ZASTOSOWANIA SPEKTROMETRII MAS W CHEMII ORGANICZNEJ I BIOCHEMII WYKŁAD II ZASTOSOWANIA SPEKTROMETRII MAS

Transkrypt

1 ZASTSWANIA SPEKTRMETRII MAS W CHEMII RGANICZNEJ I BICHEMII WYKŁAD II ZASTSWANIA SPEKTRMETRII MAS Prof. dr hab. Witold Danikiewicz Instytut Chemii rganicznej PAN Warszawa

2 PYTANIA, NA KTÓRE MŻE DPWIEDZIEĆ SPEKTRMETRIA MAS 1. Jaka jest masa cząsteczkowa związku? Metody: widmo EI 70 ev i np. 12 ev lub łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, MALDI) w celu otrzymania jonu molekularnego. 2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych, badanie profilu izotopowego. 3. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI, badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej, dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych, wymiana izotopowa, otrzymywanie i badanie pochodnych. Identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm. 4. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów, stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego lub braku zgodności widm (+) i (-). 5. Jaki jest skład mieszaniny związków? Metody: chromatografia gazowa lub cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS, LC/MS) analiza jakościowa i ilościowa.

3 1. Jaka jest masa cząsteczkowa związku? Metody: widmo EI 70 ev i np. 12 ev lub łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, MALDI) w celu otrzymania jonu molekularnego.

4 WIDM EI KWASU CTWEG Jony fragmentacyjne Intensywność względna C H 3 C M = 60 H Jon molekularny m/z

5 Widmo ESI związku o małej cząsteczce (MeH, jony dodatnie) 100 Spec #1[BP = 817.4, 2132] 2M + Na Ph 80 N Ph % Intensity M + H + M + Na H M = M + K Mass (m/z)

6 Widma ESI w trybie jonów dodatnich i ujemnych pochodnej binaftylu o masie 344 u, zawierającej grupy H i CH % Intensity F? ? F 279.1? F? Spec #1[BP = 201.0, 724] F Mass (m/z) ESI (+) [2M + Na + ] CH (H) (H) m n Spec #1[BP = 343.1, 2675] [M H + ] ESI (-) 2675 % Intensity Mass (m/z)

7 REGUŁA AZTWA Parzysta liczba atomów azotu = = parzysta masa cząsteczkowa (nominalna) Nieparzysta liczba atomów azotu = = nieparzysta masa cząsteczkowa (nominalna) W spektrometrii mas dotyczy jonów nieparzystoelektronowych. Dla jonów parzystoelektronowych jest na odwrót. Jony parzystoelektronowe: M + H +, M H +, M + Na +, M + Cl itp. powstają w wyniku jonizacji ESI, APCI, MALDI Jony nieparzystoelektronowe: M + powstają w wyniku jonizacji EI

8 LICZBA MIEJSC NIENASYCENIA Dla cząsteczki o wzorze C x H y N z n liczba miejsc nienasycenia N wynosi: N = x z 1 y gólniej: typ x: C,Si typ y: typ z: 1 H, F, Cl, Br, I N, P typ n:, S Dla cząsteczek obojętnych i kationo- lub anionorodników liczba miejsc nienasycenia musi być całkowita i dodatnia lub równa 0. Dla jonów parzystoelektronowych ułamkowa i nie mniejsza niż 0.5.

9 Warunki, które musi spełnić jon molekularny w widmie EI (konieczne, ale nie wystarczające) 1. Musi być jonem o najwyższej masie w danym widmie (z uwzględnieniem jonów izotopowych). 2. Musi być jonem nieparzystoelektronowym, czyli odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową. 3. Masy najbliższych mu jonów fragmentacyjnych (czyli fragmentów o najwyższych masach) muszą dać się wyjaśnić utratą fragmentów obojętnych (cząsteczek lub rodników) o logicznych masach.

