WYZNACZANIE ZAKRESU WYKLUCZANIA DLA WYPEŁNIEŃ STOSOWANYCH W WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII WYKLUCZANIA (HPSEC)

Transkrypt

1 WYZNACZANIE ZAKRESU WYKLUCZANIA DLA WYPEŁNIEŃ STOSOWANYCH W WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII WYKLUCZANIA (HPSEC) 1. Wprowadzenie Chromatografia wykluczania (Size-Exclusion Chromatography (SEC)), zwana również chromatografią żelową (Gel Permeation Chromatography (GPC)) jest techniką, znajdującą zastosowanie głównie w analizie związków wielkocząsteczkowych. Wypełnienia stosowane w chromatografii wykluczania składają się z małych (ok mikrometrów) ziaren krzemionki lub polimerów zawierających sieć jednolitych porów, do wnętrza których mogą dyfundować cząsteczki badane i cząsteczki eluenta. Molekuły zostają,,uwięzione'' w porach wypełnienia, a następnie z nich usunięte przez przepływającą przez kolumnę fazę ruchomą (eluent). Średni czas przebywania cząsteczek w porach zależy od ich efektywnych wielkości. Cząsteczki o rozmiarach większych niż średnice porów wypełnienia zostają wykluczone i właściwie nie obserwujemy dla nich retencji. Cząsteczki te nie penetrują ziaren wypełnienia i jako pierwsze pojawiają się w wycieku. Cząsteczki o średnicach dużo mniejszych niż pory wypełnienia mogą penetrować labirynt porów i w ten sposób są zatrzymywane na dłuższy czas - cząsteczki te są eluowane jako ostatnie. Pomiędzy tymi dwoma ekstremami znajdują się cząsteczki o pośrednich wielkościach, których średnia długość czasu przebywania w porach wypełnienia zależy od ich średnic (rys. 1). Dla grupy tej rozdział jest bezpośrednio związany z wielkością cząstek i w pewnym stopniu z ich kształtem. Rys. 1. Migracja cząstek o różnych wielkościach przez porowate wypełnienie kolumny Należy podkreślić, że w chromatografii wykluczania nie zachodzą żadne chemiczne ani fizyczne oddziaływania pomiędzy fazą stacjonarną a analizowanymi substancjami. W praktyce czynione są wysiłki prowadzące do uniknięcia tego typu 1

2 oddziaływań ponieważ prowadzą one do obniżenia sprawności kolumn. W przeciwieństwie do innych rodzajów chromatografii, w chromatografii wykluczania istnieje górny limit czasu retencji, ponieważ nie ma takich cząsteczek, które pozostawałyby dłużej w kolumnie od cząsteczek całkowicie penetrujących fazę stacjonarną (przy założeniu braku zjawisk np. adsorpcji, rozpuszczania). 2. Wypełnienia kolumn. W chromatografii wykluczania spotykamy dwa typy wypełnień oparte na: tzw. perełkach polimerowych oraz na ziarnach krzemionki. Ziarna obydwu stosowanych wypełnień mają średnice od 5 do 10 µm. Wypełnienia stosowane w chromatografii wykluczania pozwalają na efektywny rozdział cząsteczek o bardzo szerokim zakresie ciężarów cząsteczkowych. Wśród zalet wypełnień krzemionkowych należy wymienić: - dużą sztywność, dzięki której łatwiej upakowuje się wypełnienie oraz możliwe jest stosowanie wysokich ciśnień; - stabilność pozwalającą na stosowanie szerokiej gamy rozpuszczalników, włączając wodę (brak pęcznienia); - szybką stabilizację przy zmianie rozpuszczalnika; - stabilność w wysokich temperaturach. Wadą wypełnień krzemionkowych jest: - tendencja do adsorpcji analizowanych cząsteczek; - duży potencjał katalizowania degradacji badanych cząsteczek. Początkowo chromatografia wykluczania opierała się na wypełnieniach typu miękkie żele (np. usieciowane dekstrany, żele agarozy). Obecnie najpopularniejsze są wypełnienia z usieciowanych kopolimerów styrenu i diwinylobenzenu o strukturze zbliżonej do usieciowanych polistyrenowych żywic jonowymiennych (rys. 2). Rys.2. Budowa cząsteczki usieciowanego polistyrenu 2

