RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1901698 (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14.06.2006 06754350.4 (51) Int. Cl. A61K36/76 (2006.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej 21.10.2009 Europejski Biuletyn Patentowy 2009/43 EP 1901698 B1 (54) Tytuł wynalazku: Sposób ekstrakcji pochodnych salicyny z salix (30) Pierwszeństwo: IT2005MI01349 14.07.2005 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 26.03.2008 Europejski Biuletyn Patentowy 2008/13 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.03.2010 Wiadomości Urzędu Patentowego 03/2010 (73) Uprawniony z patentu: Indena S.p.A., Milano, IT (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP 1901698 T3 BOMBARDELLI Ezio, Groppello Cairoli, IT GIORI Andrea, Milano, IT ANELLI Alessandro, Milano, IT (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Pietruszyńska-Dajewska Elżbieta 00-950 Warszawa skr. poczt. 335 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
2 Opis Podsumowanie wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu ekstrakcji pochodnych salicyny z Salix spp., obejmujący oczyszczanie na kolumnie z żywicą adsorpcyjną. Ekstrakt charakteryzuje się wysoką zawartością pochodnych salicyny, mniejszą zawartością wielkocząsteczkowych tanin i zawartością proantocyjanidyn wystarczającą do hamowania niektórych metaloproteaz tkankowych. Produkt można komponować w olejach bogatych w kwasy ω-3 albo ω-6, które zapewniają lepsze wchłanianie składników czynnych, zwiększając synergistycznie ich działanie. Tło technologiczne Ekstrakty z kory i gałęzi różnych gatunków Salix stosowano od niepamiętnych czasów do leczenia postaci stawowej reumatyzmu i dny. Ekstrakty z Salix zasadniczo porzucono pod koniec XIX wieku, gdy zsyntezowano aspirynę drogą acetylowania kwasu salicylowego otrzymanego drogą utleniania związków obecnych w Salix. Przy tym jednak aspiryna i ekstrakty z Salix wykazują zasadnicze różnice pod względem mechanizmów działania i aktywności na połączeniach kostnych. Ekstrakty działają na enzym COX 2, natomiast aspiryna działa głównie na COX 1, który pociąga za sobą dobrze znane skutki uboczne na przewód żołądkowojelitowy i krzepnięcie krwi, które znacznie ograniczają jej dłuższe stosowanie, które z kolei jest konieczne w przypadku takich przewlekłych zwyrodnieniowych patologii, jak choroba zwyrodnieniowa stawów albo zapalenie stawów. Z literatury wiadomo, że ekstrakty z Salix mają nadzwyczaj zmienne zawartości pochodnych salicyny, które wynoszą średnio do 15%, i zawartość tanin wynoszącą od 8 do 20%. Taniny obecne w ekstraktach z Salix, jak jest to w
3 przypadku wszystkich tanin galusowych i katechinowych, wykazują silne powinowactwo do białek i proteoglikanów, które pociąga za sobą uszkodzenia tkanek w przypadku długo trwającego leczenia. Stąd istnieje potrzeba dogodnego sposobu, który daje się łatwo stosować w przemyśle i zapewnia ekstrakty o standaryzowanej zawartości składników czynnych. W dokumencie WO 2005/002611 ujawnia się preparaty do leczenia zapalenia stawów, zawierające saligeninę albo ekstrakty zawierające saligeninę w połączeniu z