CHROMATOGRAFIA BARWNIKÓW ROŚLINNYCH

Transkrypt

1 POLITECHNIKA ŁÓDZKA INSTRUKCJA Z LABORATORIUM W ZAKŁADZIE BIOFIZYKI Ćwiczenie 1 CHROMATOGRAFIA BARWNIKÓW ROŚLINNYCH

2 I. Wiadomości teoretyczne W wielu dziedzinach nauki i techniki spotykamy się z problemem wykrycia, rozdziału i wyodrębnienia poszczególnych składników wchodzących w skład złożonych mieszanin i zadajemy sobie pytanie jak to zrobić? Jednym ze sposobów jest zastosowanie chromatografii. Chromatografia jest to metoda chemicznej analizy instrumentalnej, w której dokonuje się podziału substancji (w przeciwprądzie) między fazę nieruchomą i fazę ruchomą. Fazę nieruchomą może stanowić bibuła filtracyjna, cienka warstwa adsorbentu naniesiona na płytkę lub wypełnienie kolumny. Fazę ruchomą stanowi natomiast roztwór ciekły (chromatografia cieczowa) lub gazowy (chromatografia gazowa). W metodzie tej wykorzystywana jest: 1) różnica w zdolności adsorpcyjnej fazy stacjonarnej względem różnych składników znajdujących się w fazie ruchomej; 2) różnica wielkości współczynnika podziału składników rozdzielanych; 3) różnica wielkości cząsteczek separowanych składników; 4) zatrzymywanie jonów na podłożu jonitowym. Stopień rozdziału można zwiększyć dobierając zarówno odpowiedni rozpuszczalnik (eluent), jak i substancję tworzącą fazę stacjonarną. Obraz analizy chromatograficznej otrzymany bezpośrednio w fazie stacjonarnej (np. barwne plamy w chromatografii bibułowej pochodzące od poszczególnych składników) lub wykres przedstawiający wyniki analizy w postaci pików odpowiadających rozdzielanym składnikom (uzyskany dzięki zastosowaniu odpowiedniego detektora) nosi nazwę chromatogramu. 1

3 Chromatografia może być stosowana do badań jakościowych, ilościowych i dla celów preparatywnych. Sprzężenie chromatografii gazowej z innymi metodami, np. spektrometrią masową lub spektrofotometrią w podczerwieni, znacznie rozszerza możliwości identyfikacji rozdzielanych składników badanej próbki. Dla zobrazowania podziału chromatografii przedstawiono rysunek 1. Rys.1. Uproszczona klasyfikacja rodzajów chromatografii. 2

4 II. Opis budowy stanowiska Przygotowane stanowisko (rysunek 2) składa się: ze statywu, uchwytu do zamocowania kolumny, kolumny (którą tworzy strzykawka szklana po usunięciu tłoka), zlewki (znajdującej się u wylotu z kolumny). Do przeprowadzenia samego doświadczenia konieczne także będą: moździerz (do przygotowania ekstraktu), dwa naczynia szklane (w tym jedno z podziałką do odmierzania składników), skrobia, bibuła filtracyjna, nożyczki, łyżeczka, odczynniki, a także stoper. Rys.2. Schemat stanowiska. III. PRZEBIEG ĆWICZENIA 1. Przygotowanie ekstraktu barwników roślinnych 2g liści utrzeć w moździerzu porcelanowym. Dodać 2 ml mieszaniny eter naftowy-etanol w stosunku 98:10, a następnie przesączyć przez zwilżoną eterem naftowym bibułę filtracyjną do suchej probówki. 3

5 2. Przygotowanie rozwijacza chromatograficznego Przygotować 15 ml rozwijacza mieszaniny eter naftowy : etanol : eter etylowy w stosunku 93:2:5 3. Przygotowanie kolumny Na dnie szklanej strzykawki umieścić odpowiednio dopasowany krążek bibuł. Następnie wsypać małymi porcjami skrobię, lekko ubijając przez potrząsanie strzykawką (wysokość kolumny około 4/5 wysokości strzykawki). Na górnej powierzchni umieścić kolejny krążek bibuły. Powoli wlać do strzykawki 10 ml eteru naftowego tak, aby nie wzburzyć górnej powierzchni skrobi i aby warstwa cieczy nad powierzchnią skrobi stale wynosiła około 0,5 cm. Przemywanie kolumny można zakończyć z chwilą, gdy nadmiar rozpuszczalnika zaczyna wypływać u dołu strzykawki. Bezwzględnie należy pamiętać o niedopuszczeniu do zapowietrzenia złoża kolumny (skrobi). 4. Rozwijanie chromatogramu Przesączony wyciąg z liści wprowadzić na kolumnę i uruchomić stoper. Gdy cały wyciąg z górnej warstwy zaadsorbuje się złożu, rozpocząć dodawanie małych porcji rozwijacza. W tabeli należy odnotowywać uwidaczniające się na złożu barwne pasy poszczególnych barwników oraz czas obserwacji. 4

6 L.p. Kolor paska Czas [min.] Uwagi Powyższą tabelę należy dołączyć do sprawozdania. 5

7 IV. SPRAWOZDANIE POWINNO ZAWIERAĆ 1. Krótki wstęp teoretyczny. 2. Cel przeprowadzonego ćwiczenia. 3. Tabelę z wynikami pomiarów i obserwacjami. 4. Dyskusję i wnioski. V. PYTANIA KONTROLNE 1. Pojęcie chromatografii. 2. Rodzaje chromatagrafii. 3. Z czym związany jest podział chromatografii. 4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa. LITERATURA 1. B.Walkowiak - Techniki chromatografii cieczowej - przykłady zastosowań; Amersham Pharmacia Biotech 2. Z.Witkiewicz Podstawy Chromatografii; Wydawnictwa Naukowo Techniczne; Warszawa 1992r. 3. R.J. Hamilton Wysokosprawna Chromatografia Cieczowa; Państwowe Wydawnictwo Naukowe; Warszawa 1982r. 4. F. Kasprzak, B. Klimek, H. Kwapińska Chromatografia Barwników; Wydawnictwa Naukowo Techniczne; Warszawa 1969r. 5. R. Rosset, H. Kołodziejczyk Współczesna Chromatografia Cieczowa, Ćwiczenia i Zadania; Wydawnictwo Naukowe PWN; Warszawa 2001r. 6. W. Szczepaniak Metody Instrumentalne w Analizie Chemicznej; Państwowe Wydawnictwo Naukowe; Warszawa 1979r. 6