3 Wielkości porów wymienionych polimerów kontrolowane są stopniem usieciowania, a więc relatywną zawartością diwinylobenzenu, obecną podczas wytwarzania wypełnienia. Dostępne są wypełnienia polimerowe o różnych średnich wielkościach porów. Oryginalnie, żele styrenowo-diwinylobenzenowe były hydrofobowe i z tego względu mogły być stosowane jedynie z niewodnymi fazami ruchomymi. Obecnie dostępne są również żele hydrofilowe, umożliwiające stosowanie wodnych eluentów do rozdziału wielkocząsteczkowych, rozpuszczalnych w wodzie molekuł, np. cukrów. Do grupy tej należą przede wszystkim sulfonowane diwinylobenzeny i poliakryloamidy. Dostępne w sprzedaży są również wypełnienia z żeli krzemionkowych oraz ze szkła o kontrolowanej porowatości, o porach z zakresu Å. W celu usunięcia oddziaływań adsorpcyjnych, powierzchnie tych wypełnień są często modyfikowane w reakcjach z organicznymi podstawnikami. Poniżej zaprezentowano strukturę przykładowego wypełnienia hydrofilowego: OH OH Si CH 2 O CH 2 CH 2 CH 2 CH CH 2 W tabeli 1 zebrano własności kilku typowych, komercyjnych wypełnień do SEC. Rodzaj wypełnienia Kopolimer polistyrenu i diwinylobenzenu Wielkość ziaren wypełnienia [µm] Średnia wielkość porów [Å] Masa cząsteczkowa będąca granicą wykluczania (0.1-20)x (1-20)x (1-20)x10 5 Krzemionka (5-10)x (0.2-5)x (0.03-1)x (0.05-5)x (5-20)x10 5 3

4 3. Podstawy teoretyczne chromatografii wykluczania Wśród metod chromatograficznych, chromatografia wykluczania zajmuje specyficzne miejsce (rys. 3). W przeciwieństwie do technik klasycznych (np. GC, HPLC) całkowity rozdział analizowanych substancji zachodzi w tzw. czasie martwym (zerowym) retencji t m. Ma to bezpośredni związek z brakiem fizycznych i chemicznych oddziaływań miedzy fazą stacjonarną i analitem. Decyduje również o krótkim czasie analizy, czego konsekwencją jest ograniczona ilość pików na chromatogramach. SEC Chromatografia klasyczna (np. GC, HPLC) nastrzyk t m Rys. 3. Miejsce chromatografii wykluczania wśród metod chromatograficznych. Całkowitą objętość kolumny V t upakowanej porowatym polimerem lub żelem krzemionkowym przedstawia równanie: V t = V g + V i + V o (1) gdzie: V g - objętość zajęta przez stałą matrycę żelu, V i - objętość porów = objętość eluentu zatrzymana wewnątrz porów żelu, V o objętość międzyziarnowa = wolna objętość kolumny na zewnątrz cząsteczek żelu. Zakładając brak zjawisk dyfuzji i mieszania, można przyjąć, że V o reprezentuje również teoretyczną objętość rozpuszczalnika niezbędną do przetransportowania przez kolumnę składników zbyt dużych by mogły wejść do wnętrza porów żelu. W rzeczywistości jednak, zjawiska dyfuzji i mieszania mogą zachodzić w układzie i w konsekwencji niezatrzymywane składniki pojawiać się będą w postaci pasma o kształcie krzywej Gaussa z maksimum stężenia przy V o. Dla cząsteczek dostatecznie małych aby mogły swobodnie penetrować wnętrze porów wypełnienia, maksimum piku pojawiać się będzie na wyjściu z kolumny, przy objętości eluentu odpowiadającej (V i + V o ). V i, V o i V g są wartościami tego samego rzędu wielkości; z tego względu kolumny z wypełnieniami żelowymi pozwalają na rozdzielenie dużych cząsteczek od małych w badanej próbce przy zużyciu minimalnej objętości eluenta. Cząsteczki o średnich rozmiarach mogą przenikać do tzw. frakcji K, czyli pewnej ilości rozpuszczalnika zatrzymanego wewnątrz porów. Objętość elucji V e dla tych zatrzymanych cząsteczek można obliczyć z równania: V e = V o + KV i (2) 4

