PL 213879 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 213879 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 383211 (22) Data zgłoszenia: 28.08.2007 (51) Int.Cl. C07D 217/12 (2006.01) C12P 1/00 (2006.01) C12P 17/12 (2006.01) C12R 1/465 (2006.01) A61P 31/00 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (54) Nowy związek oraz jego zastosowania (43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.03.2009 BUP 05/09 (73) Uprawniony z patentu: PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY, Warszawa, PL INSTYTUT CHEMII ORGANICZNEJ PAN, Warszawa, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.2013 WUP 05/13 (72) Twórca(y) wynalazku: JOLANTA SOLECKA, Warszawa, PL LECH KOZERSKI, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek
2 PL 213 879 B1 Opis wynalazku W związku z narastającą opornością drobnoustrojów na dotychczas stosowane chemioterapeutyki istnieje pilna potrzeba poszukiwania nowych antybiotyków o odmiennych strukturach chemicznych. Antybiotyki β-laktamowe stanowią grupę najczęściej stosowanych związków w walce z chorobami bakteryjnymi. Wiąże się to z ich szerokim spektrum aktywności przeciwbakteryjnej oraz brakiem ich chemoreceptorów w organizmach Eucaryotae. W badaniach zastosowano zewnątrzkomórkową DD-karboksypeptydazę/transpeptydazę 64-575 II (DD-peptydazę 64-575 II). DD-peptydazy biorą udział w końcowym etapie syntezy ściany komórkowej bakterii i zarazem wiążą antybiotyki β-laktamowe. Enzymy związane z antybiotykiem tracą swoje właściwości katalityczne co prowadzi do śmierci komórki bakteryjnej na skutek zahamowania syntezy ściany komórkowej. Celem wynalazku jest dostarczenie nowych związków aktywnych, które będąc inhibitorami DD-peptydaz mogą być wykorzystane do otrzymywania preparatów farmaceutycznych, w szczególności antybiotyków lub leków przeciwnowotworowych. Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie dogodnej metody uzyskiwania takich związków. Nieoczekiwanie cel ten został zrealizowany w prezentowanym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze: lub jego farmaceutycznie dopuszczalna pochodna, zwłaszcza sól albo hydrat. Korzystnie związkiem według wynalazku jest kwas 7-hydroksy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związków według wynalazku zdefiniowanych powyżej do wytwarzania leku. Korzystnie, wytwarzanym lekiem jest antybiotyk albo lek przeciwnowotworowy. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu Streptomyces sp. zdeponowanego w PCM pod numerem dostępu B/00017 do wytwarzania związku według wynalazku. Poznanie struktury nowego aktywnego związku, hamującego działanie DD-peptydaz, wykazującego stabilność wobec działania β-laktamaz, o aktywności przeciwbakteryjnej może być bardzo ważne dla antybiotykoterapii. Figura 1 prezentuje układ zawiesin bakteryjnych nanoszonych na płytkę natomiast figura 2 ukazuje wynik testu aktywności przeciwbakteryjnej substancji antybiotycznej według wynalazku w stężeniu 0,2 mg/ml podłoża: A - próba właściwa; B - próba kontrolna (bez substancji antybiotycznej). W dalszej części opisu zaprezentowano szczegółowe przykłady