10 Warunki, które musi spełnić jon pseudomolekularny w widmie LSIMS, ESI lub APCI 1. Musi być jonem parzystoelektronowym, a odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową po odjęciu lub dodaniu jonu odpowiedzialnego za jonizację (najczęściej H +, Na +, Cl - itp.). 2. Jego masa musi umożliwić wyjaśnienie obecności ewentualnych klasterów typu (nm+ Kat) +, (nm Kat) lub (nm+ A), a także klasterów z matrycą (w LSIMS) lub rozpuszczalnikiem (w ESI). 3. Jego masa musi być zgodna z masami obserwowanych jonów naładowanych wielokrotnie (w ESI, czasem także w LSIMS). 4. W większości przypadków zakwaszenie próbki powinno spowodować wzrost intensywności jonu M + H +, a dodanie soli sodowej jonu M + Na W przypadku próbek o charakterze amfoterycznym (np. peptydy) dodatni jon pseudomolekularny powinien mieć masę o dwie jednostki większą niż ujemny jon pseudomolekularny (dotyczy jonów M + H + i M H + ).

11 Widmo ESI peptydu o masie 3377 u [M+4H + ] Spec /1:14[BP = 846.1, 396] M 0,25 n = % Intensity [M+5H + ] [M+3H + ] 3+ M Spec /1:14=>DECNV[BP = , 571] Mass (m/z) % Intensity Spec /1:14=>DECNV[BP = , 571] % Intensity Mass (m/z) Mass (m/z)

12 WIDM ESI PEPTYDU MASIE Da Widmo po dekonwolucji m 2 m 1 m 1 = (M + n)/n m 2 = (M + n + 1)/(n + 1) n = (m 2 1)/(m 1 m 2 ) M = ( m 2 1)( m1 1) m 1 m 2

13 Widmo ESI(+) dimeru albuminy wołowej

14 Widmo ESI(-) syntetycznego oligonukleotydu

15 Widmo ESI kompleksu w MeH roztwór świeżo przygotowany [L + H ] [2L+Co 2+ ] 2+ Spec #1[BP = 309.2, 8991] L + CoCl wmeh [L+Co 2+ +Cl - ] % Intensity [L+Co 2+ +MeH] [3L+Co 2+ ] [2L+Co 2+ +Cl - ] Mass (m/z) [2L+2Co 2+ +3Cl - ] +

16 Widmo ESI kompleksu w MeH roztwór po 1 godzinie [L + 2H + ] 2+ Spec #1[BP = 155.1, 4153] L + CoCl 2 wmeh [L + H + ] % Intensity Mass (m/z)

17 WIDM ESI KMPLEKSÓW 18-C-6 Z KATINAMI LITWCÓW M + Rb + M + Cs M = C-6 + NaCl + RbCl + CsCl (1:1:1:1) w MeH H 2 (7:3) (bez K +!) M + Na + M + K M + Cs m/z, amu

18 2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego lub peudomolekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych, badanie profilu izotopowego.

19 H, 2 DKŁADNE MASY ATMWE I SKŁADY IZTPWE NAJLŻEJSZYCH PIERWIASTKÓW , , He, , , Li, , , Be, , B, , , C, , , N, , , 0.365, , , , F, , Ne, , , , 8.82 Na, , Mg, , , , Al, , Si, , , , 3.12 P, , S, , , , , Cl, , , 24.6

20 Wpływ dokładności pomiaru masy na liczbę możliwych wzorów sumarycznych Elements: C12:20 H1:30 N14:4 16:6 S32:l Tolerance window: 2 mmu (ok. 8 ppm) Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:10 H:16 N:2 :4 S:l -.7 C:16 H:10 N:3 :l S:0.7 C:18 H:12 N:0 :2 S:0 Elements: C12:20 H1:30 N14:4 16:6 S32:l Tolerance window: 5 mmu (ok. 19 ppm) Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:5 H:16 N:4 :6 S:l.0 C:10 H:16 N:2 :4 S:l -3.4 C:13 H:12 N:2 :4 S:0 2.7 C:13 H:14 N:3 :1 S:l 4.0 C:15 H:16 N:0 :2 S:l -.7 C:16 H:10 N:3 :1 S:0.7 C:18 H:12 N:0 :2 S:0