5 Równanie (2) ma zastosowanie dla wszystkich rozpuszczonych cząsteczek znajdujących się w kolumnie. Dla cząsteczek zbyt dużych by mogły dostać się do wnętrza porów wypełnień żelowych K = 0 a V e = V o ; natomiast dla cząsteczek swobodnie przenikających do wnętrza porów K = 1 a V e = (V o + V i ). Przy wyprowadzaniu wzoru (2) założono brak wszelkich oddziaływań takich jak: adsorpcja zachodząca pomiędzy rozpuszczonymi cząsteczkami i powierzchnią żelu. Jeżeli zajdzie proces adsorpcji ilość międzyziarnowo zatrzymanych substancji rozpuszczonych będzie wzrastać. Dla małych cząsteczek K będzie zatem większe od jedności. Równanie (2) można przekształcić do postaci: K = (V e V o )/V i (3) gdzie K jest stałą rozkładu (dystrybucji) dla cząsteczek rozpuszczonych. Stała rozkładu jest cennym parametrem przy porównywaniu danych uzyskanych dla różnych wypełnień. Zakres mas cząsteczkowych, dla których następuje prawidłowy rozdział, dla wypełnień stosowanych w chromatografii wykluczania najlepiej ilustruje krzywa wzorcowa. Przykładową krzywą wzorcową prezentuje rys. 4a. Na krzywej masa cząsteczkowa, która jest bezpośrednio związana z wielkością analizowanych cząsteczek, przedstawiona jest w funkcji objętości retencji V R, gdzie V R jest iloczynem czasu retencji i przepływu (wyrażonego w jednostkach objętości). Skala na osi Y jest logarytmiczna. Granica wykluczania (exclusion limit) definiowana jest jako graniczny ciężar cząsteczkowy molekuł powyżej którego nie zachodzi retencja. Wszystkie cząsteczki mające większe masy cząsteczkowe od granicy wykluczania są tak duże, że nie są zatrzymywane w porach wypełnienia i wymywane są razem, dając sygnał w postaci piku A na chromatogramie przedstawionym na rys. 4b. Natomiast granica penetracji (permeation limit), odpowiada masie cząsteczkowej, poniżej której cząsteczki rozpuszczone mogą całkowicie penetrować pory wypełnienia. Wszystkie cząsteczki o masach mniejszych od granicy penetracji eluowane są wspólnie, dając sygnał w postaci piku D (rys. 4b). Pomiędzy granicami wykluczania i penetracji znajduje się selektywny zakres wykluczania (selective permeation region), w którym zachodzi frakcjonowanie analizowanych cząsteczek. Molekuły o masach z zakresu wykluczania penetrują pory wypełnienia i pojawiają się na chromatogramie w postaci pojedynczych pików (B i C na rys. 4b) o czasach retencji zależnych od ich wielkości. Krzywą kalibracji (podobną do hipotetycznej, przedstawionej na rys. 4) można wykonać eksperymentalnie przy użyciu odpowiednich standardów. Krzywe kalibracyjne często dołączane są do kolumn przez producentów. 5

6 Rys. 4. Krzywa kalibracyjna dla wypełnień stosowanych w chromatografii wykluczania. 4. Zastosowanie chromatografii wykluczenia Metody bazujące na chromatografii wykluczania podzielić można na filtrację żelową (gel filtration) i penetrację żelową (gel permeation). W pierwszej z metod 6

