XIII. Staphylococcus, Micrococcus ćwiczenia praktyczne

Transkrypt

1 XIII. Staphylococcus, Micrococcus ćwiczenia praktyczne Ćwiczenie 1. Ocena wzrostu szczepów gronkowców na: a. agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) typ hemolizy morfologia kolonii.. b. podłożu Chapmana (Ch) Ćwiczenie 2. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie IV. Budowa komórki bakteryjnej i metody barwienia preparat bawiony metodą Grama Opis preparatu:

2 Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych gronkowców i mikrokoków - wykonanie próby na katalazę Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie VI. Fizjologia bakterii Szczep badany obserwowane wyniki... Wnioski..... Ćwiczenie 4. Różnicowanie gronkowców i mikrokoków za pomocą testu z furazolidonem Zasada metody: Szczepy gronkowców są wrażliwe na furazolidon. Szczepy mikrokoków są oporne na furazolidon. Wykonanie oznaczenia: 1. Czystą hodowlę (pojedynczą kolonię) badanego szczepu, zidentyfikowanego jako gronkowiec koagulazo-ujemny, o gęstości około 0,5 McFarlanda posiać na podłoże Mullera-Hintona a następnie nałożyć krążek bibułowy nasycony 100 µg furazolidonu (można wykonać identyfikację kilku szczepów równocześnie, posiewając badane szczepy promieniście i nakładając krążek centralnie na płytkę). 2. Płytki z nałożonymi krążkami należy preinkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, następnie hodowlę inkubować godzin, w temperaturze 35 C, w atmosferze tlenowej. 3. Odczytać wielkość strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z furazolidonem. Wielkość 15 mm świadczy o wrażliwości na furazolidon.

3 Micrococcus spp. furazolidon 100µg Staphylococcus spp. Wnioski:. Ćwiczenie 5. Różnicowanie gronkowców koagulazododatich i koagulazoujemnych za pomocą próby na koagulazę Koagulaza jest enzymem uwalnianym do otoczenia przez niektóre szczepy gronkowców, np.: gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus). Działa ona podobnie jak protrombina i zawarty w osoczu fibrynogen przekształca w fibrynę. W wyniku tej reakcji osocze ulega wykrzepianiu. Wykonanie: 1. Próbę na koagulazę wykonuje się w małych, wąskich probówkach. 2. Używa się świeżego lub liofilizowanego osocza króliczego rozcieńczonego w stosunku 1:5 roztworem 0,9% NaCl (zgodnie z instrukcją dołączoną przez producenta). 3. Do 0,5 ml osocza króliczego dodaje się 1 pełne oczko ezy godzinnej hodowli bakteryjnej. 4. Próbę inkubuje się przez 4 godziny w temperaturze 37 0 C. 5. O dodatniej próbie świadczy powstanie skrzepu. 6. W przypadku próbek ujemnych (osocze pozostaje płynne) inkubację przedłuża się do 18 godzin i ponownie odczytuje wynik. Należy pamiętać, że szczepy gronkowców koagulazododatnich mogą wytwarzać fibrynolizynę, która upłynnia powstały skrzep (wynik fałszywie ujemny). Badany szczep wynik..

4 Wnioski..... Ćwiczenie 6. Identyfikacja szczepu Staphylococcus aureus z wykorzystaniem testu Staphytect plus. Zasada metody: STAPHYTECT PLUS firmy Oxoid lateksowy test oparty na reakcji aglutynacji, umożliwia detekcję S. aureus, na podstawie wykrycia trzech antygenów: białka A, czynnika CF, polisacharydu wykrytego u szczepów MRSA. Wykonanie: 1. Doprowadzić odczynniki lateksowe do temperatury pokojowej. Zawartość opakowania dokładnie wymieszać, poprzez energiczne wstrząśnięcie. 2. Wycisnąć po 1 kropli odczynnika lateksowego na jednym z okręgów znajdujących się na karcie reakcji. 3. Jałową ezą pobrać ok. 5 kolonii gronkowcowych, pochodzących z 24 godzinnej hodowli na agarze krwawym. Bakterie przenieść i kolistymi ruchami ezy rozprowadzić w odczynniku lateksowym. 4. Poruszając kartą reakcyjną do 20 sekund obserwować aglutynację w normalnych warunkach oświetleniowych. Nie używać szkła powiększającego. 5. W taki sam sposób postępować z pozostałymi do badań koloniami gronkowców. 6. Po zakończeniu testu karty reakcji bezpiecznie przenieść i umieścić w pojemnikach/ workach przeznaczonych do utylizacji. Kontrolę dodatnią i ujemną przeprowadzić w analogiczny sposób używając odpowiednio szczepów: Staphylococcus aureus ATCC i Staphylococcus epidermidis ATCC

5 Wyniki: Badany szczep Wynik.. Wnioski..... Ćwiczenie 7. Różnicowanie gronkowców koagulazoujemnych (CNS) za pomocą testu z nowobiocyną Zasada metody: Gronkowce koagulazo-ujemne różnicuje się na dwie grupy w zależności od wrażliwości na nowobiocynę. Do grupy nowobiocynoopornych należy grupa Staphylococcus saprophyticus, do grupy nowobiocynowrazliwych grupa Staphylococcus epidermidis. Wykonanie oznaczenia:

6 1. Czystą hodowlę (pojedynczą kolonię) badanego szczepu, zidentyfikowanego jako gronkowiec koagulazo-ujemny, o gęstości około 0,5 McFarlanda posiać na podłoże Mullera-Hintona a następnie nałożyć krążek bibułowy nasycony 2 µg nowobiocyny (można wykonać identyfikację kilku szczepów równocześnie, posiewając badane szczepy promieniście i nakładając krążek centralnie na płytkę). 2. Płytki z nałożonymi krążkami należy preinkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, następnie hodowlę inkubować godzin, w temperaturze 35 C, w atmosferze tlenowej. 3. Odczytać wielkość strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z nowobiocyną. Staphylococcus epidermidis nowobiocyna 2µg Staphylococcus saprophyticus Wnioski..... Ćwiczenie 8. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości szczepu Staphylococcus spp. a. opisz krążki

7 b. Dokonaj pomiaru stref zahamowania wzrostu wokół krążków. Antybiotyk symbol/dawka na krążku Strefa zahamowania wzrostu w mm Interpretacja wyniku c. Uzupełnij tabelkę o informacje dotyczące szczepów Staphylococcus spp. Antybiogram podstawowy Antybiogram rozszerzony Oznaczane mechanizmy oporności

8 Ćwiczenie 9. Interpretacja wyniku oznaczania mechanizmu oporności MLS B Wykonanie oznaczenia wg ćwiczenia IX. Antybiotyki i chemioterapeutyki Odczyt i interpretacja wyników: W przypadku oporności na erytromycynę należy zwracać uwagę na spłaszczenie strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka z klindamycyną od strony krążka z erytromycyną (kształt litery D) świadczące o indukcyjnym mechanizmie oporności MLS B. Interpretacja wyników:

9 W przypadku stwierdzenia mechanizmu MLS B zarówno konstytutywnego, jak i indukcyjnego, ze względu na ryzyko niepowodzenia terapeutycznego, w leczeniu nie powinno się stosować: makrolidów, linkosamidów, streptogramin B