PL B1. UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 11/11

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C07C 337/06 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Nowe 1,4-dipodstawione pochodne tiosemikarbazydu oraz sposób ich wytwarzania (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE, Lublin, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 11/11 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/13 (72) Twórca(y) wynalazku: TOMASZ PLECH, Skarżysko-Kamienna, PL MONIKA WUJEC, Lublin, PL URSZULA KOSIKOWSKA, Lublin, PL ANNA MALM, Lublin, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Bełz PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są nowe 1,4-dipodstawione pochodne tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupy: 4-jodofenylową, 2-jodofenylową, 2-bromofenylową, 2,5-difluorofenylową, sposób ich wytwarzania i aktywność przeciwbakteryjna. Dane literaturowe (Umut Salgin-Göksen i wsp. - Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2007, 15, ) dowodzą, iż 1,4-dipodstawione pochodne tiosemikarbazydu mogą wykazywać działanie przeciwdrobnoustrojowe. Przykładowo 1-[2-(5-metylo-2-benzoksazolinon-3-ylo)acetylo]-4-etylotiosemikarbazyd jest aktywny wobec Staphylococcus aureus (MIC=256 μg/ml). Enterococcus faecalis (MIC=512 μg/ml) i Escherichia coli (MIC=256 μg/ml) a 1-[2-(5-metylo-2-benzoksazolinon-3- -ylo)acetylo]-4-fenylo-tiosemikarbazyd wobec tych samych szczepów bakteryjnych wykazuje aktywność równą odpowiednio: MIC=256 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml. Aktywność 1,4-dipodstawionych pochodnych tiosemikarbazydu potwierdzają również inni autorzy (Sherif A. F. Rostom i wsp., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2009, 17, ). Zgłaszający prowadzili badania ukierunkowane na syntezę nowych 1,4-dipodstawionych pochodnych tiosemikarbazydu i oznaczenie ich aktywności. W wyniku badań otrzymano nowe związki, które stanowią 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4- -podstawione tiosemikarbazydu, gdzie R oznacza grupy: 4-jodofenylową, 2-jodofenylową, 2-bromofenylową, 2,5-difluorofenylową, wykazujące znaczącą aktywność przeciwbakteryjną. Otrzymane według wynalazku pochodne mogą znaleźć zastosowanie do wytwarzania leków przeznaczonych do leczenia pacjentów z objawami zakażeń wywołanych przez potencjalnie (np. Staphylococcus aureus) lub warunkowo (np. Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus lub Micrococcus luteus) chorobotwórcze bakterie Gram-dodatnie. Ze względu na stale narastającą oporność bakterii na różne czynniki przeciwdrobnoustrojowe, w tym szeroko stosowane antybiotyki i chemioterapeutyki lub środki odkażające, bardzo istotne wydaje się poszukiwanie nowych preparatów, skutecznych w zapobieganiu lub zwalczaniu chorób o etiologii bakteryjnej, zwłaszcza gronkowcowej. Problem rozprzestrzeniania się oporności dotyczy wszystkich bakterii, które mogą być czynnikiem etiologicznym często groźnych dla życia infekcji, zarówno potencjalnych patogenów (m.in. gronkowca złocistego) jak i drobnoustrojów oportunistycznych (m.in. gronkowca naskórkowego), występujących w środowisku lub wchodzących w skład naturalnej mikroflory człowieka. Gronkowiec złocisty, w stosunku do którego wykazano aktywność nowych pochodnych, należy do drobnoustrojów wywołujących liczne infekcje zarówno miejscowe jak i ogólnoustrojowe, często o bardzo ciężkim