21 Wpływ wyboru pierwiastków na liczbę możliwych wzorów sumarycznych Elements: C12:12 H1:30 N14:4 16:4 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:10 H:16 N:2 :4 S:l Elements: C12:16 H1:30 N14:4 16:4 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:10 H:16 N:2 :4 S:l -3.4 C:13 H:12 N:2 :4 S:0 2.7 C:13 H:14 N:3 :1 S:l 4.0 C:15 H:16 N:0 :2 S:l -.7 C:16 H:10 N:3 :1 S:0 Elements: C12:16 H1:30 N14:4 16:4 Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:13 H:12 N:2 :4 -.7 C:16 H:10 N:3 :1 Elements: C12:20 H1:20 16:2 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) C:15 H:16 :2 S:l.7 C:18 H:12 :2 S:0

22 Porównanie profilu izotopowego zmierzonego i obliczonego Widmo zmierzone Intensity (%age) Low Resolution M/z Intensity (%age) Widmo obliczone dla składu: C 35 H 38 F 6 N 2 5 Ru Mass

23 4. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów (w EI), stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego, stwierdzenie wzajemnej niezgodności widm jonów dodatnich i ujemnych.

24 Badanie zachowania próbki podczas parowania w źródle jonów EI

25 3. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI, badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej (CID), dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych, wymiana izotopowa, otrzymywanie i badanie pochodnych, identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm.

26 SPEKTRMETR MAS TYPU API 365

27 KLASYFIKACJA PDSTAWWYCH TYPÓW FRAGMENTACJI PRTNWANEG ŁAŃCUCHA PEPTYDWEG H 2 N CH C R x n y n +2H NH z n CH R C (...) NH CH R x 1 C y 1 +2H NH CH 1 2 n n+1 z 1 R C H + H + +2H +2H a 1 b 1 c 1 a n b n c n

28 Ustalanie sekwencji peptydu na podstawie widma ESI-CID-MS Μ = 129,03 Glu Spektrometr: Finnigan MAT LCQ J.R. Yates III, J. Mass Spectrom., 33, 1 (1998)

29 Problemy związane z techniką GC/MS Problemy aparaturowe Chromatograf gazowy Spektrometr mas Próbka w formie pary rozcieńczonej dużą ilością gazu EI: praca w wysokiej próżni CI: konieczność użycia gazu jonizującego ESI: wprowadzanie próbki w roztworze APCI: wprowadzanie próbki w roztworze rozpuszczalnika odpowiedniego do CI Problemy do rozwiązania: pozbycie się dużej ilości gazu nośnego szybkie skanowanie graniczenia dotyczące próbki Lotność (ew. po derywatyzacji) dporność na wysoką temperaturę

30 Budowa zestawu chromatograf gazowy spektrometr mas (GC/MS) strzykawka z próbką komora termostatowana kolumna kapilarna źródło jonów linie transmisji danych hel Chromatograf gazowy Spektrometr mas Komputer

31 SPEKTRMETR MAS Z ANALIZATREM KWADRUPLWYM Źródło jonów EI Analizator kwadrupolowy Detektor do pompy do pompy sygnał do wzmacniacza

32 Pomiar GC/MS mieszaniny wzorcowej Abundance TIC: EVALDEM.D Time--> Abundance Average of to min.: EVALDEM.D (-) m/z-->

33 Identyfikacja związku z wykorzystaniem biblioteki widm masowych Abundance 9000 Average of to min.: EVALDEM.D (-) 188 Widmo zmierzone m/z--> Abundance Widmo biblioteczne #72704: 3-Chlorobiphenyl $$ 1,1'-Biphenyl, 3-chloro- (CAS) Cl m/z-->

34 Chromatogram gazowy mieszaniny nitrotoluenów N HN 3 H 2 S N 2 N

35 Chromatogram GC/MS olejku cytrynowego. Składniki zidentyfikowano na podstawie biblioteki widm Wiley a α-pinen (96 %) 2.33 β-pinen (97 %) 3.17 sabinen (97 %) mircen 3.33 (96 %) limonen (99 %) γ-terpinen (97 %) 5.82 linalool (97 %) octan linalylu (91 %) α-bergamoten (98 %) β-kariofilen (99 %) p-cymen (97 %) α-terpinolen (98 %) β-bisabolen (95 %) Z-cytral (97 %) α-terpineol (91 %) geranial (96 %) octan geranylu (91 %) min.

