II. Badanie lekowrażliwości drobnoustrojów ćwiczenia praktyczne. Ćwiczenie 1. Oznaczanie lekowrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową

Transkrypt

1 II. Badanie lekowrażliwości drobnoustrojów ćwiczenia praktyczne Ćwiczenie 1. Oznaczanie lekowrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową Zasada metody: Krążki bibułowe nasycone odpowiednimi ilościami antybiotyków nakłada się na powierzchnię podłoża Muellera Hintona z wysianym szczepem bakterii. Antybiotyk dyfunduje z krążka do podłoża agarowego hamując wzrost szczepu wrażliwego wokół krążka. Po okresie inkubacji mierzy się średnicę strefy zahamowania wzrostu wokół krążka w milimetrach. Wykonanie oznaczenia: I. Przygotowanie zawiesiny (inokulum) badanego szczepu. a. Metoda bezpośredniego zawieszania kolonii badanego szczepu w bulionie lub jałowym roztworze soli fizjologicznej (0,85% NaCl), do zmętnienia równego 0,5 w skali Mc Farland a wytrząsać około sek. b. Metoda standardowa (wzrost w fazie logarytmicznej) w której 4-5 wyizolowanych kolonii przesiewa się na bulion i inkubuje 2-8h w C, aż do uzyskania zmętnienia 0,5 w skali Mc Farland a. II. Nie później niż w ciągu 15 od przygotowania zawiesiny (nie wcześniej niż przed upływem 3 ) wykonać posiew inokulum wg schematu: III. Nie później niż w ciągu 15 od wykonania posiewu nałożyć krążki. IV. Nie później niż w ciągu 15 od nałożenia krążków wstawić płytki do cieplarki. V. Inkubować godzin w temp C w warunkach tlenowych. VI. Odczyt wyników i ich interpretacja. Na podłożach przeźroczystych, odczytać średnicę zahamowania wzrostu wokół krążka z antybiotykiem, trzymając płytkę 5-8 cm nad czarną powierzchnią oświetloną z boku, z dokładnością do 1 mm, przykładając miarkę od tyłu.

2 Na podłożach nieprzeźroczystych oświetlić płytkę światłem padającym z boku pod kątem 45 0 i odczytać strefę zahamowania wzrostu (nie odczytywać strefy hemolizy) Antybiotyk Strefa zahamowania wzrostu w mm Interpretacja wyniku W wyniku podać interpretacje wg tabel dostarczonych przez producenta krążków. Interpretacja wyniku: wrażliwy, słabo wrażliwy, oporny Przykład odczytu:

3 Ćwiczenie 2. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości z przykładowych płytek Wykonanie odczytu: Na podłożach przeźroczystych, odczytać średnicę zahamowania wzrostu wokół krążka z antybiotykiem, trzymając płytkę 5-8 cm nad czarną powierzchnią oświetloną z boku, z dokładnością do 1 mm, przykładając miarkę od tyłu Na podłożach nieprzeźroczystych oświetlić płytkę światłem padającym z boku pod kątem 45 0 i odczytać strefę zahamowania wzrostu (nie odczytywać strefy hemolizy) 1. Wynik badania lekowrażliwości dla szczepu... Antybiotyk Strefa zahamowania wzrostu w mm Interpretacja wyniku Ćwiczenie 3. Interpretacja wyniku oznaczania MIC metodą E-testów Zasada metody: Badanie ilościowe przy użyciu E-testów pozwala określić wartość MIC w oparciu o dyfuzję do podłoża z wzrastającymi bakteriami, antybiotyku zawartego w pasku plastikowym w odpowiednim gradiencie stężeń. (od najwyższego do najniższego) Wykonanie oznaczenia:

4 1. Przygotować podłoże MHA. 2. Przygotować zawiesinę bakteryjną o gęstości 0,5 McFarlanda. 3. Nanieść 100 µl zawiesiny na płytkę i rozprowadzić w trzech kierunkach lub nanieść zawiesinę wymazówką na płytkę rozprowadzając w trzech kierunkach; stosować jedną wymazówkę na jedna płytkę. 4. Nanieść pasek z antybiotykiem. 5. Inkubować w 35 C w atmosferze tlenowej przez 48 godzin. 6. Odczytu dokonać w świetle przechodzącym z użyciem lupy po 24 i 48 godzinach. Obecność pojedynczych kolonii i podrost w strefie zahamowania wzrostu wokół paska traktować należy jako oporność na dane stężenie antybiotyku. Wykonanie ćwiczenia: dokonać pomiaru odczytu wartości MIC antybiotyk szczep Odczyt wartości MIC Ćwiczenie 4. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą seryjnych rozcieńczeń. Zaletą tej metody jest oznaczanie najmniejszego stężenia leku hamującego wzrost drobnoustrojów (MIC) Wykonanie: oznaczenie lekowrażliwości tą metodą może być wykonane: - w probówkach metoda makrorozcieńczeń - w płytkach titracyjnych metoda mikrorozcieńczeń Wykonanie oznaczenia: Wykonać szereg dwukrotnych rozcieńczeń badanego antybiotyku w bulionie Muller a-hinton a wg schematu:

5 1. Jałowe probówki w statywie napełnić podłożem w ilości 2 cm 3, a następnie do 1 probówki dodać 2 cm 3 roztworu zawierającego antybiotyk w określonym stężeniu (w mg/dm 3 ). 2. Po wymieszaniu z 1 probówki przenieść jałową pipetą 2 cm 3 do drugiej probówki. 3. Dalsze rozcieńczenia wykonuje się w analogiczny sposób, aż do ostatniej probówki, z której odrzuca się 2 cm Do tak wykonanego szeregu rozcieńczeń dodać zawiesiny drobnoustrojów. (Przygotowując zawiesinę wyjściową o gęstości 1 x 10 8 komórek co odpowiada zmętnieniu 0,5 w skali Mc Farlanda) 5. Dodać taką ilość zawiesiny, aby gęstość końcowa w probówce wynosiła 5 x 10 5 komórek na cm Po przygotowaniu całość inkubować godzin w temperaturze 35 0 C. 7. Po inkubacji określić, w której probówce nie stwierdza się zmętnienia podłoża (wzrostu badanego szczepu), i która poprzedza probówkę, w której zmętnienie następuje. antybiotyk szczep Odczyt wartości MIC