przebiegu. Jest on często izolowany jako czynnik etiologiczny zakażeń szpitalnych, wywołuje posocznice lub bakteriemie, zakażenia ran operacyjnych, zapalenia wsierdzia, kości, stawów, płuc, opon mózgowo-rdzeniowych, zatrucia pokarmowe. Bardzo dużym problemem w przypadku tego drobnoustroju jest stale narastająca oporność na różne środki przeciwdrobnoustrojowe, w tym szeroko stosowane antybiotyki i chemioterapeutyki oraz coraz mniejsze możliwości eradykacji tego drobnoustroju znanymi obecnie metodami. Szczególne problemy stwarza leczenie zakażeń wywołanych przez gronkowca złocistego metycylinoopornego (MRSA), należącego do mikroorganizmów wieloopornych, tzn. wykazujących brak wrażliwości na co najmniej trzy leki z różnych grup terapeutycznych. W normalnych warunkach mikroorganizmy oportunistyczne, m.in. Staphylococcus epidermidis, obojętne lub przyjazne dla zdrowego organizmu, mogą stać się czynnikami etiologicznym zakażeń endogennych, często o przewlekłym charakterze i trudnych do leczenia. Drobnoustroje te, należące do naturalnej mikroflory, mogą być dla innych mikroorganizmów źródłem genów warunkujących chorobotwórczość albo oporność na czynniki przeciwdrobnoustrojowe. Zakażeniom oportunistycznym sprzyjają zakłócenia stanu równowagi w naturalnej mikroflorze lub miejscowa albo ogólne zaburzenia odporności organizmu np. u osób w skrajnych grupach wiekowych, pacjentów po zabiegach chirurgicznych lub diagnostycznych, zwłaszcza połączonych z naruszeniem ciągłości tkanek, z immunosupresją lub po zastosowaniu antybiotyków, długi pobyt w ośrodkach opieki medycznej. Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania związków o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupy: 4-jodofenylową, 2-jodofenylową, 2-bromofenylową, 2,5-difluorofenylową, polegający na tym, że hydrazyd kwasu 3-chlorobenzoesowego o wzorze ogólnym 2 poddaje się reakcji z izotiocyjanianami o wzorze ogólnym 3, w którym R ma wyżej podane znaczenie, przy czym reakcję prowadzi się w stosunku molowym 1:1, w stopie lub w rozpuszczalnikach jak, a korzystnie w środowisku 95% alkoholu etylowego, w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 2-5 minut, a następnie powstałe produkty reakcji 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4-podstawione tiosemikarbazydu

3 PL B1 3 o wzorze ogólnym 1, w którym R ma podane wyżej znaczenie, odsącza się, przemywa rozpuszczalnikiem, korzystnie eterem dietylowym, po czym suszy się i krystalizuje z rozpuszczalnika polarnego, korzystnie z etanolu. Zastosowanie 95% alkoholu etylowego jako środowiska reakcji skraca znacząco czas reakcji do 2-5 minut. Korzystnie gdy jako rozpuszczalniki stosuje się w reakcji metanol, N,N- -dimetyloacetamid, N,N-dimetyloform. Minimalne stężenie hamujące (MIC) nowych związków jest do dwudziestu razy mniejsze niż związków otrzymywanych w stanie techniki, co pozwala stosować je jako substancje aktywne do wytwarzania leków przeciwbakteryjnych. P r z y k ł a d I: 1,7 g (0,01 mola) hydrazydu kwasu 3-chlorobenzoesowego oraz 2,14 g (0,01 mola) izotiocyjanianu 2-bromofenylu rozpuszczono w 95% alkoholu etylowym i ogrzewano w kolbce okrągłodennej pod chłodnicą zwrotną w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 5 minut. