Wydzielanie i oczyszczanie PLE Esteraza z wątroby świńskiej (ang. Pig Liver Esterase, PLE) Esteraza z wątroby świńskiej (E.C. 3.1.1.1) jest esterazą typu serynowego. PLE jest mieszaniną izoenzymów złożonych z trzech podjednostek α, β i γ, które wykazują różnice w specyficzności substratowej, optimum ph i enancjoselektywności. Głównymi składnikami PLE są trimery γγγ, αγγ, ααγ, ααα, które można wydzielić za pomocą elektroforezy w gradiencie ph. Frakcja I składa się tylko z podjednostek γ i wykazuje aktywność cholinoesterazową (hydrolizuje butyrylocholinę), natomiast frakcja V to podjednostki α i preferuje hydrolizę maślanu metylu. Asp His Ser C - N N H H R R 1 Asp His Ser C H N NH R 1 R - -RCNu - R 1 H Asp His Ser Asp His Ser C H N N H Nu R - C H N NH R Schemat 1. Mechanizm hydrolizy estrów Nu - W centrum aktywnym hydrolaz typu serynowego występuje triada katalityczna aminokwasów: seryny, histydyny i kwasu asparaginowego. Schemat działania tej klasy enzymów przedstawiony jest na Schemacie 1. Istotą działania jest przeniesienie grupy acylowej (transacylacja) z cząsteczki estru na cząsteczkę nukleofilowego akceptora, zgodnie z reakcjami: 1) RCR 1 + H 2 RCH + R 1 H 2) RCR 1 + R 2 H RCR 2 + R 1 H 3) RCR 1 + R 2 NH 2 RCNHR 2 + R 1 H 4) RCR 1 + R 2 CH R(C)(C)R 2 + R 1 H 5) RCR 1 + H 2 2 RCH + R 1 H 1/9
Jak widać z powyższych reakcji, PLE może katalizować reakcje hydrolizy, transesteryfikacji, tworzenia amidów, bezwodników kwasowych, nadkwasów. PLE charakteryzuje się dobrą stabilnością, stereoselektywnością, nie wymaga kofaktorów, a ponadto może być używana zarówno w środowisku wodnym jak i organicznym. Preparat handlowy PLE nie jest jednak tani, więc samodzielne wyodrębnienie enzymu z tkanki zwierzęcej pozwala na zredukowanie kosztów prowadzenia badań. Wiąże się to jednak z koniecznością monitorowania właściwości przy izolacji każdej nowej porcji preparatu, ponieważ parametry (aktywność, selektywność) mogą się zmieniać w zależności od źródła materiału biologicznego (rasy, wieku, diety itp.). PLE nie jest enzymem uniwersalnym. Najlepiej katalizuje reakcje dyssymetryzacji związków prochiralnych lub związków mezo. W wyniku tego typów reakcji z achiralnego substratu otrzymuje się optycznie czynny produkt, o wysokim nadmiarze enancjomerycznym (stosowne definicje w dalszej części instrukcji). Przykłady reakcji katalizowanych przez PLE przedstawione są na Schemacie 2. CEt CEt CH CEt W = 90% ee = 81% Ac Ac ee = 86% Ac H Schemat 2. Reakcje katalizowane przez PLE Izolacja enzymów z materiału biologicznego Enzymy, naturalne katalizatory reakcji chemicznych, mogą być izolowane z bardzo różnorodnych źródeł, m. in. z mikroorganizmów (lipaza z Candida antarctica, lipaza z Pseudomonas cepacia), roślin (lipaza z kiełków pszenicy, amylazy z jęczmienia) i tkanek zwierzęcych (esteraza z wątroby świńskiej, lipaza z trzustki wieprzowej). Metody wydzielania enzymu z materiału biologicznego różnią się w zależności od źródła i rodzaju biokatalizatora, można jednak z reguły wyróżnić pewne etapy oczyszczania. 1. Rozbicie komórek w celu uwolnienia zawartych w nich białek. 2. Wydzielenie z lizatu frakcji białkowej. 3. Wydzielenie frakcji białek posiadających żądaną aktywność katalityczną. 4. znaczenie aktywności wydzielonych frakcji. 2/9
Na każdym etapie wydzielania należy mieć na uwadze takie cechy enzymów jak nietrwałość w ph poniżej 5.0 i powyżej 9.0, łatwość ulegania denaturacji cieplnej i wrażliwość na obecność metali ciężkich. Enzymy w większości dobrze rozpuszczają się w wodzie i w buforach, niektóre rozpuszczają się tylko w rozcieńczonych roztworach soli, kwasów i zasad. rozpuszczalności decyduje przede wszystkim zdolność do hydratacji, budowa chemiczna i parametry roztworu (obecne sole, ph). W roztworze wodnym cząsteczki białka otoczone są płaszczem wodnym tzw. wodą hydratacyjną. Hydratacja polega na elektrostatycznym oddziaływaniu dipoli wody z polarnymi łańcuchami bocznymi aminokwasów oraz z atomami i N w wiązaniu peptydowym. Ilość wody hydratacyjnej zależy od natury białka i powoduje stabilizację struktury przestrzennej, ponieważ polarne łańcuchy boczne znajdują się nie tylko na powierzchni, ale też są schowane pomiędzy łańcuchami polipeptydowymi. Woda hydratacyjna wpływa więc na właściwości i strukturę białek, a enzymy pozbawione otoczki hydratacyjnej stają się nieaktywne. Część enzymów wymaga do działania niebiałkowych kofaktorów, których utrata w procesie oczyszczania prowadzi do inaktywacji enzymu. 