realizacji ujawnionego rozwiązania, które nie powinny być jednak utożsamiane z zakresem przedmiotowego wynalazku zdefiniowanym w załączonych zastrzeżeniach. P r z y k ł a d y W celu uzyskania naturalnego inhibitora DD-peptydaz, związku o właściwościach przeciwbakteryjnych prowadzono hodowlę promieniowca Streptomyces sp. 8812. Szczep ten wyodrębniono z próbki ziemi pochodzącej z Brazylii. Szczep ten został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem B/00017. Wykonano następujące etapy prac: 1. Hodowla promieniowca Streptomyces sp. 8812. 2. Oczyszczanie zewnątrzkomórkowego inhibitora DD-karboksypeptydazy/DD-transpeptydazy 64-575 II wytwarzanego przez szczep Streptomyces sp. 8812; a. Odbiałczanie supernatantu hodowli; b. Oczyszczanie metodą chromatografii cieczowej na kolumnie anionowymiennej (IRA-400, Supelco) w gradiencie ph; c. Oczyszczanie metodą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej, w gradiencie, kolumna semipreparatywna, zmodyfikowana dc18, Atlantis (Waters);
PL 213 879 B1 3 d. Oczyszczanie metodą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej, kolumna analityczna, zmodyfikowana dc18 (Atlantis, Waters) (metoda gradientowa, lub izokratyczna); e. Oczyszczanie metodą HPLC, kolumna analityczna dc18 (Atlantis, Waters). 3. Analiza: HPLC-MS, HR-MS. 4. Analizy NMR. 5. Określenie struktury chemicznej inhibitora. 6. Badanie aktywności mikrobiologicznej inhibitora. 7. Zastosowanie (badanie) związku czynnego jako inhibitora DD-peptydaz. 8. Charakterystyka inhibitora. Hodowla drobnoustroju i podłoża hodowlane 1. Hodowla na podłożu sporulacyjnym. W celu namnożenia zarodników drobnoustroju skosy z podłożem drożdżowo-słodowym zaszczepiono zarodnikami Streptomyces sp. 8812 i inkubowano przez 14 dni w temp. 28 C. Skład podłoża sporulacyjnego drożdżowo-słodowego (g/dm 3 ): Wyciąg drożdżowy (Difco) 4,0 Wyciąg słodowy (Difco) 10,0 Glukoza 4,0 Agar (Difco) 20,0 Składniki podłoża oprócz glukozy rozpuszczono w wodzie destylowanej, doprowadzono ph do 7,3, następnie dodano glukozę i sterylizowano 20 min. w temp. 117 C. 2. Hodowla na podłożu płynnym, produkcyjnym. Skład płynnego podłoża produkcyjnego (g/dm 3 ): Trypton (Difco) 17,0 Pepton (Difco) 4,0 Ekstrakt drożdżowy (Difco) 5,0 Wyciąg namokowy kukurydzy (Cerestar, Włochy) 10,0 Laktoza 10,0 CaCO 3 3,0 K 2 HPO 4 4,0 KH 2 PO 4 2,0 MgSO 4 x 7H 2 O 0,5 Składniki rozpuszczono w wodzie wodociągowej, gotowano przez 10 min., doprowadzono ph do 6,7 i przefiltrowano. Podłoże rozlano do kolb o pojemności 500 cm 3, po 40 cm 3. Sterylizowano w temp. 121 C przez 30 min. Hodowlę prowadzono w kolbach o pojemności 500 cm 3 zawierających po 40 cm 3 podłoża płynnego. Podłoże zaszczepiono 1 cm 3 zawiesiny zarodników (10 9 ) pobranych ze skosów. Inkubację prowadzono 48 godzin w temp. 28 C na wytrząsarce Series 25 Incubator Shaker (New Brunswick Scientific, Edison, New Jersey, USA) przy 240 rpm. Wzrost grzybni obserwowano przy użyciu mikroskopu fazowo-kontrastowego Docuval Carl-Zeiss (Jena, RFN). Po 20, 24 i 48 godzinach inkubacji pobierano próbki hodowli w celu wykonania oznaczenia inhibicji DD-peptydazy. Test