Metody chromatograficzne w chemii i biotechnologii, wykład 5. Łukasz Berlicki

Transkrypt

1 Metody chromatograficzne w chemii i biotechnologii, wykład 5 Łukasz Berlicki

2 Chromatografia cieczowa adsorbcyjna Faza stacjonarna: Ciało stałe -> chromatografia adsorbcyjna Faza ruchoma: Ciecz -> chromatografia cieczowa Układy chromatograficzne Chromatografia kolumnowa Chromatografia planarna

3 Chromatografia cieczowa Cieczowa chromatografia kolumnowa: Klasyczna

4 Chromatografia cieczowa Cieczowa chromatografia kolumnowa: Klasyczna Flash/FPLC

5 Chromatografia cieczowa Cieczowa chromatografia kolumnowa: Klasyczna Flash/FPLC HPLC

6 Budowa aparatu Injektor Pompa Pompa Kolumna Rezerwuar rozpuszczalników System zbierania danych Detektor

7 Budowa aparatu Zasobniki rozpuszczalników

8 Rozpuszczalniki Odgazowywanie rozpuszczalników Każdy rozpuszczalnik zawiera rozpuszczone powietrze. Mieszaniny rozpuszczalników przeważnie słabiej rozpuszczają powietrze. Powstawanie bąbelków powietrza w aparacie HPLC jest bardzo niekorzystne: Złe działanie pomp Poszarpana linia bazowa

9 Rozpuszczalniki Odgazowywanie rozpuszczalników Ultradźwięki Próżnia Przepłukiwanie helem hel bardzo słabo rozpuszcza się w eluentach Degazer membranowy optymalny.

10 Budowa aparatu Pompa

11 Budowa aparatu Pompa tłoczek Zawór Zwrotny wyjściowy krzywka uszczelka głowica Zawór Zwrotny wejściowy

12 Budowa aparatu Pompa

13 przepływ Budowa aparatu Pompy Pobór rozpuszczalnika Dostarczanie rozpuszczalnika czas

14 Budowa aparatu Pompy Układ z dwoma tłoczkami stabilniejszy przepływ

15 Budowa aparatu Układ gradientowy dla wysokiego ciśnienia kontroler mikser pompy injektor kolumna

16 Budowa aparatu Układ gradientowy dla średniego ciśnienia (z jedną pompą) kontroler Zawór proporcjonujący pompa injektor mikser kolumna

17 Układ wprowadzania próbki Injektor zlewki nastrzyk pompa kolumna pętla

18 Układ wprowadzania próbki Injektor zlewki nastrzyk pompa kolumna pętla Pozycja LOAD

19 Układ wprowadzania próbki Injektor zlewki nastrzyk pompa kolumna pętla Pozycja INJECT

20 Autosampler Autosampler

21 Autosampler Autosampler

22 Połączenia Wszystkie rurki i połączenia po stronie wysokiego ciśnienia są wykonane ze stali nierdzewnej. Nakrętka Ferulka Blok

23 Połączenia Przyłączenie kolumny

24 Połączenia Przyłączenie kolumny Blok końcowy nakrętka Ferulka Złoże Kolumna Filtr

25 Koluna Powody zniszczenia kolumny chemiczne Zatkanie cząstkami stałymi Szok mechaniczny Adsorbcja nieczystości

26 Kolumna Bezpieczne podłączenie kolumny Prekolumna Injektor Filtr pompa Kolumna zabezpieczająca Kolumna

27 Kolumna Układ do termostatowania kolumn: Powtarzalność wyników (stabilna temperatura) Rozpuszczalność związków (podwyższona temperatura) Stabilność analitów (obniżona temperatura)

28 Detektory UV-Vis Lampa deuterowa Filtr z tlenku holmu przesłona Dioda pomiarowa Lustro 1 Komórka przepływowa Rozdzielacz wiązki Dioda odniesienia Monochromator Lustro 2

29 Detektory Matryca fotodiodowa Lampa wolframowa Lampa deuterowa Soczewki 1024 diody pomiarowe Filtr z tlenku holmu Komórka przepływowa Przesłona Dioda odniesienia Siatka dyfrakcyjna

30 Detektory Rodzaje detektorów: Współczynnik załamania światła Fluorescencyjny Elektrochemiczny Przewodnictwa Spektrometria mas FT-IR

31 HPLC - MS Otrzymujemy widma masowe dla każdego piku

32 HPLC - MS Najczęściej do HPLC przyłączane są spektrometry z źródłem elektrospray:

33 Systemy obróbki danych Każdy program komputerowy do chromatografii powinien umożliwiać: Zbieranie danych Obróbkę danych Lina bazowa Szerokość pików Powierzchnia pików Wygładzanie Próbkowanie

34 Konfiguracja HPLC HPLC preparatywne Dwie pompy o przepływie do 50 ml/min Ciśnienie do 150 bar Kolumny o średnicy mm Kolektor frakcji HPLC analityczne Dwie pompy o przepływie do 10 ml/min (ew. 5 ml/min) Ciśnienie do 300 bar Kolumny o średnicy 4.6 mm Autosampler

35 Konfiguracja HPLC Prosty układ HPLC: Pompa izokratyczna Ręczny układ do nastrzykiwania próbki Detektor UV-Vis Prosty kontroler

36 Konfiguracja HPLC Zaawansowany układ HPLC: 4 pompy Autosampler Kolumna termostatowana Detektor diodowy Komputer

37 Podsumowanie Chromatografy do HPLC są układami o wielu możliwościach rozbudowy. Konfiguracja HPLC zależy od zastosowań.