1. Rozbicie komórek w celu uwolnienia zawartych w nich białek Enzymy mogą występować w komórkach w stanie wolnym, ale w większości przypadków są związane z pewnymi strukturami komórkowymi. Metody stosowane do uwalniania enzymów muszą skutecznie niszczyć komórki, ale jednocześnie powinny być na tyle delikatne, aby nie powodować ich dezaktywacji. Stosuje się różne techniki w zależności od materiału biologicznego z którym mamy do czynienia, najczęściej w przypadku tkanek jest to mechaniczna homogenizacja w młynkach wysokoobrotowych ale może to też być liza osmotyczna, cykliczne zamrażanie i rozmrażanie oraz rozbijanie ultradźwiękami. Homogenizację tkanek przeprowadza się najczęściej w roztworach buforowych i po odwirowaniu nierozpuszczalnych frakcji komórkowych otrzymuje się roztwór białek i innych związków nazywany supernatantem. Ponieważ roztwory takie są dość nietrwałe, więc najlepiej przechowywać je w stanie głębokiego zamrożenia (-78 o C) z dodatkiem substancji krioochronnych (np. glicerolu). 2. Wydzielenie frakcji białkowej Wytrącenie frakcji białkowej uzyskuje się najczęściej poprzez wytrącanie z roztworów wodnych za pomocą rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą, takich jak aceton lub etanol. Dodanie tych rozpuszczalników zmniejsza rozpuszczalność białek w wodzie i powoduje ich wytrącanie. Jednak długotrwały wpływ rozpuszczalnika organicznego w temperaturze pokojowej i powyżej powoduje denaturację białka, dlatego wytrącanie prowadzi się w obniżonej temperaturze, za 3/9
pomocą uprzednio schłodzonych rozpuszczalników, minimalizując czas kontaktu białek z rozpuszczalnikiem. Można połączyć dezintegrację materiału biologicznego z wytrąceniem frakcji białkowej w jeden etap i homogenizację przeprowadzić w polarnych rozpuszczalnikach organicznych mieszających się z wodą. Rozpuszczalnik usuwa wodę z układu i preparat enzymatyczny otrzymuje się w formie suchego proszku (np. homogenizacja w acetonie daje tzw. proszek acetonowy). Metoda ta pozwala wstępnie oczyścić preparat z substancji lipidowych i innych rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych. 3. Wydzielanie frakcji białek posiadających żądaną aktywność katalityczną Najczęściej stosowane metody, to: Frakcjonowanie roztworami soli. Dodatek soli w małym stężeniu wpływa korzystnie na rozpuszczalność białek w buforach. Duże stężenie soli, szczególnie tych łatwo tworzących wodziany (na przykład siarczan(vi) amonu, sodu lub magnezu) powoduje zmniejszenie rozpuszczalności i wytrącenie białka proces ten nazywa się wysalaniem. Proces ten jest odwracalny i nie powoduje denaturacji białka. Stężenie soli potrzebne do wytrącenia białka zależy od właściwości danego białka i od ph środowiska. Najmniejszą rozpuszczalność ma białko w punkcie izoelektrycznym (ph, w którym wypadkowy ładunek białka jest równy zero). Dodatkowo można oczyścić wysolone białko od soli w procesie dializy lub filtracji żelowej. Metody chromatograficzne. Najbardziej użyteczna w frakcjonowaniu białek jest chromatografia kolumnowa. W zależności od metody wykorzystuje się różnice w wielkościach cząsteczek, ich ładunku oraz zdolności wiązania ze specyficznymi związkami. a) Chromatografia jonowymienna. Wykorzystuje się zdolność białka obdarzonego ładunkiem elektrycznym do wiązania się z wymieniaczem jonowym (na przykład anionit DEAE-Sephadex lub kationit CM-Sephadex). Im