na inhibicję DD-peptydazy 64-575 II Podczas hodowli Streptomyces sp. 8812 oraz w kolejnych etapach oczyszczania inhibitora stosowano test enzymatyczny na inhibicję DD-peptydazy 64-575 II. W ten sposób oceniano postęp w biosyntezie inhibitorów, a także wybierano frakcje o najwyższej aktywności inhibicji (która przekłada się na znalezienie związków o najwyższej aktywności przeciwbakteryjnej). Zewnątrzkomórkową DD-karboksypeptydazę/DD-transpeptydazę 64-575 II wytwarzaną przez szczep Saccharopolyspora erythraea PZH 64-575 II, otrzymano w Samodzielnej Pracowni Promieniowców i Grzybów Niedoskonałych Państwowego Zakładu Higieny. Enzym oczyszczono do jednej proteiny oraz zbadano jego właściwości fizyko-chemiczne w Centrum Inżynierii Białek i Laboratorium Enzymologii Uniwersytetu w Liège. Aktywność właściwa enzymu wynosi 50 IU/mg. Oznaczanie aktywności DD-karboksypeptydazy 64-575 II przeprowadzono wg Frère i współprac. 1976 1. Mieszanina reakcyjna do oznaczania aktywności DD-peptydaz składała się z: 60 mm 3 roztworu zawierającego 0,05 mg cm 3 dinukleotydu flawinoadeninowego (Sigma) w 0,1 M buforze Tris-HCl o ph 8,0; 10 mm 3 roztworu zawierającego 0,05 mg cm 3 peroksydazy chrzanowej o aktywności 1230 j. mg -1 (Sigma) w wodzie dest., 5 mm 3 roztworu zawierającego 5 mg cm -3 chlorku o-dianizydyny (Sigma)
4 PL 213 879 B1 w wodzie dest., 2 mm 3 roztworu zawierającego 11,77 mg cm -3 oksydazy D-aminokwasów wyodrębnionej z nerek wieprzowych (Sigma) o aktywności 6,7 j.-mg -1 w 0,1 M buforze Tris-HCl o ph 8,0. Próbki do oznaczania aktywności DD-karboksypeptydaz (a) składały się z: 10 mm 3 roztworu enzymu o stężeniu 50 μμ, 20 mm 3 roztworu zawierającego 4,52 mg cm -3 tripeptydu N, N Ac 2 -L-Lys-D- -Ala-D-Ala w 0,1 M buforze fosforanowym o ph 8,0. Próbki standardowe (b) zawierały zamiast roztworu substratu 20 mm 3 roztworu zawierającego 0,089 mg cm -3 D-alaniny (Sigma). Próbka ślepa (c) zawierała zamiast roztworu substratu 20 mm 3 0,1 M buforu fosforanowego o ph 8,0. Wszystkie próbki (a), (b), (c) przygotowywano w temp. 4 C, następnie inkubowano 30 min. w temp. 37 C, po czym umieszczano na 2 min. w łaźni wodnej o temp. 100 C. Po ochłodzeniu do próbek (a), (b) i (c) dodawano po 77 mm 3 mieszaniny reakcyjnej, a następnie inkubowano je 10 min. w temp. 37 C. Do każdej próbki dodawano 0,350 cm 3 mieszaniny zawierającej metanol, wodę destylowaną i stężony kwas siarkowy w stosunku objętościowym 5:5:6. Ekstynkcję mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm na spektrofotometrze Spekol 11 (Carl Zeis Jena, RFN). Ilość uwalnianej D-Ala odczytywano z krzywej wzorcowej. Oznaczanie inhibicji DD-peptydazy 64-575 II 10 mm 3 roztworu DD-peptydazy 64-575 II o stężeniu 50 μμ, 10 (20) mm 3 roztworu oczyszczanego inhibitora inkubowano 30 min. w temperaturze 37 C. Następnie dodawano 20 mm 3 roztworu substratu - tripeptydu i dalej postępowano jak opisano wyżej. Absorbancja próby kontrolnej enzymu (A en ) wynosiła 0,350-0,370, absorbancja prób inhibitora (A pr ) wynosiła 0,05-0,10. Wartości inhibicji obliczano w % zahamowania aktywności DD-peptydazy. [%] = 100% - ( A pr x 100%/A en ) Do badań inhibicji stosowano także zewnątrzkomórkową DD-peptydazę R39 wytwarzaną przez szczep Actinomadura sp. R39 oraz DD-peptydazę R61 wytwarzaną przez szczep Streptomyces sp. R61 otrzymane od profesora Jean-Maria Ghuysena. Oznaczenia wykonywano analogicznie, używając enzymów o stężeniu odpowiednio 0,05 mg/ml i 7,5 μg/ml. Oznaczanie inhibicji aktywności β-laktamaz metodą nitrocefinową (O'Callaghan i współprac. 