HPLC? HPLC cz.1. Analiza chromatograficzna. Klasyfikacja metod chromatograficznych

Transkrypt

1 HPLC cz.1 ver. 1.0 Literatura: 1. Witkiewicz Z. Podstawy chromatografii 2. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej 3. Snyder L.R., Kirkland J.J., Glajch J.L. Practical HPLC Method Development 4. Google (np. strony producentów aparatury i akcesoriów chromatograficznych) HPLC? Wysokosprawna chromatografia cieczowa (highperformanceliquid chromatography) Wysokoci nieniowa chromatografia cieczowa (highpressureliquid chromatography) Chromatografia = Rozdział + Detekcja 1 Schemat zestawu do HPLC 2 Klasyfikacja metod chromatograficznych Analiza chromatograficzna Informacje jako ciowe (co?) i ilo ciowe (ile?) Sygnał (powierzchnia pod pikiem) cz sto jest proporcjonalny do st enia analitu Czas pojawienia si piku (czas retencji) jest charakterystyczny dla danej substancji (uwaga na pokrywaj ce si piki!) Wynik analizy = chromatogram tj. wykres XY, sygnał od czasu (obj to ci eluentu) 3 4

2 Zestaw do HPLC - szczegóły Aparatura Zbiornik eluentu (+ filtr, + system odgazowania) Pompa(y) stały, ci le okre lony przepływ (bez pulsacji). Ci nienie eluentu jako funkcja temp., przepływu i lepko ci. Skoki ci nienia przyczyny. Schemat blokowy chromatografu cieczowego. 1,2 - zbiorniki eluentów, 3 - pompa, 4 - manometr, 5 - dozownik, 6 - przedkolumna, 7 kolumna chromatograficzna, 8 - termostat kolumny, 9 - przepływomierz, 10 - detektor, 11 - kolektor frakcji, 12 - rejestrator lub komputer Dozownik (zawór z p tl ) Kolumny (+ termostat piec) Najwa niejsze: eluent (faza ruchoma), kolumna i detektor 5 6 Aparatura - kolumny Fazy ruchome HPLC - eluent Kolumny rurki ze stali nierdzewnej dł. 5-35cm, rednicy wewn trznej 2-30mm, wypełnione specjalnego typu stałym no nikiem Jak obchodzi si z kolumnami? U ywa czystych chemicznie i mechanicznie rozpuszczalników Filtrowa próbk (filtr 0.5µm) U ywa prekolumn Zachowywa zalecenia producenta co do ci nienia, ph i rodzajów rozpuszczalników na których mo e pracowa kolumna Obchodzi si z kolumn ostro nie (szok mechaniczny/termiczny), przechowywa zatkan Kierunek przepływu eluentu powinien by zgodny z zaznaczonym na kolumnie 7 Kompatybilno z detektorem (nie przeszkadza w detekcji) Reaktywno rozpuszczalnika (THF, reakcje z próbk ) Temp. wrzenia i lepko Mieszalno (układy dwu lub wielorozpuszczalnikowe) Bezpiecze stwo Dost pny, czysty, tani, kompatybilny z detektorem, bezpieczny, relatywnie niereaktywny (oboj tny chemicznie w stosunku do próbki i fazy stacjonarnej, trwały w warunkach analizy). Rozpuszczalnik powinien dobrze rozpuszcza próbk. Najlepiej je li ma nisk lepko i temp. wrzenia. Polarno rozpuszczalnika siła elucyjna (por. LC) Normalny układ faz (rozpuszczalniki niepolarne np. heksan+chloroform, heksan+dichlorometan) / odwrócony układ faz (rozpuszczlniki polarne np. woda+metanol, woda+thf) 8

3 Wła ciwo ci rozpuszczlników Elucja izokratyczna i gradientowa Elucja izokratyczna skład eluentu niezmienny podczas analizy Elucja gradientowa skład eluentu zmienia si w czasie analizy (ro nie st enie bardziej polarnego składnika) 9 10 Rozdział Fazy stacjonarne 11 Budowa ziarna 12

4 Wypełnienia kolumn Wypełnienia kolumn Przykłady grup chemicznych zwi zanych na powierzchni ziarna Krzemionka surowa Charakter chemiczny powierzchni 13 Dobór wypełnienia kolumny do rodzaju próbki i eluentu 14 Detekcja Detekcja detektor UV Minimalne/maksymalne st enie analitu Czynniki wywołuj ce szum/dryft Obróbka wyników analiz Czuło i selektywno detektora Liniowo Pomiar absorbancji w zakresie UV (ok nm) eluatu przepływaj cego przez celk pomiarow Mo liwa bardzo du a czuło (budowa chemiczna analitu) Szeroki przedział liniowo ci Mo liwa praca w trybie gradientowym rozdziału Relatywnie mało czuły na wahania temperatury Informacje ogólne 15 Najwa niejsze typy detektorów 16

5 Detekcja detektor RI Pozostałe zagadnienia Pomiar ró nicy we współczynniku załamania wiatła (refractive index) pomi dzy eluentem (celka odniesienia) a eluatem (w celce pomiarowej) GPC zasada rozdziału, kalibracja, obliczenia Analiza jako ciowa krok po kroku Analiza ilo ciowa krok po kroku Przygotowanie próbek do analiz chromatograficznych Zastosowania HPLC/GPC Przykładowy problem do rozwi zania Niezwykle uniwersalny (polimery, zwi zki małocz steczkowe, niezale nie od budowy chemicznej) Stosunkowo mało czuły (nie nadaje si do analizy ladowej) Bezu yteczny w trybie gradientowym rozdziału Czuły na wahania temperatury = HPLC cz. 2 Najwa niejsze typy detektorów 17 18