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono, produkt reakcji odsączono, przemyto eterem dietylowym, wysuszono i przekrystalizowano z etanolu. Otrzymano 3,31 g (86% wydajności teoretycznej) 4-(2-bromofenylo)-1- -[(3-chlorofenylo)karbonylo]tiosemikarbazydu (1) o temperaturze topnienia C. Właściwą budowę związku oraz jego czystość potwierdzono przez wykonanie widm IR, 1 H NMR oraz analizy elementarnej (Tabela 2). P r z y k ł a d II: opisanym w przykładzie I sposobem otrzymano pochodne 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4-podstawione tiosemikarbazydu (2-4) przedstawione w Tabeli 1. Właściwą budowę związków oraz ich czystość potwierdzono przez wykonanie widm IR, 1 H NMR oraz analizy elementarnej (Tabela 2, dane dotyczą wyłącznie nowozsyntetyzowanych pochodnych). P r z y k ł a d III: Ocenę aktywności mikrobiologicznej nowych związków przeprowadzono zgodnie z referencyjną metodą rozcieńczeń w podłożu agarowym Mueller-Hinton (wg CLSI, dokument M7-A7, 2008 r.) na przykładzie 6 szczepów wzorcowych (w tym dwa gronkowca złocistego) oraz 12 szczepów klinicznych Staphylococcus aureus i zamieszczono w Tabelach 3 i 4. W badaniach wykorzystano 6 szczepów referencyjnych bakterii Gram-dodatnich z kolekcji (American Type Culture Collection; Staphylococcus aureus 25923, Staphylococcus aureus 6538, Staphylococcus epidermidis 12228, Bacillus subtilis 6633, Bacillus cereus i Micrococcus luteus 10240), oraz 12 izolatów klinicznych Staphylococcus aureus. Dla każdego szczepu przygotowywano zawiesinę bakteryjną (inokulum) o gęstości wyjściowej 0.5 w skali McFarlanda x 10 6 CFU (Colony Forming Units)/mL w 0,85% NaCl. Celem otrzymania roztworów podstawowych o stężeniu 50 mg/ml badane związki rozpuszczano w DMSO (dimetylosulfotlenek). Przeciwdrobnoustrojową aktywność badanych pochodnych oznaczano na płytkach Petriego, w których metodą seryjnych rozcieńczeń w podłożu agarowych Mueller- -Hinton uzyskiwano podwójne rozcieńczenia badanych związków w zakresie stężeń końcowych od 1,96 do 1000 μg/ml. Po zastygnięciu podłoża płytki suszono i dzielono na sektory, na które nanoszono po 20 μl inokulum bakteryjnego. Oznaczenia aktywności przeciwgronkowcowej na szczepach klinicznych prowadzono w zakresie stężeń 1,9-62,5 μg/ml. Tak przygotowane płytki preinkubowano w temperaturze pokojowej przez 1,5 h, następnie inkubowano w temperaturze 35 ± 2 C przez 24 godziny. Po inkubacji oznaczano wartość MIC (minimal inhibitory concentration - najmniejsze stężenie hamujące), definiowaną jako najniższe stężenie badanego związku w podłożu, przy którym wzrokowo nie obserwowano wzrostu bakterii. Wyniki porównywano z namnażaniem się bakterii na podłożu agarowym bez dodatku badanych substancji. Nie wykazano wpływu DMSO w zastosowanych stężeniach na namnażanie i wzrost badanych bakterii. Zgodnie z uzyskanymi wynikami, otrzymane pochodne charakteryzowała zróżnicowana (MIC 15, μg/ml) aktywność wobec badanych bakterii Gram-dodatnich. Wszystkie badane pochodne wykazywały aktywność wobec szczepów referencyjnych S. aureus i S. aureus 6533 (MIC = 31,25-62,5 μg/ml). Największą aktywność wobec izolatów gronkowca złocistego pozyskanych od pacjentów wykazywały związki 2, 3 (MIC = 15,63 μg/ml), nieco mniejszą pochodne 1, 4 (MIC = 15,63-31,25 μg/ml). Z pozostałych wykorzystywanych w badaniu szczepów referencyjnych największą wrażliwością na badane substancje charakteryzowały się Bacillus cereus i Bacillus subtilis 6638 (MIC = 15, μg/ml), a nieco mniejszą Micrococcus luteus (MIC 31,25-62,5 μg/ml) i Staphylococcus epidermidis (MIC = 31, μg/ml).