1972) 2 Odczynniki użyte do badań: 0,1 mm roztwór nitrocefiny przygotowywany z: 0,5 mg nitrocefiny (Glaxo), 0,5 cm dimetylosulfotlenku (Fluka), 9,5 cm 3 0,1 M buforu fosforanowego o ph 7,0; β-laktamaza klasy A (penicylinaza, Penase, 5 x 10 6 IU/ml, Bacto). Do 20 mm 3 roztworu badanego inhibitora w 0,1 M buforze fosforanowym o ph 7,0 dodawano 10 mm 3 β-laktamazy, inkubowano 30 min. w temp. 37 C. Następnie dodawano 30 mm 3 0,1 mm roztworu nitrocefiny, 430 mm 3 0,1 M buforu fosforanowego ph 7,0. Próbki inkubowano 10 min. w temperaturze 37 C i oznaczano spektrofotometrycznie przy długości fali 482 nm. Molowy współczynnik ekstynkcji wynosi 15000 M -1 cm -1. Nie zaobserwowano różnicy absorbancji, porównując próbę kontrolną (inkubacja β-laktamazy z nitrocefiną) do próby z inhibitorem. Badany inhibitor nie wykazywał inhibicji β-laktamazy klasy A. Oznaczanie stabilności inhibitora w środowisku β-laktamaz Opracowano metodę badania stabilności inhibitora wykorzystując kombinację dwóch wyżej opisanych metod. Przeprowadzono wstępną inkubację inhibitora z β-laktamazą następnie dodano odczynniki do oznaczania inhibicji DD-peptydazy. Absorbancja próby badanej wynosiła 0,05, próby kontrolnej (DD-peptydazy) wynosiła 0,35. Okazało się, że po inkubacji z β-laktamazą inhibitor zachowuje swoje właściwości inhibicji DD-peptydazy 64-575 II, tzn. jest stabilny w środowisku β-laktamaz (nie jest hydrolizowany przez β-laktamazy). Oczyszczanie inhibitora Pierwszy etap oczyszczania inhibitora DD-peptydazy 64-575 II Około 10 dm 3 brzeczki fermentacyjnej odwirowywano 60 min przy 8000 obr./min. (wirówka Model J-21C Centrifuge, Beckman, USA). Otrzymany supernatant odbiałczano dodając aceton do osiągnięcia stężenia 70% i wytrząsano w temp. pokojowej przez około godzinę. Wytrącone białka odwirowywano w temp. 5 C przy 8000 obr./min. (Model J-21C Centrifuge; Beckman, USA). Następnie aceton odparowano na wyparce próżniowej (Unipan, Polska). Całość liofilizowano przez 24 godz. (aparat Beta 1-8 Christ, RFN). Otrzymany liofilizat poddano testowi na inhibicję DD-peptydazy. Drugi etap oczyszczania inhibitora DD-peptydazy 64-575 II Odbiałczony liofilizat supernatantu hodowli szczepu 8812 nanoszono porcjami (po 1,7g w 20 ml wody) na przekształcaną w formę octanową żywicę anionowymienną IRA 400 (Supelco). Żywicę umieszczono w kolumnie 1,5 cm x 22 cm. Do badań stosowano średniociśnieniowy chromatograf