większy jest wypadkowy ładunek białka, tym silniej wiąże się ono z fazą stacjonarną i tym później wymywane jest z kolumny za pomocą roztworu NaCl o wzrastającym gradiencie. b) Chromatografia powinowactwa. Wykorzystuje się powinowactwo białka do ligandu osadzonego (immobilizowanego) na fazie stacjonarnej. Ligandem dla enzymu może być substrat lub inhibitor. Metoda ta pozwala na bardzo dokładne oczyszczenie wymaganego enzymu. c) Filtracja żelowa. Rozdział białek wykorzystujący różnice w ich budowie i kształcie. Fazę stacjonarną stanowi porowate wypełnienie (na przykład poliakryloamid, dekstran lub agaroza). Mniejsze cząsteczki dyfundują w pory żelu i są wymywane z kolumny później niż większe. Dostępne są wypełnienia o różnej wielkości porów, co pozwala na dokładne dobranie warunków rozdziału. 4/9
4. znaczenie aktywności wydzielonych frakcji Jeżeli dla danego enzymu możemy dobrać modelowy związek, który w wyniku przekształcania przez enzym daje produkt o innych właściwościach spektroskopowych (maksimum absorbancji, współczynnik ekstynkcji molowej) to do oznaczenia aktywności można wykorzystać metody spektrofotometryczne. Dla enzymów hydrolitycznych dobrymi substratami modelowymi są estry p-nitrofenolu (Schemat 3, substrat jest bezbarwny, zaś produkt jego hydrolizy jest żółty (λ max = 410 nm)). Ważne pojęcia: 1 N 2 R Enzym H + N 2 R H barwny Schemat 3. Hydroliza estrów p-nitrofenolu Nadmiar enancjomeryczny (ee, enantiomeric excess) miara czystości optycznej związku wyrażona w procentach. Wielkość określająca nadmiar (ilościowy) jednego enancjomeru w stosunku do drugiego. Przyjmuje się, że ma zawsze wartość dodatnią i definiuje się jako stosunek różnicy zawartości poszczególnych enancjomerów do ich sumy. [ R] [ S] [ S] [ R] ee R = 100% ee S = 100% [ R] + [ S] [ R] + [ S] Nadmiar enancjomeryczny może być wyznaczony metodami: 1) porównanie wartości skręcalności właściwych, jednak konieczna jest znajomość wartości skręcalności właściwej dla czystych enancjomerów: ee [ α] D bad = D [ α] lit 100% 41 np. jeżeli [α] D lit=-47 o dla (S), a [α] D bad=-41 o, to ee S = 100% = 87,2% 47 2) chromatografia cieczowa HPLC lub gazowa na kolumnach z chiralnym wypełnieniem, które różnie oddziaływuje z enancjomerami i powoduje różnicowanie ich czasów retencji. 3) spektrometria 1 HNMR z dodatkiem odczynnika przesunięcia chemicznego np. kompleksu europu, który powoduje tworzenie diastereoizomerycznych kompleksów z enancjomerami, a tym samym różnicowanie sygnałów protonów pochodzących od poszczególnych izomerów. 1 Widmo 1 HNMR do wyznaczanie ee podane zostało tylko jako ciekawostka. Nie oczekuje od Państwa znajomości zasad interpretacji widm, ale oczywiście jeżeli ktoś będzie chętny zaznajomić się z metodyką to policzone będzie jako plus. Natomiast metoda wyznaczania ee za pomocą skręcalności i HPLC jak najbardziej obowiązuje i można spodziewać się stosownego pytania. 5/9
Schemat 4. Chromatogramy HPLC mieszaniny racemicznej i optycznie czynnego związku Schemat 5. Widma 1 HNMR N-metylofenyloaminy i N-fenylometyloaminy z dodatkiem odczynnika przesunięcia chemicznego (kompleks europu) 6/9
Enancjoselektywność reakcji katalizowanej enzymatycznie enzymy można traktować jako bardzo szczególne chiralne katalizatory, które preferują szybsze przekształcanie tylko jednego z enancjomerów. Im różnica w szybkościach jest większa, tym reakcja jest bardziej enancjoselektywna, tzn. prowadzi do produktu o wyższym nadmiarze enancjomerycznym (w przypadku idealnym do związku o ee=100%, czyli czystego enancjomeru). Miarą enancjoselektywności reakcji jest tzw. współczynnik enancjoselektywności (E), który można wyznaczyć ze wzorem: E = ln [ (1- ee s ) ( ln [ (1+ ee s ) ( ee p ee p + ee s ) ] ee p ee p + ee s ) ] Jeżeli E jest z zakresu: a) E<15, reakcja jest nieenancjoselektywna, produkty mają niskie nadmiary enancjomeryczne. b) E=15-30, reakcja jest średnio-selektywna, a nadmiary