IDENTYFIKACJA SUBSTANCJI W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

Transkrypt

1 IDENTYFIKACJA SUBSTANCJI W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Prof. dr hab. inż. Agata Kot-Wasik, prof. zw. PG agawasik@pg.gda.pl 11

2 Rozdzielenie + detekcja 22

3 Anality ZNANE Co oznaczamy? Anality NOWE NIEZNANE WWA Farmaceutyki Pestycydy Metabolity farmaceutyków POP s Związki perfluorowane Polimery Związki endokrynne Substancje słodzące Produkty degradacji POP s Witaminy Dopalacze Białka Kwasy tłuszczowe 3

4 ANALIZA CELOWANA ZNANE ANALITY analiza porównawcza IDENTYFIKACJA ANALIZA POŚREDNIA ZNANE ANALITY analiza bez wzorców ANALIZA NIECELOWANA NIEZNANE ANALITY identyfikacja analitów 4

5 IDENTYFIKACJA ANALIZA CELOWANA ZNANE ANALITY analiza porównawcza 5

6 IDENTYFIKACJA 1. Przygotować roztwór wzorcowy analitu Mcz, wzór sumaryczny, wzór strukturalny, rozpuszczalność, widma UV, IR, MS 6

7 IDENTYFIKACJA 1. Przygotować roztwór wzorcowy analitu 2. Analiza HPLC: wyznaczenie czasu retencji 7

8 IDENTYFIKACJA 1. Przygotować roztwór wzorcowy analitu 2. Analiza HPLC: wyznaczenie czasu retencji 3. Analiza HPLC (próbka) 4. Analiza HPLC (próbka)? 5. Porównanie czasu retencji 6. Identyfikacja na podstawie czasu retencji 8

9 IDENTYFIKACJA 9

10 IDENTYFIKACJA 10

11 Przykład Analiza HPLC: Wzorzec 25B-NBOMe IS 4-CMC Analiza HPLC: Próbka IS 25B-NBOMe 4-CMC 11

12 Przykład próbka wzorzec 445,4 410,4 445,4 410,4 445,4 427,3 445,4 427,3 12

13 Przykład próbka wzorzec 445,4 410,4 445,4 410,4 445,4 427,3 ttet = 5,82min 445,4 427,3 ttet = 5,81min 13

14 Przykład próbka wzorzec Czas retencji t r 2*t 0 445,4 410,4 445,4 410,4 Względny (skorygowany) czas retencji: trrt in GC ± 0.5%; trrt in LC ±2.5% (Commision Decision 2002/657/EC) 445,4 427,3 445,4 427,3 Kryterium: 2% or 0.10 min dla LC i GC WADA Executive Committee WADA TD2010IDCR World Anti-Doping Agency - WADA 14

15 KRYTERIA IDENTYFIKACJI Czas retencji t r 2*t 0 Względny (skorygowany) czas retencji: trrt in GC ± 0.5%; trrt in LC ±2.5% (Commision Decision 2002/657/EC) Kryterium: 2% or 0.10 min dla LC i GC WADA Executive Committee WADA TD2010IDCR 15

16 STABILNY CZAS RETENCJI 16

17 STABILNY CZAS RETENCJI 17

18 STABILNY CZAS RETENCJI Wymagane stabilizowanie temperatury kolumny chromatograficznej 18

19 Identyfikacja próbka Sa mp le 1 Sa mp le Sa 1 mp le 1 Analiza chromatograficzna 19

20 Identyfikacja próbka Sa mp le 1 Sa mp le Sa 1 mp le 1 Analiza chromatograficzna 20

21 Przykład? Czas [min] 21

22 WIDMO ABSORPCYJNE Chromofor Analiza jakościowa (identyfikacja) Długość fali [nm] 22

23 Absorpcja światła IDENTYFIKACJA 23

24 Widma absorpcyjne 24

25 Absorpcja światła stewiozyd 25

26 Absorpcja światła 26

27 Absorpcja światła 27

28 Absorpcja światła 28

29 WIDMO FLUORESCENCYJNE 29

30 WIDMO FLUORESCENCYJNE 30

31 KOELUCJA? 31

32 32

33 CHROMATOGRAM 3D 33

34 IDENTYFIKACJA ANALIZA POŚREDNIA ZNANE ANALITY analiza bez wzorców 34

35 IDENTYFIKACJA ANALIZA POŚREDNIA ZNANE ANALITY analiza bez wzorców ANALIZA NIECELOWANA NIEZNANE ANALITY identyfikacja analitów 35

36 IDENTYFIKACJA ANALIZA POŚREDNIA ZNANE ANALITY analiza bez wzorców ANALIZA NIECELOWANA NIEZNANE ANALITY identyfikacja analitów 36