PL 213 879 B1 5 cieczowy BioLogic System (Bio-Rad, USA) wyposażony w detektor UV-VIS i kolektor frakcji. Naniesiony liofilizat przemywano wodą destylowaną, do momentu uzyskania zerowej absorbancji przy długości fali 254 nm. Rozdział wykonano w gradiencie ph, stosując kolejno: 0,5 M kw. octowy (0,61 - frakcje 1-77), 1 M kwas octowy (0,51 - frakcje 78-117) i 2 M kw. octowy (0,31- frakcje 118-119). Zbierano 8 ml frakcje, które zamrażano, liofilizowano, a następnie oznaczano aktywność inhibicji. Wysoką aktywność inhibicji uzyskano w frakcjach 0,5 M i 1 M kwasu octowego, a także niewielką aktywność w frakcjach 2 M kwasu octowego. Rozdziały wykonywano wielokrotnie i gromadzono aktywne frakcje do dalszych etapów oczyszczania. T a b e l a 1 Oznaczenie inhibicji DD-karboksypeptydazy/DD-transpeptydazy 64-575 II we frakcjach po rozdziale na żywicy anionowymiennej Amberlite IRA-400 * Do oznaczenia wzięto 0,05 mg liofilizatu frakcji. Numer frakcji Inhibicja [%]* 3, 4, 5 13,85 6, 7, 8 19,9 9, 10, 11 25,7 12, 13, 14 51,9 18, 19, 20 49,0 30, 31, 32 27,5 36, 37, 38 42,7 53, 54, 55 56,6 59, 60, 61 60,2 68, 69, 70 9,8 78, 79, 80 19,2 Trzeci etap oczyszczania inhibitora DD-peptydazy 64-575 II Wybrane frakcje 53-61 (po oczyszczaniu na żywicy anionowymiennej) o najwyższej aktywności inhibicji enzymu R61 oczyszczano na kolumnie semipreparatywnej do HPLC ze zmodyfikowaną odwróconą fazą dc18 (Atlantis, 10 μm, 1,0 cm x 25 cm, Waters) metodą chromatografii średniociśnieniowej (Bio-Logic System, Bio Rad), długość fali 214 nm. Na kolumnę nanoszono 25-30 mg liofilizatu w 100 μl 0,05% TFA. Program do oczyszczania inhibitorów DD-peptydazy układano komputerowo (program BioLogic, Bio-Rad, USA). Zaprojektowaną metodą posługiwano się wielokrotnie. Przepływ rozpuszczalnika wynosił 4,7 ml/min. Zbierano frakcje o objętości 6 ml. Fazą ruchomą był 0,05 % TFA (roztwór A) oraz 30% acetonitryl plus 70% TFA (0,1%) (roztwór B). Stosowano kombinację rozdziału izokratyczno-gradientowego: 10 ml roztworu A, następnie liniowy gradient od 0% do 19% roztworu B w objętości 175 ml. Zebrane frakcje liofilizowano i badano na obecność inhibitora (hamowanie aktywności DD-peptydazy 64-575 II). Wykryto inhibicję w kilku frakcjach, przy różnym % roztworu B. Prawdopodobnie rozdzielono kilka inhibitorów. Maksimum inhibicji (95-100%) wykazywały frakcje (13-15), które były eluowane z kolumny przy 9-11% roztworu B. Z frakcji 13-15 otrzymywano po ok. 0,5-1,0 mg aktywnej substancji. Rozdziały na kolumnie Atlantis wykonywano wielokrotnie i gromadzono aktywne frakcje do dalszego oczyszczania. Czwarty etap - oczyszczanie wybranego inhibitora DD-peptydazy 64-575 II Do dalszego oczyszczania metodą chromatografii średniociśnieniowej (Bio-Logic System, Bio Rad) użyto kolumny analitycznej ze zmodyfikowaną, odwróconą fazą (Atlantis, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm, Waters), długość fali 214 nm, Na kolumnę nanoszono 0,2 (0,15) mg próbki rozpuszczonej w 50 μl 0,05% (obj.) roztworu TFA. Próbkę stanowił liofilizat aktywnych frakcji 13-15 (eluowanych przy 9-11% roztworu B) po rozdziale chromatograficznym na kolumnie semipreparatywnej Atlantis dc18. Stosowano następujące eluenty: roztwór A - 0,05% TFA, roztwór B - 20% acetonitryl plus 80% TFA (0,1%). Otrzymano mikrogramowe ilości oczyszczanego inhibitora, który był wymywany z kolumny przy stężeniu 2% roztworu B (elucja izokratyczna) po 35,5 min.