4 4 PL B1 T a b e l a 1. Czas reakcji, wydajność i temperatura topnienia pochodnych 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4- -podstawionych tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupy: 4-jodofenylową, 2-jodofenylową, 2,5-difluorofenylową Nazwa związku Czas reakcji (min.) Wydajność (g = %) Temperatura topnienia ( C) 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4-(4-jodofenylo)- -tiosemikarbazyd (2) 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4-(2-jodofenylo)- -tiosemikarbazyd (3) 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4-(2,5-difluorofenylo)- -tiosemikarbazyd (4) 2 4,14= ,45= ,11= T a b e l a 2. Parametry fizykochemiczne nowozsyntetyzowanych pochodnych 1-[(3-chlorofenylo)- karbonylo]-4-podstawionych tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupy: 2-bromofenylową, 4-jodofenylową, 2-jodofenylową, 2,5-difluorofenylową Związek 1-[(30chlorofenylo)karbonylo]-4- -(2-bromofenylo)- tiosemikarbazyd (1) 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4- -(4-jodofenylo)-tiosemikarbazyd (2) 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4- -(2-jodofenylo)-tiosemikarbazyd (3) 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4- -(2,5- -difluorofenylo)tiosemikarbazyd (4) IR (KBr) ν(cm -1 ): 3359 (NH), 3151 (CH arom.), 1671 (C=O), 1533, 1338 ν(cm -1 ): 3320 (NH), 3023 (CH arom.), 1637 (C=O), 1546, 1345 ν(cm -1 ): 3345 (NH), 3146 (CH arom.), 1670 (C=O), 1531, 1337 ν(cm -1 ): 3320 (NH), 3128 (CH arom.), 1633 (C=O), 1526, 1352 Parametry fizykochemiczne 1 H NMR Analiza elementarna (m, 8H, arom.), 9.68, 9.85, (3s, 3H, 3NH) (m, 8H, arom.), 9.84 (s, 2H, 2NH), (s, 1H, NH) (m, 8H, arom.), 9.67, 9.80, (3s, 3H, 3NH) (m, 8H, arom.), 9.70, 10.05, (3s, 3H, 3NH) 43.71, H 2.88, N , H 2.71, N , H 2.57, N , H 2.52, N , H 2.57, N , H 2.50, N , H 2.95, N , H 2.87, N T a b e l a 3. Wyniki badań mikrobiologicznych pochodnych 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4-podstawionych tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupy: 4-jodofenylową, 2-jodofenylową, 2-bromofenylową, 2,5-difluorofenylową. Przeciwdrobnoustrojowa aktywność badanych związków wobec referencyjnych szczepów bakterii Gram- -dodatnich, oznaczona w oparciu o wartość MIC (μg/ml) określoną metodą rozcieńczeń w podłożu agarowym Mueller-Hinton. Związek S. aureus S. aureus 6538 S. epidermidis MIC (mg/l) B. subtilis 6633 B. cereus M. luteus [(3- chlorofenylo)karbonylo]- -4-(2-bromofenylo)- tiosemikarbazyd (1) 62,5 31, ,5 62,5 1-[(3- -chlorofenylo)karbonylo]- -4-(4-jodofenylo)- tiosemikarbazyd (2) 31,25 31,25 31,25 31,25 15,63 31,25

5 PL B1 5 cd. tabeli [(3-chlorofenylo)karbonylo]- -4-(2-jodofenylo)- tiosemikarbazyd (3) 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]- -4-(2,5- -difluorofenylo)tiosemikarbazyd (4) 31,25 31,25 31,25 15,63 31,25 31,25 62,5 62, ,5 T a b e l a 4. Aktywność badanych pochodnych 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4-podstawionych tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupy: 2-bromofenylową, 4-jodofenylową, 2-jodofenylową, 2,5-difluorofenylową, wobec dwunastu szczepów klinicznych Staphylococcus aureus Związki Izolat Staphylococcus aureus MIC (μg/ml) (1) 15,63 31,25 15,63 15,63 31,25 31,25 31,25 15,63 31,25 15,63 15,63 15,63 (2) 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 (3) 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 15,63 (4) 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 Zastrzeżenia patentowe 1. Nowe 1,4-dipodstawione pochodne tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupy: 2-bromofenylową, 4-jodofenylową, 2-jodofenylową, 2,5-difluorofenylową wykazujące działanie przeciwbakteryjne. 2. Sposób otrzymywania nowych 1,4-dipodstawionych pochodnych tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, w którym R ma wyżej podane i znaczenie, znamienny tym, że hydrazyd kwasu 3-chIorobenzoesowego o wzorze ogólnym 2 poddaje się reakcji z izotiocyjanianami o wzorze ogólnym 3, w którym R oznacza grupę 2-bromofenylową, 4-jodofenylową, 2-jodofenylową, 2,5-difluorofenylową, przy czym reakcję prowadzi się w stosunku molowym 1:1, w stopie lub w rozpuszczalnikach, korzystnie w środowisku 95% alkoholu etylowego, w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika, a następnie powstałe produkty reakcji 1-[(3-chlorofenylo)karbonylo]-4-podstawione tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, w którym R ma podane wyżej znaczenie, odsącza się, przemywa rozpuszczalnikiem, korzystnie eterem dietylowym, po czym suszy się i krystalizuje z rozpuszczalnika polarnego, korzystnie z etanolu. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w reakcji stosuje się rozpuszczalniki jak metanol, Ν,Ν-dimetyloacetamid, N,N-dimetyloformamid.

6 6 PL B1 Rysunki Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)