizie chromatograficznej. WARUNKI ROZDZIELANIA Przepływ fazy ruchomej 1.2 ml / min Temperatura pokojowa Ciśnienie ok. 90 atm. WYKONANIE ĆWICZENIA 1. Wzorcowanie a). Sporządzić roztwory cukrów (glukoza, fruktoza, sacharoza) o stężeniu ok. 4mg/ml oraz 2 mg/ml każdego z wzorców b). Ustawić stałą prędkość przepływu eluentu (acetonitryl :woda 80:20v/v) 1,2 ml / min. c). Ustabilizować warunki rozdzielania po zapewnieniu wypełnienia kanału odniesienia detektora RI aktualnie stosowanym eluentem (konieczne uzyskanie stabilnej linii podstawowej detektora wahania wskazań na wyświetlaczu mniejsze od 0,2 jednostek względnych); d). Po ustaleniu warunków oznaczania, nastrzyknąć kolejno roztwory wzorcowych cukrów e). Zarejestrować chromatogramy oraz odczytać powierzchnię piku każdego wzorca. 3. Wykonanie oznaczenia a). Wprowadzić do aparatu odpowiednią objętość roztworu miodu przygotowanego zgodnie z procedurą opisaną powyżej b) Zarejestrować chromatogramy oraz odczytać powierzchnie wszystkich pików OPRACOWANIE WYNIKÓW a). Sporządzić wykres zależności stężenia wyrażonego w mg / ml od powierzchni wyznaczonej dla każdego wzorca cukru tj. glukozy, fruktozy i sacharozy b). Na postawie uzyskanych krzywych kalibracyjnych wyznaczyć zawartość poszczególnych cukrów w próbkach miodu wyrażoną w % masowych c). Wyznaczyć całkowitą zawartość cukrów w próbce, wyrażoną w % masowych, przez zsumowanie zawartości poszczególnych cukrów w próbce. 4

5 LITERATURA Praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego Chromatografia cieczowa, CEEM, Gdańsk, 2004; D. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka Chromatografia żelowa PWN Warszawa