6 PL 213 879 B1 Piąty etap - całkowite oczyszczenie inhibitora DD-peptvdazy 64-575 II Inhibitor oczyszczano powtarzając procedurę opisaną w czwartym etapie. Analiza widm NMR i MS potwierdza całkowite oczyszczenie inhibitora. T a b e l a 2 Wydajność uzyskania oczyszczanego inhibitora z materiału wyjściowego Etapy prac Ilość uzyskanego materiału po każdym etapie Stosunek ilościowy materiału po każdym etapie oczyszczania do odbiałczanego liofilizatu [%] Brzeczka fermentacyjna 1148 cm 3 - Supernatant hodowli 840 cm 3-1. etap oczyszczania; odbiałczony liofilizat 22 g 100 2. etap oczyszczania; BioLogic, żywica anionowymienna 0,15 g 0,68 3. etap oczyszczania; BioLogic, kolumna dc 18 semiprep. 10 mg 0,045 4. etap oczyszczania; BioLogic, kolumna analit. dc 18 3 mg 0,014 5. etap oczyszczania; HPLC kolumna analit. dc 18, pojedynczy inhibitor 2,0 mg 0,009 Analizy 1. Określenie masy cząsteczkowej inhibitora metodą spektrometrii mas a) Wykonano analizę HPLC-MS (HPLC-Hewlett Packard 1100, MS - API 365 Turbo Ionspray firmy PE SCIEX). Stosowano kolumnę analityczną dc18, Atlantis (Waters). Jako fazę ruchomą użyto 0,05% kwas octowy i acetonitryl 98:2; przepływ 1 ml/min; nastrzyk 20 μl; długość fali 214 nm. Warunki MS: potencjał deklasteringu 20 V, potencjał ogniskujący 200 V. W trybie jonów dodatnich uzyskano pik molekularny o masie 208,1 m/z, w trybie jonów ujemnych pik molekularny o masie 206,1 m/z. Wyliczona masa cząsteczkowa badanego inhibitora wynosi 207,1 Da. b) Przeprowadzono fragmentację inhibitora (MS/MS) przy użyciu spektrometru mas API 365 Turbo Ionspray firmy PE SCIEX. Otrzymano następujące fragmenty: 162,2 (fragmentacja świadcząca o obecności grupy karboksylowej); 134,1; 116,0; 59,1 m/z. c) Wykonano dokładny pomiar masy (HR - MS) inhibitora przy użyciu aparatu Bruker APEX-Q (9.4T) oraz metody jonizacji ESI w trybie jonów dodatnich. Warunki: napięcie na igle wynosiło 3500 V, Napięcie shield 3000 V, temperatura igły 200 C, próbkę rozpuszczono w roztworze kw. octowego i dodano metanol. Zastosowano kalibrację zewnętrzną. Zaproponowany wzór sumaryczny wynikający z dokładnego pomiaru masy jest następujący: masa jonu molekularnego (M+H) + otrzymana z pomiaru wynosi 208,06040 m/z, natomiast masa wyliczona wynosi 208,06043 m/z. Program komputerowy zaproponował wzór inhibitora, który przedstawia się następująco: C 10 H 10 NO 4 (dla m/z). W związku z tym można zaproponować następujący wzór sumaryczny: C 10 H 9 NO 4. Masa cząsteczkowa oczyszczonego inhibitora wynosi 207,05258 Da. 2. Analiza IR Uzyskano widmo inhibitora w podczerwieni (Perkin Elmer Spectrum 2000). Próbkę przygotowano poprzez ucieranie w KBr. Uzyskano następujące maksima: 3436 cm -1 (grupa hydroksylowa, hydroksylowa pochodząca od grupy karboksylowej); 1681 cm -1, 1636 cm -1 (układ -C=C-N-, -C=C-O-); 1075 cm -1, 1131 cm -1 (układ -C-O-H), 724 cm -1, 804 cm -1, 894 cm -1, 986 cm -1 (układ -C=C-). 3. Analizy NMR Wykonano analizę 1 H-NMR (400 MHz, Varian) oraz 13 C NMR (700 MHz,). Próbki rozpuszczono w H 2 O/D 2 O, 9:1 1 H NMR H 2 O/D 2 O (90:10 vol.%) ph 7.4 Na 2 HPO 4 δ, ppm; 3.03 (dd, 2 J=17.1, 3 J=9.3); 3.15 (dd, 2 J=17.1, 3 J =7.3); 4.27 (dd, 3 J=7.3, 3 J=9.3); 6.42 (s); 6.92 (s); 8.12 (s); 13 C NMR δ, ppm; 29.2, 55.6, 110.6, 117.1, 117.2, 135.0, 146.6, 159.5, 168.8, 175.1.