innymi składnikami czynnymi. Ujawnienie wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania nowych ekstraktów z Salix spp., charakteryzujących się wysoką zawartością pochodnych salicyny, mniejszą zawartością wielkocząsteczkowych tanin i zawartością proantocyjanidyn dostateczną do hamowania niektórych metaloproteaz tkankowych. Nieoczekiwanie stwierdzono, że ekstrakcja w odpowiednich warunkach kory i gałęzi Salix oraz specyficzna obróbka oczyszczająca otrzymanego ekstraktu dają ekstrakty o zawartości pochodnych salicyny do 50%, zawartości tanin nie większej niż 5% i zawartości oligomerycznych procyjanidyn większej niż 5%. Zaleta stosowania ekstraktów z Salix, a zwłaszcza ekstraktów otrzymanych według niniejszego wynalazku, w porównaniu z samymi pochodnymi salicyny, jest związana z obecnością proantocyjanidyn, silnych akceptorów wolnych rodników i silnych inhibitorów metaloproetaz, które aktywują się w warunkach zapalenia stawów poprzez nadekspresję leukocytu II 1. Sposób według wynalazku wytwarzania ekstraktów z Salix różni się od sposobów według stanu techniki zawartościami salicyny i jej pochodnych w ekstraktach oraz
4 stosowaniem matryc, które zapewniają selektywne zmniejszenie zawartości tanin, zatrzymując jednocześnie w ekstrakcie terapeutycznie użyteczne proantocyjanidyny. Sposób według wynalazku obejmuje cztery podstawowe etapy: a) ekstrakcja gałęzi i kory z Salix spp. odpowiednimi rozpuszczalnikami, które rozpuszczają pożądane produkty (ekstrakt całkowity), b) usuwanie tanin nierozpuszczalnych (albo słabo rozpuszczalnych) w wodzie, c) ewentualne usuwanie tanin rozpuszczalnych w wodzie, d) oczyszczanie na kolumnie z żywicą adsorpcyjną w celu zwiększenia zawartości pochodnych salicyny. Etap (a) prowadzi się drogą ekstrakcji materiału roślinnego, składającego się z kory i gałęzi rośliny, za pomocą C1-C3-alkoholu albo acetonu albo mieszaniny tych rozpuszczalników albo wodnych roztworów tych rozpuszczalników albo samej wody, przy czym korzystny jest 30% objętościowo roztwór woda-etanol. Temperatura ekstrakcji może wynosić od 10 o C do 80 o C, korzystnie 25 o C. Etap (b) umożliwia usunięcie z ekstraktu składników nierozpuszczalnych w wodzie, a zwłaszcza wielkocząsteczkowych tanin. Etap (c) umożliwia usunięcie z ekstraktu tanin najbardziej rozpuszczalnych w wodzie. Jest to etap ewentualny, który można prowadzić w celu usunięcia wszelkich tanin wciąż obecnych w ekstrakcie po etapie (b). Te metabolity można usuwać stosując poliwinylopolipirolidon (PVPP). Etap (d) umożliwia frakcjonowanie ekstraktu usuwając najmniej użyteczne metabolity (cukry, itp.), zachowując jednocześnie pożądane metabolity wtórne, to jest pochodne salicyny i oligomeryczne proantocyjanidyny. Ten etap polega na rozdzielaniu chromatograficznym drogą adsorpcji