7 stosowane są rozpuszczalniki wodne i wypełnienia hydrofilowe może być zatem wykorzystywana do analizy próbek wodnych. Druga opiera się na niepolarnych, organicznych rozpuszczalnikach i wypełnieniach hydrofobowych i znajduje zastosowanie w analizie substancji rozpuszczalnych w słabo polarnych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia wykluczania znajduje zastosowanie: - w procedurze rozdziału wielkocząsteczkowych substancji pochodzenia naturalnego od związków niskocząsteczkowych i soli (np. wydzielenie protein z próbki zawierającej również aminokwasy i niskocząsteczkowe białka); - w rozdziale homologów i oligomerów; - w szybkim oznaczaniu mas cząsteczkowych i/lub rozkładu mas cząsteczkowych wielkocząsteczkowych polimerów i substancji pochodzenia naturalnego. (Tego typu analizy wymagają kalibracji przy pomocy standardów o podobnym charakterze chemicznym do analizowanych molekuł). Wśród najważniejszych zalet chromatografii wykluczania należy wymienić: - krótki i dobrze zdefiniowany czas rozdziału (wszystkie cząsteczki opuszczają kolumnę pomiędzy V o a (V o + V i )); - ostre piki świadczące o wysokiej czułości metody; - brak utraty próbki cząsteczki rozpuszczone nie reagują z fazą stacjonarną (wypełnieniem); - brak dezaktywacji kolumny powodowanej reakcjami pomiędzy analizowanymi cząsteczkami a wypełnieniem. Chromatografia wykluczania ma też pewne wady. Na chromatogramach może znajdować się jedynie ograniczona ilość pików, ponieważ czas analizy jest stosunkowo krótki. Metody wykluczania nie mogą być również stosowane w analizie próbek o zbliżonych wielkościach, np. izomerów ponieważ w celu uzyskania prawidłowego rozdziału wymagana jest ok. 10% różnica w masach cząsteczkowych analizowanych substancji. 5. Cel ćwiczenia Zapoznanie się z podstawami teoretycznymi chromatografii wykluczania Wykonanie krzywej kalibracji i wyznaczenie zakresu wykluczania dla stosowanej kolumny chromatograficznej Zastosowanie chromatografii wykluczania w analizie rozkładu mas cząsteczkowych materii organicznej obecnej w wodach naturalnych. 6. Zakres materiału wymagany przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia Wysokosprawna chromatografia wykluczania: - Podstawy teoretyczne metody, - Wypełnienia stosowane w chromatografii wykluczania, - Krzywa kalibracji, 7

8 - Zastosowanie chromatografii wykluczania. Zalecana literatura: - W. Szczepaniak Metody instrumentalne w analizie chemicznej Wydawnictwo Naukowe UAM - Skrypt (opis oparty na książce Principles of instrumental analysis ). 7. Sprzęt i odczynniki 1. Chromatograf cieczowy DIONEX DX-500 wyposażony w kolumnę ZORBAX Bimodal i detektor DIONEX AD25 (UV-VIS). 2. Warunki analizy: faza ruchoma bufor fosforanowy 0,01 M, ph=7,2, przepływ 1ml/min, λ=254 nm, objętość nastrzyku 100 µl 3. Wzorce chromatograficzne sole sodowe sulfonowanych polistyrenów (PSS Polymer Standards, Niemcy) o masach cząsteczkowych od daltonów 4. Naczyńka laboratoryjne o pojemności 20 ml 5. Bufor fosforanowy. 8. Sposób wykonania ćwiczenia 8.1. Przygotowanie serii wzorców Na wadze laboratoryjnej odważyć w naczyńkach po 1 mg wzorców, a następnie do każdego dodać 5 ml buforu fosforanowego. Wzorce należy dokładnie wymieszać. Obliczyć stężenia uzyskanych roztworów wzorcowych Wykonanie krzywej kalibracyjnej Uruchomić program PeakNet. Wybrać program RUN a następnie uruchomić metodę SEC7_254. Po ustaleniu się linii bazowej, przy pomocy dobrze wypłukanej buforem strzykawki, nastrzykiwać kolejno przygotowane wzorce. Po zakończeniu każdej z analiz wydrukować otrzymany chromatogram oraz tabelkę zawierającą czasy retencji, pola powierzchni i wysokości pików. W oparciu o czasy retencji pików (t R =V R ) uzyskane dla wzorców o znanych masach, sporządzić krzywą kalibracyjną odkładając na osi X czasy retencji poszczególnych wzorców, a na osi Y logarytm z ich masy cząsteczkowej (log M w ). Na podstawie uzyskanej krzywej wyznaczyć granicę wykluczania, granicę penetracji oraz selektywny zakres wykluczania dla badanej kolumny Badanie rozkładu mas cząsteczkowych w nieznanej próbce Wykonać analizę nieznanej próbki. Po zakończeniu analizy wydrukować chromatogram wraz z protokołem analizy. Wyznaczyć masy cząsteczkowe substancji obecnych w próbce przez odczytanie z krzywej wzorcowej logarytmu masy cząsteczkowej (log M w ) dla danego czasu retencji. 8

9 9. Opracowanie wyników W sprawozdaniu z przebiegu ćwiczenia umieścić (patrz wzór tab. 2): - czasy retencji wyznaczone dla poszczególnych wzorców - krzywą kalibracyjną - wyniki analizy nieznanej próbki. Tabela 2. Lp Masa cząsteczkowa wzorca [Da] Log M w Czas retencji [min] Steżenie wzorca [mg/l] 9