36 Zastosowania techniki GC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Analiza produktów naturalnych (np. olejki zapachowe) Badania reakcji chemicznych w fazie gazowej Identyfikacja zanieczyszczeń w lekach, kosmetykach, artykułach spożywczych itp. Analizy medyczne (np. profil kwasowy) Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska

37 Problemy związane z techniką LC/MS Problemy aparaturowe Chromatograf cieczowy Spektrometr mas Próbka w formie rozcieńczonego roztworu, często z zawartością bufora Problemy do rozwiązania: EI: praca w wysokiej próżni CI: konieczność użycia gazu jonizującego ESI: wprowadzanie próbki w roztworze APCI: wprowadzanie próbki w roztworze rozpuszczalnika odpowiedniego do CI konieczność odparowania dużej ilości rozpuszczalnika problem substancji buforujących szybkie skanowanie graniczenia dotyczące próbki Niska lotność Rozpuszczalność w wybranym rozpuszczalniku (eluencie) Trwałość w warunkach HPLC

38 ANALIZA ZANIECZYSZCZEŃ DIGKSYNY TECHNIKĄ LC/MS H H H H H H ICh PAN WARSZAWA

39 ANALIZA DIGKSYNY Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H H Widmo ESI(-) digoksyny w układzie MeH-CHCl 3. Jon pseudomolekularny [M + Cl] - ulega fragmentacji tracąc kolejne reszty cukrowe i zachowując jon Cl -. H -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff Max. 2.6e6 cps. 2.6e H H H H = = = e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6 1.4e = e6 1.0e e e5 4.0e ICh PAN WARSZAWA 2.0e m/z, amu

40 ANALIZA DIGKSYNY Chromatogram całkowitego prądu jonowego Intensity, cps TIC of -Q1: from CH3ClDigoxin.wiff 3.1e8 3.0e8 2.8e8 2.6e8 2.4e8 2.2e8 2.0e8 1.8e8 1.6e8 1.4e8 1.2e8 1.0e8 8.0e7 6.0e7 4.0e7 2.0e Max. 3.1e8 cps Time, min XIC of -Q1: to amu from CH3ClDigoxin.wiff, Added <XIC of -Q1: to amu fro... Max. 8.4e7 cps. Chromatogram prądu jonowego wybranych jonów (jony [M+Cl] - digoksyny i acetylodigoksyny) ICh PAN WARSZAWA Intensity, cps 8.4e7 8.0e7 7.5e7 7.0e7 6.5e7 6.0e7 5.5e7 5.0e7 4.5e7 4.0e7 3.5e7 3.0e7 2.5e7 2.0e7 1.5e7 1.0e7 5.0e Time, min

41 Widma masowe ESI(-) digoksyny (M = 780,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 Digoksyna Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H H H H H = = = = H H 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e m/z, amu -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 Pochodna acetylowa digoksyny [MAc + Cl] - M = Max. 1.5e6 cps. 5.0e5 4.0e5 3.0e ICh PAN WARSZAWA 2.0e5 1.0e m/z, amu

42 Widma masowe ESI(-) digoksyny (M = 780,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 Digoksyna Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H H Ac H H = = H H = = e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e m/z, amu -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 Pochodna acetylowa digoksyny [MAc + Cl] - M = Max. 1.5e6 cps. 5.0e5 4.0e5 3.0e ICh PAN WARSZAWA 2.0e5 1.0e m/z, amu

43 Widma masowe ESI(-) digoksyny (M = 780,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 Digoksyna Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H Ac H H H = = H H = = e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e m/z, amu -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 Pochodna acetylowa digoksyny [MAc + Cl] - M = Max. 1.5e6 cps. 5.0e5 4.0e5 3.0e ICh PAN WARSZAWA 2.0e5 1.0e m/z, amu

44 Zastosowania techniki LC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Analiza białek i produktów ich hydrolizy enzymatycznej Identyfikacja zanieczyszczeń w lekach, kosmetykach, artykułach spożywczych itp. Analizy medyczne (np. oznaczanie stężenia leków i ich metabolitów we krwi) Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska

45