Techniki immunochemiczne. opierają się na specyficznych oddziaływaniach między antygenami a przeciwciałami

Transkrypt

1 Techniki immunochemiczne opierają się na specyficznych oddziaływaniach między antygenami a przeciwciałami

2 Oznaczanie immunochemiczne RIA - ( ang. Radio Immuno Assay) techniki radioimmunologiczne EIA - (ang. Enzyme Immuno Assay) techniki immunoenzymatyczne ELISA - (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test immunoenzymosorbcyjny Immunoblotting (Western blotting) Immunostrącanie Chromatografia immunopowinowactwa

3 Metody immunochemiczne

4 ELISA

5 TYPY TESTU ELISA Bezpośredni Pośrednie

6 Schemat reakcji ELISA wykonywanych na ćwiczeniach

7 Techniki chromatograficzne (rozdzielcze) - chromatografia gazowa (GC) - - nisko- i wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) - - elektroforeza kapilarna (CE) -

8 Zastosowanie metod chromatograficznych w analizie materiału biologicznego Każdy układ biologiczny jest mieszaniną substancji chemicznych. Analiza poszczególnych składników takiego układu wymaga często ich wcześniejszego rozdzielenia. Termin chromatografia oznacza efekt rozdziału (separacji) składników mieszaniny, obserwowany podczas ich przepływu z fazą ruchomą wzdłuż powierzchni fazy nieruchomej (stacjonarnej). Cząsteczki składników mieszaniny, które słabo oddziałują z fazą nieruchomą, są szybciej unoszone przez płynącą fazę ruchomą, zaś cząsteczki przyciągane mocniej poruszają się wolniej. Fazą stacjonarną może być ciało stałe, ciecz na stałym nośniku lub żel, a fazą ruchomą może być gaz lub ciecz. kolumna chromatograficzna

9 Przykładowe rodzaje metod chromatograficznych: Ekstrakcja z fazy stałej (SPE) Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) Chromatografia gazowa (GC) Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) Elektroforeza kapilarna (CE) Każdy proces chromatograficzny składa się z trzech etapów: dozowanie próbki rozdział składników detekcja rozdzielonych składników detektor

10 Wysokosprawna (wysokociśnieniowa) chromatografia cieczowa (HPLC)

11 Zestaw do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej Od prawej: komputer sterujący aparatem i rejestrujący dane, pompa z zaworem dozującym, kolumna wewnątrz termostatu i różnego rodzaju detektory rozdzielanych substancji, np. UV-vis, fluorescencyjny, MS-MS.

12 HPLC

13 Przykładowy chromatogram uzyskany metodą HPLC (detektor fluorescencyjny)

14 HPLC - rozdział składników Kolumny chromatograficzne

15 HPLC dozowanie próbki

16 HPLC - detekcja składników

17 HPLC - detekcja składników

18 Chromatografia gazowa - GC

19 Chromatografia gazowa - GC

20 RESET Chromatografia gazowa - GC H Gas Carrier Hydrogen Air

21 Chromatogram GC składników soku z pomarańczy

22 Wpływ warunków termicznych na rozdział w GC Warunki rozdziału: (a) izotermiczny w 45 o C (b) izotermiczny w 145 o C (c) programowany w 30 o C do 180 o C

23 Kolumna GC dozowanie próbki

24 Kolumny kapilarne stosowane w chromatografii gazowej

25 Przekroje kolumn do GC w powiększeniu

26 Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych Najbardziej znanym typem faz stacjonarnych są polisiloksany. Każdy atom krzemu w łańcuchu zawiera dwie grupy funkcyjne. Typ i ilość grup decyduje o właściwościach fazy stacjonarnej, a tym samym kolumny. Poli(dimetylosiloksan) Poli(35% - difenylo- 65% dimetylosiloksan)

27 GC - detekcja składników - FID

28 Flow Flow GC - detekcja składników - TCD Uniwersalny detektor cieplno-przewodnościowy (TCD) Drut oporowy wewnątrz detektora jest chłodzony przez przepływający gaz nośny Kiedy w gazie nośnym pojawia się inna substancja, właściwości chłodzące gazu nośnego się zmieniają. Generuje to powstawanie sygnału w detektorze

29 Techniki łączone

30 Zastosowanie instrumentalnych technik analitycznych do detekcji w chromatografii gazowej i HPLC (techniki łączone) Chromatograf Spektrometr mas Spektrometr podczerwieni Spektrometr absorpcji atomowej Jądrowy rezonans magnetyczny - HPLC-MS, GC-MS - HPLC-IR, GC-IR - HPLC-AAS, GC-AAS - HPLC-NMR, GC-NMR Techniki instrumentalne nie tylko wykrywają obecność substancji, ale również dokonują jej analizy, przez co potwierdzają autentyczność mierzonej substancji w danym szczycie sygnału.

31 Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas

32

33 Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas - Detektor wykonuje co sekundę widmo masowe (skan) wycieku z kolumny. - Analizowane są jony o masach większych niż jony gazu nośnego. - Każda substancja ma charakterystyczne dla siebie widmo mas.

34 Analizy jakościowa i ilościowa w GC i HPLC

35 Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC Czas, w którym substancja przechodzi przez kolumnę nazywany jest czasem retencji (t R ). Czas retencji przypisany jest pikowi odpowiadającemu danej substancji. Jest to więc podstawowy parametr identyfikujący substancję w analizie GC i HPLC.

36 Tematy ćwiczeń Zadanie 1. Wykrywanie wirusa pelargonii PFBV metodą immunoenzymatyczną. Zadanie 2. Oznaczanie zawartości witaminy C w sokach z warzyw i owoców metodą HPLC. Zadanie 3. Oznaczanie produkcji etylenu przez rośliny metodą GC-FID. Zadanie 4. Analiza jakościowa auksyn metodą GC-MS.