5 na żywicy polimerycznej. Przykładami żywic odpowiednich do tego celu są żywice styren-dvb, takie jak Amberlite HP20 albo XAD1180R firmy Rohm i Haas, oraz żywice akrylowe XAD7HP firmy Rohm i Haas. W czasie etapu frakcjonowania kolumnowego z zastosowaniem odpowiednich mieszanin rozpuszczalników wolną salicynę można oddzielać od jej pochodnych otrzymując frakcje bogate w wolną salicynę, o mniejszej ilości jej pochodnych, oraz frakcje o zupełnie różnych składach. Cały ekstrakt otrzymany z kory i gałęzi z Salix za pomocą 30%-go etanolu zatęża się do suchej pozostałości wynoszącej od 5% do 50% wagowych, korzystnie 25% wagowych, i pozostawia w temperaturze od 1 o C do 20 o C, korzystnie w temperaturze 4 o C, bez mieszania, w ciągu 1 do 24 godzin, korzystnie 16 godzin. Otrzymaną zawiesinę wiruje się w temperaturze 4 o C usuwając z klarownego wodnego roztworu resztkowy osad zawierający wielkocząsteczkowe pochodne i taniny. Nierozpuszczalne w wodzie albo słabo rozpuszczalne taniny zawarte w całym ekstrakcie usuwa się drogą oczyszczania wodą, które można jeszcze dalej polepszyć drogą ewentualnej obróbki (etap c) poliwinylopolipirolidonem (PVPP). Częściowe oczyszczanie wodą (etap b) może usunąć tylko część tanin (powyżej 50% wagowych obecnych tanin), natomiast oczyszczanie za pomocą PVPP usuwa resztkowe taniny w zakresie wartości poniżej 5% końcowego ciężaru ekstraktu. Zatem klarowny wodny roztwór z etapu b) poddaje się obróbce za pomocą PVPP (1-50% wagowych, korzystnie 1:30, a najkorzystniej 1:20, w przeliczeniu na suchą pozostałość poddawanego obróbce wodnego ekstraktu) utrzymując mieszanie w ciągu 1 albo więcej godzin. Roztwór odfiltrowuje się od PVPP i zaadsorbowanych tanin. Następnie wodny roztwór adsorbuje się na żywicy
6 starannie przemywając substrat wodą i usuwając niepożądane rozpuszczalne substancje. Roztwór niezatrzymany odrzuca się. Produkt wymywa się roztworem woda-alkohol (C1-C3- alkohole, korzystnie etanol) o zawartości wody wynoszącej od 50% objętościowych do 0% objętościowego, korzystnie 10% objętościowych. Alternatywnie można stosować roztwór wodaaceton o zawartości wody wynoszącej od 50% objętościowych do 0% objętościowego, korzystnie 10% objętościowych. Roztwór etanol-woda zatęża się do sucha albo rozpyla. Otrzymany ekstrakt można komponować w zwykłych farmaceutycznych postaciach stałych albo w postaci oleistej zawiesiny w kapsułkach, a zwłaszcza w olejach bogatych w wielonienasycone kwasy tłuszczowe ω-3/ω-6, przy czym szczególnie korzystny jest olej z Enothera biennis i tran oraz jego pochodne. Czynne dawki do leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów i reumatoidalnego zapalenia stawów u ludzi wynoszą od 100 do 1000 mg dziennie, stosownie do ostrości leczonej choroby. Wynalazek opisuje się bardziej szczegółowo w następujących przykładach. Przykład 1 Ekstrakcja gałęzi i kory z Salix roztworem woda-etanol (etap a): W tym etapie wytwarza się cały ekstrakt, który można stosować jako materiał wyjściowy do następnego rozdzielania drogą chromatografii kolumnowej. 1000 gramów gałęzi i kory z Salix pokrywa się 1,5 litrem 30%-go objętościowo etanolu w temperaturze 20 o w ciągu 4 godzin w statycznym perkolatorze. Po 4 godzinach odzyskuje się produkt perkolacji i ekstrahuje ponownie 6 razy w tych samych warunkach, lecz stosując 1 litr rozpuszczalnika na ekstrakcję, otrzymując w przybliżeniu 7