PL 213 879 B1 7 Określenie struktury cząsteczki W bazie danych Beilstein (2006 r) znaleziono ok. 640 struktur odpowiadających wzorowi sumarycznemu C 10 H 9 NO 4. Analiza widm NMR pozwoliła na określenie struktury analizowanego inhibitora. Jest to kwas 7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy. Nie znaleziono przedstawionego związku w bazach danych Beilstein oraz Chemical Abstracts. Związek ten jest nową, poznaną strukturą. Wytwarzany jest na drodze biosyntezy przez szczep Streptomyces sp. 8812 w podłożu płynnym zawierającym organiczne źródło węgla i azotu. Wykazuje właściwości przeciwbakteryjne. Bardzo interesujące jest hamowanie wzrostu Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637, bakterii która dostarcza wielu problemów klinicznych (wytwarza trzy rodzaje β-laktamaz w tym metalo-β-laktamazę klasy B). Badania hamowania aktywności DD-peptydaz R61, R39 przez oczyszczany inhibitor, alkaloid izochinoliny Inhibicję DD-peptydaz wyrażano wartością ID50(M) określającą molowe stężenie inhibitora, który hamuje aktywność enzymu o 50%. 1) Powinowactwo DD-peptydazy R39 do kwasu 7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino- 3-karboksylowego wyrażone wartością ID50(M) wynosi ID50(M)=4,5 x 10-4 M. 2) Powinowactwo DD-peptydazy R61 do badanego inhibitora wynosi ID50(M)=6,75 x 10-4 M. Oznaczono także czas trwania kompleksu inhibitor-enzym. Przeprowadzano inkubację od kilku do kilkudziesięciu godzin roztworu każdego enzymu z inhibitorem i substratem (analogicznie jak opisano wyżej). Następnie dodawano mieszaninę reakcyjną i dalej przeprowadzano oznaczanie. 1. Czas trwania kompleksu inhibitor-dd-peptydaza R39 wynosi 3,5 godz. 2. Czas trwania kompleksu inhibitor-dd-peptydaza R61 wynosi ok. 33 godz. Kompleks DD-peptydaza R61-inhibitor jest znacznie bardziej stabilny niż enzymu R39. Czas trwania kompleksu DD-peptydaza R61-inhibitor wynosi kilkadziesiąt godz. Jest to wartość zbliżona do trwałości kompleksów DD-peptydaz z antybiotykami β-laktamowymi. Ma to znaczenie dla aktywności przeciwbakteryjnej. Badania mikrobiologiczne Aktywność przeciwbakteryjną badanego związku oznaczano metodą kolejnych seryjnych rozcieńczeń substancji w podłożu stałym (określenie wartości MIC) oraz metodą krążkowo-dyfuzyjną. Badano frakcje inhibitora po oczyszczaniu na kolumnie anionowymiennej (o najwyższej aktywności inhibicji DD-peptydazy po 0,5M kwasie octowym). Wzorcowe szczepy bakterii stosowane w badaniu: 1. Enterococcus faecalis ATCC 29219, 2. Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637 3. Burkholderia cepacia ATCC 25416 4. Acinetobacter baumanii ATCC 19606 5. Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 6. Escherichia coli ATCC 25922 7. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 8. Escherichia coli NCTC 8196 9. Proteus vulgaris NCTC 4635 10. Staphylococcus aureus ATCC 6538P 11. Staphylococcus aureus NCTC 4163 Na płytkę Petriego wylewano po 0,25 ml badanej próbki (rozpuszczonej w wodzie) i dopełniano podłożem agarowym MH II (Muller Hinton II) do objętości 5 ml. Stężenie substancji antybiotycznej wynosiło 0,2 mg/ml podłoża. Dodatkowo wykonano kontrolę bez substancji antybiotycznej zawierającą 5 ml podłoża MH II. Przy użyciu densytometru sporządzono zawiesiny bakterii w roztworze chlorku sodu o gęstości 0,5 McF (10 8 CFU/ml) a następnie wykonano ich rozcieńczenia. Przygotowano szereg rozcieńczeń uzyskując następujące stężenia: - 10 4 CFU/ml NaCl dla szczepów: 6, 7, 8, 9-10 5 CFU/ml NaCl dla szczepów: 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11 Po zestaleniu podłoża nanoszono na płytkę po 2 μl zawiesiny bakteryjnej każdego szczepu otrzymując tym samym stężenia 10 2 CFU/ml dla szczepów: 6, 7, 8, 9 oraz 10 3 CFU/ml dla szczepów