37 WIDMA MS 37

38 Jednowymiarowa spektrometria mas 38

39 IDENTYFIKACJA ZWIĄZKU WIDMO MS dla Diklofenaku C14H11Cl2NO2 Mw = 295,

40 IDENTYFIKACJA ZWIĄZKU WIDMO MS dla Diklofenaku C14H11Cl2NO2 Mw = 295,0167 Jony fragmentacyjne Jon molekularny 40

41 Tandemowa spektrometria mas 41

42 Tandemowa spektrometria mas 42

43 Analizator czas przelotu Q TOF 43

44 KRYTERIA IDENTYFIKACJI minimum 3 punkty identyfikacyjne (ang. identification points IP) Commision Decision 2002/657/E L 221/8 Official Journal of the European Communities (2002/657/EC) 44

45 KRYTERIA IDENTYFIKACJI Technika IP LC-MS 1 SIM 1 LC-MS/MS 1 za jon 1.5 za przejście SRM (1 jon prekursor 1 jon produkt fragmentacji) SRM (1 jon prekursor 2 jony produkty fragmentacji) ion in full SCAN 2 2 za jon 2.5 za przejście MS/MS (1 jon prekursor 1 jon produkt fragmentacji) 4.5 MS/MS (1 jon prekursor 2 jony produkt fragmentacji) 7.5 LC-Q TOF MS IP uzyskane 45

46 Chromatogram EIC: 25B-NBOMe (C18H22BrNO3): UPLC QTOF-MS Ascentis Express C18 (10 cm x 4,6 mm, dp = 2,7 μm) mobile phase: water with 0,01% FA and ACN with 0,01% FA, gradient column temperature: 40 C; mobile phase flow rate: 0.3 ml/min ESI 120V masa zmierzona: m/z; masa teoretyczna [M + H]: m/z 46

47 KRYTERIA IDENTYFIKACJI Dokładność wyznaczenia masy min. 4 miejsca po przecinku Błąd wyznaczenia masy < 2 (7) ppm Rozdzielczość w MS > FWHM 47

48 MS/MS dla m/z =

49 MS/MS dla m/z = B-NBOMe 380,0 121,2 i 380,00 91,10 49

50 MS/MS dla m/z = B-NBOMe 380,0 121,2 i 380,00 91,10 Analiza ilościowa Potwierdzenie identyfikacji 50

51 Przykład: identyfikacja tetracykliny Przejście w MRM: 445,4 410,4; 427,3 Standard Jakościowa analiza 445,4 410,4 Ilościowa analiza 445,4 427,3 51

52 Stosunek intensywności dla wybranych jonów m/z (MS) lub dla wybranych przejść (MS/MS) musi być stały i w zakresie do 20% 445,4 427,3 Wzorzec Próbka 445,4 427,3 445,4 410,4 445,4 410,4 MRM dla tetracykliny (wzorzec): 1,28 MRM dla tetracykliny w próbce: 1,26 52

53 KRYTERIA IDENTYFIKACJI Dokładność wyznaczenia masy min. 4 miejsca po przecinku Błąd wyznaczenia masy < 2 (7) ppm Rozdzielczość w MS ALE: Q-TOF MS m/z=329,0001 Q-TOF MS/MS 328,5 329,5 (okno detekcji ~ 1Da) > FWHM 53

54 Dokładność 54

55 PROFIL IZOTOPOWY 25B-NBOMe CH3 H3C O O NH Br O CH3 55

56 ANALITYCZNE WYZWANIA Wyniki tzw. FAŁSZYWIE POZYTYWNE False positive result (niewystarczająca selektywność problem chromatograficzny) Wyniki tzw. FAŁSZYWIE NEGATYWNE False negative result (tłumienie jonizacji problem detekcji MS) 56 56

57 WYNIKI FAŁSZYWIE POZYTYWNE Identyfikacja związku: ANALIZA JAKOŚCIOWA 1. Zgodność czasu retencji 2. Wykluczenie koelucji 3. Dokładność wyznaczenia masy / Rozdzielczość MS 57 57

58 Porównanie widm Widmo MS dla roztworu wzorca Widmo MS dla próbki 58

59 Przykład trudności w identyfikacji Metabolit kokainy Atropina C16H19NO4 C17H23NO3 Mw = Mw = [M+H]+= [M+H]+=

60 WYKLUCZENIE KOELUCJI Czystość piku: zgodność widm MS Wzorzec Próbka A B C 60

61 WYKLUCZENIE KOELUCJI Czystość piku: zgodność widm MS Wzorzec Próbka A B C 61

62 WYNIKI FAŁSZYWIE NEGATYWNE 20% 22% 50% 55% M.D. Hernandoa et all J.Chromatogr.A., 1046, (2004)

63 TŁUMIENIE SYGNAŁU MS 20% 22% 50% 55% M.D. Hernandoa et all J.Chromatogr.A., 1046, (2004)

64 EFEKTY MATRYCOWE Stosowanie wzorców wewnętrznych (deuterowanych lub znaczonych izotopowo) Krzywa kalibracyjna z odwzorowaniem matrycy 64

65 Co dalej? Prof. dr hab. inż. Agata Kot-Wasik, prof. zw. PG 65 65