7 litrów całkowitego produktu perkolacji. Połączone produkty perkolacji filtruje się usuwając zanieczyszczenia i pozostałości roślinne. Ten roztwór (produkt 1) ma całkowitą suchą pozostałość 154 gramy, przy czym wydajność względem materiału wyjściowego wynosi 15,4% wagowych. Zawartość wolnej salicyny po HPLC wynosi 4,63%, a całkowita zawartość salicyny po HPLC wynosi 15,4%. Zawartość tanin wynosi 16,26% wagowych. Przykład 2 Ekstrakcja gałęzi i kory z Salix roztworem woda-aceton (etap a): W tym etapie wytwarza się cały ekstrakt, który można stosować jako materiał wyjściowy do kolejnego rozdzielania drogą chromatografii kolumnowej. 1000 gramów gałęzi i kory z Salix ekstrahuje się za pomocą 1,5 litra 80%-go objętościowo acetonu w temperaturze 20 o C w ciągu 4 godzin w statycznym perkolatorze. Po 4 godzinach odzyskuje się produkt perkolacji i ekstrahuje ponownie 6 razy w tych samych warunkach, lecz stosując 1 litr rozpuszczalnika na ekstrakcję, otrzymując w przybliżeniu 7 litrów całego produktu perkolacji. Połączone produkty perkolacji filtruje się na gorąco i zatęża za pomocą wyparki obrotowej w temperaturze 60 o C pod zmniejszonym ciśnieniem. Ten ekstrakt ma całkowitą suchą pozostałość 143 gramy, przy czym wydajność względem materiału wyjściowego wynosi 14,3% wagowych. Zawartość wolnej salicyny po HPLC wynosi 4,3%, a całkowita zawartość salicyny po HPLC wynosi 15,7%. Zawartość tanin wynosi 15,42% wagowych. Przykład 3 Ekstrakcja gałęzi i kory z Salix wodą (etap a): W tym etapie wytwarza się cały ekstrakt, który można
8 stosować jako materiał wyjściowy do kolejnego rozdzielania drogą chromatografii kolumnowej. 1000 gramów małych gałęzi i kory z Salix pokrywa się za pomocą 1,5 litra wody w temperaturze 20 o w ciągu 4 godzin w statycznym perkolatorze. Po 4 godzinach odzyskuje się produkt perkolacji i ekstrahuje ponownie 6 razy w tych samych warunkach, lecz stosując 1 litr rozpuszczalnika na ekstrakcję, otrzymując w przybliżeniu 7 litrów całego produktu perkolacji. Połączone produkty perkolacji filtruje się ze ssaniem i zatęża za pomocą wyparki obrotowej w temperaturze 60 o C pod zmniejszonym ciśnieniem. Ten ekstrakt ma całkowitą suchą pozostałość 167 gramów, przy czym wydajność względem materiału wyjściowego wynosi 16,7% wagowego. Zawartość wolnej salicyny po HPLC wynosi 3,94%, a całkowita zawartość salicyny po HPLC wynosi 13,6%. Zawartość tanin wynosi 6,8% wagowego. Przykład 4 Ekstrakcja gałęzi i kory z Salix metanolem (etap a): W tym etapie wytwarza się cały ekstrakt, który można stosować jako materiał wyjściowy do kolejnego rozdzielania drogą chromatografii kolumnowej. 1000 gramów gałęzi i kory z Salix pokrywa się za pomocą 1,5 litra metanolu w temperaturze 20 o C w ciągu 4 godzin w statycznym perkolatorze. Po 4 godzinach odzyskuje się produkt perkolacji i ekstrahuje ponownie 6 razy w tych samych warunkach, lecz stosując 1 litr rozpuszczalnika na ekstrakcję, otrzymując w przybliżeniu 7 litrów całego produktu perkolacji. Połączone produkty perkolacji filtruje się i zatęża za pomocą wyparki obrotowej w temperaturze 60 o C pod zmniejszonym ciśnieniem. Ten ekstrakt ma całkowitą suchą pozostałość 101 gramów, przy czym wydajność względem materiału wyjściowego wynosi 10,1% wagowego.