8 PL 213 879 B1 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11. Zawiesiny bakteryjne nanoszono na każdą płytkę w dwóch powtórzeniach. Inkubację prowadzono 16 godz. w temperaturze 35 C. Stwierdzono aktywność inhibitora wobec szczepów wzorcowych: Proteus vulgaris NCTC 4635, wartość MIC 0,2 mg/ml; Bordetella bronchiseptica ATCC 4617, wartość MIC 0,2 mg/ml, Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637, wartość MIC 0,2 mg/ml. Dla pozostałych szczepów wartości MIC badanych próbek wynosiły >0,2 mg/ml. Oznaczono aktywność inhibitora wobec bakterii metodą krążkowo-dyfuzyjną. Do badań użyto szczepów: Proteus vulgaris NCTC 4635, Bordetella bronehiseptica ATCC 4617, Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637. Z 24 godz. hodowli bakterii sporządzono zawiesinę bakterii o gęstości 0,2 McF, którą następnie rozcieńczono stukrotnie. 0,1 ml tak przygotowanej zawiesiny bakterii posiano na płytkę z podłożem Muller-Hintona. Naniesiono krążki z badanymi frakcjami inhibitora i inkubowano w 35 C. Wynik odczytano po 15 i 18 godz. Uzyskano następujące strefy zahamowania wzrostu przy stężeniu inhibitora 0,4 mg/krążek): Proteus vulgaris NCTC 4635-20 mm (po 15 godz.), 19 mm (po 18 godz.); Bordetella bronchiseptica ATCC 4617-19 mm (po 15 godz.), 19 mm (po 18 godz.) Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637-16 mm (po 15 godz.), 15 mm (po 18 godz.) Badanie aktywności przeciwgrzybiczej Badano frakcje inhibitora po 2 etapie oczyszczania na kolumnie anionowymiennej, wykazujące wysoki procent zahamowania aktywności DD-peptydazy 64-575 II. Na płytce Petriego z podłożem stałym Sabouranda z 4% roztworem glukozy rozprowadzono zawiesinę Candida albicans ATCC 10231 o gęstości 0,02 McF. Następnie naniesiono krążki bibuły nasączone roztworem inhibitora (1 mg). Inkubację prowadzono w temp. 35 C przez 24 h. Inhibitor nie wykazuje aktywności przeciwgrzybiczej wobec Candida albicans ATCC 10231. Charakterystyka inhibitora 1) Ciało stałe, barwa żółta. 2) Rozpuszczalność inhibitora. Inhibitor jest rozpuszczalny w buforze fosforanowym o ph 7,2-8,0; rozpuszczalny w środowisku wodnym z niewielkim dodatkiem jonów K +, Na +. Rozpuszcza się także w metanolu, DMSO, ale w rozpuszczalnikach tych ulega degradacji. Nie jest rozpuszczalny w octanie etylu, chlorku metylenu, chloroformie, octanie amylu, acetonitrylu. 3) Stabilność inhibitora wobec β-laktamazy klasy A: inhibitor po 24 godz. inkubacji z β-laktamazą w temp. pokojowej wykazywał całkowitą stabilność inhibicji DD-peptydaz. Literatura 1) Frère J.-M., et al. Exocellular DD-carboxypeptidases-transpeptidases from Streptomyces. Methods Enzymol., 1976, 45, 610-636. 2) O'Callaghan C.H., et al Novel method for detection of β-lactamase by using a chromogenic cephalosporin substrate. Antimicrob. Agents Chemother., 1972, 1, 283-288. 1. Związek o wzorze: Zastrzeżenia patentowe lub jego farmaceutycznie dopuszczalna pochodna, zwłaszcza sól albo hydrat.
PL 213 879 B1 9 2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest to kwas 7-hydroksy-6-oxo-2,3,4,6- -tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy. 3. Zastosowanie związku według zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wytwarzanym lekiem jest antybiotyk albo lek przeciwnowotworowy. 5. Zastosowanie szczepu Streptomyces sp. zdeponowanego w PCM pod numerem dostępu B/00017 do wytwarzania związku według zastrz. 1-2.
10 PL 213 879 B1 Rysunki Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)