enancjomeryczne produktów kształtują się na poziomie ee=50-70%. c) E>100, mamy do czynienia z reakcją bardzo enancjoselektywną, a uzyskiwane ee są rzędu 90-100%. Związek prochiralny związek achiralny zawierający kilka równocennych chemicznie grup, z których jedna może ulegać reakcji, w końcowym efekcie dając związek chiralny np. grupy prochiralne CEt CEt CEt związek prochiralny ( R ) CH Część doświadczalna 1. Wydzielanie preparatu enzymatycznego PLE (część pokazowa) Sprzęt i odczynniki: młynek (homogenizator) wysokoobrotowy, lejek Schotta, kolba ssawkowa, schłodzony aceton (500 ml), schłodzony chlorek metylenu (200 ml). Procedura: Posiekaną wątrobę wieprzową (100 g) homogenizuje się w młynku (22000 obr/min) w acetonie (300 ml) przez 40 s. trzymaną zawiesinę należy przesączyć przez lejek Schotta. Brunatny osad ponownie homogenizuje się (22000 obr/min) w acetonie (150 ml) przez kolejne 40 s. Po ponownym przesączeniu osad homogenizuje się w chlorku metylenu (150 ml) przez 20 s. 7/9
dsączony osad umieszcza się w eksykatorze i najpierw suszy pod zmniejszonym ciśnieniem (pompka wodna), a później pod próżnią (pompa olejowa). Należy zbadać aktywność hydrolityczną otrzymanego preparatu. 2. czyszczanie PLE z preparatu enzymatycznego przez wysalanie Sprzęt i odczynniki: wirówka, zlewki, mieszadło magnetyczne, łaźnia lodowa, preparat enzymatyczny PLE, bufor fosforanowy ph 7.20, siarczan(vi) amonu. Procedura: Do próbówki typu Falcone o poj. 15ml odważyć 1,20g surowego preparatu PLE z wątroby świńskiej i 12 ml buforu fosforanowego ph 7,20. Próbkę wytrząsa się przez kilka minut i ewentualnie dodatkowo umieszcza w płuczce ultradźwiękowej na kolejne 3 min. trzymaną zawiesinę wiruje się przez 10 min przy 10000 obr/min. Supernatant zlewa się do skalowanej próbówki, aby dokładnie zmierzyć objętość otrzymanego roztworu, a następnie przenosi do zlewki zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne (wielkość zlewki zależy od stopnia wysolenia). Zlewkę umieszcza się w łaźni z lodem i chłodzi zawartość przez 5 min. Następnie stopniowo dodaje się odpowiednią objętość nasyconego roztworu siarczanu(vi) amonu, doprowadzając do zadanego wysycenia roztworu (do samodzielnego wyliczenia, należy przyjąć, że rozpuszczalność siarczanu(vi) amonu w wodzie w 4 C wynosi 70.6 g) Proces prowadzi się chłodząc przez 1 h. Później zawiesinę wiruje się przez 10 min (10000 obr/min), a po zlaniu supernatanu, osad suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem. 3. Zadanie rachunkowe W celu oczyszczenia preparatu enzymatycznego PLE student przygotował próbkę zawierającą 500 mg surowego preparatu enzymatycznego i 7 ml buforu fosforanowego o ph=7,2. Następnie próbkę poddał działaniu ultradźwięków i wirowaniu w wyniku czego otrzymał 11 ml supernatantu. Jaką objętość nasyconego roztworu (NH 4 ) 2 S 4 należy dodać do supernatantu, aby stopień wysycenia siarczanem (VI) amonu otrzymanego roztworu wynosił 70% (rozpuszczalność (NH 4 ) 2 S 4 w H 2 w 4 o C wynosi 70.6g/100g, d=1,244 g/ml)? Literatura: Krótkie wykłady: biochemia B.D. Hames, N.M. Hooper, J.D. Houghton, PWN, 2001 Ćwiczenia z biochemii praca zbiorowa pod redakcją Leokadii Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, 2003 "Biochemia - ćwiczenia praktyczne dla studentów wydziału farmaceutycznego" pod redakcją Lidii Włodek, Wydawnictwo UJ, Kraków, 2000 8/9
Bilans oczyszczania PLE Grupa Wysolenie [%] Masa preparatu surowego [g] / wysolonego [g] PLE sur : Ilość białka [mg/g preparatu] PLE wys : Ilość białka [mg/g preparatu] PLE sur : Ilość białka całkowita [mg] PLE wys : Ilość białka całkowita [mg] PLE sur : Aktywność [µmol/min*mg prepar.] PLE wys : Aktywność [µmol/min*mg prepar.] PLE sur : Aktywność właściwa [µmol/min*mg białka] PLE wys : Aktywność właściwa [µmol/min*mg białka] PLE sur : gólna liczba jednostek [µmol/min] PLE wys : gólna liczba jednostek [µmol/min] Wydajność oczyszczenia [%] Stopień oczyszczenia 9/9