9 Zawartość wolnej salicyny po HPLC wynosi 5,9%, a całkowita zawartość salicyny po HPLC wynosi 19,9% wagowego. Zawartość tanin wynosi 14,5% wagowego. Przykład 5 Oczyszczanie ekstraktu z gałęzi i kory z Salix (etap b): usuwanie składników nierozpuszczalnych w wodzie Roztwór 1 otrzymany pod koniec obróbki opisanej w Przykładzie 1 (etap a) zatęża się za pomocą wyparki obrotowej w temperaturze 60 o C pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując wodną zawiesinę o suchej pozostałości 25% wagowych całej wodnej zawiesiny, przy czym całkowity ciężar wymienionego roztworu wynosi 615 g. Otrzymaną wodną zawiesinę chłodzi się do temperatury 4 o C i pozostawia na 16 godzin, a następnie wciąż chłodną wodną zawiesinę wiruje się z szybkością 3000 g w ciągu 20 minut w celu oddzielenia strąconej pozostałości od klarownego wodnego roztworu. Ten osad, który ma suchą pozostałość 16,3 g, jest bogaty w taniny i wielkocząsteczkowe produkty i usuwa się go. Otrzymany klarowny roztwór (roztwór 2) ma suchą pozostałość równoważną 137 g częściowo oczyszczonego ekstraktu, który ma zawartość wolnej salicyny po HPLC 5,0% i zawartość całkowitej salicyny po HPLC 16,7% wagowych. Zawartość taniny wynosi 6,9% wagowych. Wydajność wagowa względem materiału wyjściowego wynosi 13,7% wagowych. Przykład 6 Oczyszczanie ekstraktu z gałęzi i kory z Salix (etap c): Klarowny roztwór otrzymany pod koniec procesu częściowego oczyszczania w etapie b (Przykład 5, roztwór 2), który ma suchą pozostałość 137 g, poddaje się obróbce w celu usunięcia tanin rozpuszczalnych w wodzie. Do roztworu dodaje się 14 g PVPP, co odpowiada w
10 przybliżeniu 10% wagowych suchej pozostałości poddawanego obróbce ekstraktu. Po mieszaniu w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej PVPP oddziela się od roztworu drogą wirowania. Otrzymany roztwór (roztwór 3) ma suchą pozostałość równoważną 125 g częściowego oczyszczonego ekstraktu, ma zawartość wolnej salicyny po HPLC 5,3% i zawartość całkowitej salicyny po HPLC 8% wagowych. Zawartość taniny wynosi 1,2% wagowego. Wydajność wagowa względem materiału wyjściowego wynosi 12,5% wagowego. Przykład 7 Chromatograficzne oczyszczanie ekstraktu z gałęzi i kory z Salix (etap d) Roztwór wodny otrzymany w etapie c (Przykład 6, roztwór 3) ładuje się na kolumnę chromatograficzną zawierającą 1250 ml kondycjonowanej wodą żywicy XAD1189 firmy Rohm i Haas. Roztwór woda-alkohol adsorbuje się na żywicy, natomiast wychodzący z kolumny, niezatrzymany roztwór odrzuca się. Następnie żywicę przemywa się za pomocą 1,25 litra wody usuwając także ten roztwór, gdy zawartość w nim pożądanych składników jest nieznaczna. Te odrzucone wodne roztwory (produkt 1) mają w rzeczywistości całkowitą suchą zawartość 52,6 g, przy czym zawartość wolnej salicyny po HPLC wynosi 0,87%, a zawartość całkowitej salicyny wynosi po HPLC 0,92% wagowego. Kolumnę wymywa się za pomocą 3,75 litra 90% objętościowo wodnego etanolu. Otrzymany eluat odzyskuje się i suszy w temperaturze 60 o C pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 72,4 grama suchego produktu (produkt 2), co odpowiada wydajności względem materiału wyjściowego 7,2% wagowego. Zawartość wolnej salicyny po HPLC wynosi 8,95%, a całkowita zawartość salicyny po HPLC wynosi 30,0% wagowych. Zawartość oligomerycznych
11 proantocyjanidyn wynosi 11,2% wagowych, a zawartość tanin wynosi 2,1% wagowych. Przykład 8 Chromatograficzne oczyszczanie ekstraktu z gałęzi i kory z Salix (etap d) i oddzielanie wolnej salicyny od jej pochodnych Roztwór wodny z etapu c (Przykład 6, roztwór 3) ładuje się na kolumnę chromatograficzną zawierającą 1250 ml kondycjonowanej wodą żywicy XAD1189 firmy Rohm i Haas. Roztwór woda-alkohol adsorbuje się na żywicy, natomiast wychodzący z kolumny niezatrzymany roztwór odrzuca się. Następnie żywicę przemywa się za pomocą 1,25 litra wody usuwając także ten roztwór, gdy zawartość w nim pożądanych składników jest nieznaczna. Te odrzucone wodne roztwory (produkt 3) mają w rzeczywistości całkowitą suchą zawartość 51,7 g, przy czym zawartość wolnej salicyny po HPLC wynosi 1,34%, a zawartość całkowitej salicyny wynosi po HPLC 1,41% wagowych. Żywicę przemywa się za pomocą 2,5 litra 10% objętościowo wodnego etanolu otrzymując roztwór (produkt 4) o suchej pozostałości 17,1 g (wydajność względem materiału wyjściowego 1,7% wagowego). Zawartość wolnej salicyny po HPLC wynosi 34,6%, a całkowita zawartość salicyny po HPLC wynosi 34,9% wagowych. Kolumnę wymywa się za pomocą 3,75 litra 90% objętościowo wodnego etanolu. Otrzymany eluat odzyskuje się i suszy w temperaturze 60 o C pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 43,2 grama suchego produktu (produkt 5), co odpowiada wydajności wagowej względem materiału wyjściowego 4,3% wagowego. Zawartość wolnej salicyny po HPLC wynosi 0,45%, a całkowita zawartość salicyny po HPLC wynosi 39,7% wagowego.
12 Przykład 9 Preparat ekstraktu w miękkich kapsułkach żelatynowych Preparat ekstraktu z Salix rubra jest oleistą zawiesiną do miękkich kapsułek żelatynowych. Skład jednostkowy Ekstrakt z Salix rubra według Przykładu 7 Monostearynian glicerylu Lecytyna sojowa Olej z Enothera biennis ile trzeba do 250 mg 30 mg 10 mg 700 mg Otrzymywanie: 1) ogrzewanie oleju z Enothera biennis do temperatury około 70 o C i topienie w nim monostearynianu glicerylu z mieszaniem, 2) dodawanie do otrzymanego roztworu lecytyny sojowej, 3) dyspergowanie w otrzymanym roztworze ekstraktu z Salix rubra, sprzyjając jednorodnemu rozdzieleniu za pomocą odpowiedniego układu mieszania. Stopniowe chłodzenie otrzymanego roztworu z mieszaniem. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób ekstrakcji pochodnych salicyny z gałęzi i kory z Salix spp., obejmujący sekwencję etapów a) do d): a) ekstrakcja gałęzi i kory z Salix spp. odpowiednimi rozpuszczalnikami, które rozpuszczają pożądane produkty (ekstrakt całkowity), b) usuwanie tanin nierozpuszczalnych (albo słabo rozpuszczalnych) w wodzie, c) ewentualne usuwanie tanin rozpuszczalnych w wodzie,
13 d) oczyszczanie na kolumnie z żywicą adsorpcyjną w celu zwiększenia zawartości pochodnych salicyny. 2. Sposób według zastrz. 1, w którym etap (a) prowadzi się drogą ekstrakcji materiału roślinnego za pomocą C1-C3-alkoholu albo mieszanin tych rozpuszczalników albo wodnych roztworów tych rozpuszczalników albo samej wody. 3. Sposób według zastrz. 2, w którym rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym jest etanol. 4. Sposób według zastrz. 2, w którym rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym jest 30% objętościowo roztwór woda-etanol w alkoholu. 5. Sposób według zastrz. 2, w którym rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym jest aceton. 6. Sposób według zastrz. 2, w którym rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym jest 80% wagowo roztwór woda-aceton. 7. Sposób według zastrz. 2-6, w którym ekstrakcję prowadzi się w temperaturze 25 o C. 8. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 7, w którym etap (c) prowadzi się stosując poliwinylopolipirolidon (PVPP). 9. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 7, w którym rozdzielanie chromatograficzne prowadzi się na żywicy styrenowo-diwinylobenzenowej albo akrylowej. 10. Sposób wytwarzania środków leczniczych do leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów i przewlekłych zwyrodnieniowych patologii stawów, obejmujący sposób według zastrz. 1. INDENA S.p.A. Pełnomocnik: