(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR00/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR00/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/77210 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/27 ( ) C07K 14/535 ( ) A61K 39/39 ( ) (54) Adiuwanty szczepionki lub nieswoiste immunostymulanty dla koni, kompozycje do immunostymulacji dla koni, kompozycje immunogenne lub szczepionki dla koni, zastosowanie nieswoistego immunostymulanta oraz zastosowanie adiuwanta szczepionki (30) Pierwszeństwo: , US, 60/138,843 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 17/03 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/10 (73) Uprawniony z patentu: MERIAL, LYON, FR (72) Twórca(y) wynalazku: MICHEL BUBLOT, VOURLES, FR JENNIFER MARIA PEREZ, WORCESTER, US CHRISTINE MICHÉLE PIERRETTE ANDREONI, VILLETTE D'ANTHON, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Grzelak PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są adiuwanty szczepionki lub nieswoiste immunostymulanty dla koni, kompozycje do immunostymulacji dla koni, kompozycje immunogenne lub szczepionki dla koni, zastosowanie nieswoistego immunostymulanta oraz zastosowanie adiuwanta szczepionki. Pierwsze odkrycie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (ang. Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor lub GM-CSF) nastąpiło w roku 1977 (Burgess A.W. i wsp. J. Biol. Chem ). Jest to mysi GM-CSF, oczyszczony z supernatantów hodowli płuc myszy. Aktywności biologiczne GM-CSF wykazano w badaniach nad GM-CSF mysim i ludzkim (Clark S.C. i wsp. Science ; Grant S. M. i wsp. Drugs ). GM-CSF ma wiele ról fizjologicznych (Dy M. w Les cytokines Cavaillon, J.M. 1996, red. Masson, Paryż, Francja, 43-56). W szczególności GM-CSF stymuluje produkcję, rozwój i tworzenie kolonii granulocytów, makrofagów, eozynofili i megakariocytów. GM-CSF indukuje w szczególności cytotoksyczność makrofagów i stymuluje aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciał (ADCC) i rekrutację leukocytów w miejscach zapalnych. Przedstawiono już GM-CSF różnych gatunków zwierząt. Wielkości sekwencji nukleotydowych kodujących znane GM-CSF u różnych gatunków są w zakresie od 381 do 432 nukleotydów. Sekwencje nukleotydowe ludzkie i mysie mają stopień homologii 69%. Stopień homologii wynosi 54% na poziomie sekwencji aminokwasowej (Cantrell M.A. i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ). Jednak ta homologia nie pozwala na żadną aktywność krzyżową między dwoma gatunkami ludzkim i mysim (Metcalf D. i wsp. Blood ). Podanie heterologicznego GM-CSF tj.gm-csf pochodzącego od gatunku innego niż leczony, nie pozwala na uzyskanie optymalnego efektu adiuwantu w szczególności stymulacji aktywności komórek hematopoetycznych i znacznego zwiększenia odpowiedzi odpornościowej. Dotychczas nie było możliwe przedstawienie GM-CSF konia. Jednak ta cytokina ma znaczną wartość dla zastosowania terapeutycznego i szczepionkowego do użycia u koni. Zgłaszającemu udało się wyizolować i zsekwencjonować gen GM-CSF konia. Ten gen był wyizolowany po reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z zastosowaniem oligonukleotydów opisanych w przykładach. Gen GM-CSF konia ma wielkość 432 nukleotydów (Sekw. Id. Nr 8 i figura 1) i koduje aminokwasowe białko (Sekw. Id. Nr 9 i figura 2). Białko kodowane przez ten gen ma homologię przynajmniej 75% z sekwencjami polipeptydowymi GM-CSF innych gatunków zwierząt. Wynalazek dotyczy adiuwanta szczepionki lub nieswoistego immunostymulanta dla koni obejmującego wektor do ekspresji in vivo zawierający sekwencję nukleotydową jak przedstawiona w Sekw. Id. Nr: 8 kodującą koński GM-CSF w warunkach umożliwiających ekspresję u konia funkcjonalnego białka GM-CSF. Korzystnie wektor jest wektorem wirusowym lub plazmidem. Bardziej korzystnie wektor jest wybrany z grupy składającej się z wirusa ospy, adenowirusa i wirusa opryszczki. Korzystnie wirus opryszczki jest wirusem opryszczki końskiej, a wirus ospy jest wybrany z grupy składającej się z wirusa krowianki, wirusa ospy kanarków, wirusa ospy ptasiej, wirusa ospy świń, wirusa ospy szopów i wirusa ospy wielbłądów. Wynalazek dotyczy również kompozycji do immunostymulacji dla koni obejmującej nieswoisty immunostymulant według wynalazku określony powyżej i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. Ponadto w zakres wynalazku wchodzi kompozycja immunogenna lub szczepionka dla koni obejmująca adiuwant według wynalazku, preparat immunogenu lub szczepionki przeciw patogenowi końskiemu i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. Korzystnie preparat immunogenu lub szczepionki jest wybrany z grupy składającej się z preparatu inaktywowanego, preparatu żywego atenuowanego, preparatu podjednostkowego i preparatu rekombinowanego. Wynalazek dotyczy też kompozycji immunogennej lub szczepionki dla koni obejmującej adiuwant szczepionki według wynalazku, w którym wektor do ekspresji dodatkowo zawiera co najmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej jeden koński immunogen lub co najmniej immunologicznie aktywny fragment immunogenu patogenu końskiego i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik.

3 PL B1 3 Wynalazek obejmuje też kompozycję immunogenną lub szczepionkę dla koni obejmującą adiuwant szczepionki według wynalazku i co najmniej jeden immunogen koński lub co najmniej jeden immunologicznie aktywny fragment immunogenu patogenu końskiego i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. W zakres wynalazku wchodzi też adiuwant szczepionki lub nieswoisty immunostymulant dla koni składający się z białka końskiego GM-CSF wytworzonego przez układ ekspresyjny zawierający i wyrażający sekwencję nukleotydową jak przedstawiona w Sekw. Id. Nr: 8. Korzystnie układ ekspresyjny jest wektorem ekspresyjnym in vitro pochodzenia wirusowego lub plazmidowego. Korzystnie wirusowym układem ekspresyjnym in vitro jest bakulowirus. W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja do immunostymulacji dla koni zawierająca nieswoisty immunostymulant według wynalazku i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. Wynalazek obejmuje też immunogenną kompozycję lub szczepionkę dla koni zawierającą adiuwant szczepionki według wynalazku, preparat immunogenu lub szczepionki przeciw patogenowi konia i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. Korzystnie preparat immunogenu lub szczepionki jest wybrany z grupy składającej się z preparatu inaktywowanego, preparatu żywego atenuowanego, preparatu podjednostkowego i preparatu zrekombinowanego. Wynalazek dotyczy również zastosowania nieswoistych immunostymulantów według wynalazku do wytwarzania kompozycji do immunostymulacji dla koni. Ponadto wynalazek obejmuje zastosowanie adiuwantów szczepionki według wynalazku do wytwarzania immunogennej kompozycji lub szczepionki dla koni, dodatkowo zawierającej immunogen koński lub preparat immunogenu lub szczepionki. Sekwencja nukleotydowa może być wstawiona do konwencjonalnych układów ekspresyjnych in vivo pochodzenia wirusowego, takich jak bakulowirus, w szczególności namnażany w komórkach owadów, lub komórkach pochodzenia prokariotycznego (na przykład, Escherichia coli) lub eukariotycznego, w szczególności drożdży, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, w komórkach eukariotycznych ssaków, zwłaszcza w komórkach chomika (na przykład, komórki jajnika chomika lub CHO) i komórkach koni. Układy ekspresyjne są transformowane sekwencją kodującą koński GM-CSF i w ten sposób produkowane jest białko GM-CSF konia, które wchodzi w skład stosowanego adiuwantu szczepionki i niespecyficznego stymulatora odporności. Korzystnie, sekwencja wykorzystana w niniejszym wynalazku jest wprowadzana do tych wektorów ekspresyjnych in vivo w warunkach pozwalających na ekspresję u konia funkcjonalnego białka GM-CSF konia i ewentualnie sekwencji nukleotydowej kodującej przynajmniej jeden immunogen lub przynajmniej jeden fragment immunologicznie aktywny. Te wektory ekspresyjne mogą być plazmidami, wektorami wirusowymi, takimi jak wirus ospy, na przykład, wirus krowianki, wirusy ospy ptasiej (ospa kanarka, Fowl Pox), w tym wirusów ospy specyficznych w stosunku do gatunku (ospa świń, ospa szopów, ospa wielbłądów), adenowirusy i wirusy opryszczki, takie jak wirusy opryszczki konia. Określenie plazmid obejmuje dowolną jednostkę transkrypcji DNA w postaci sekwencji polinukleotydowej zawierającej sekwencję genu końskiego GM-CSF i elementów wymaganych do jego ekspresji in vivo. Korzystna jest postać kolista plazmidu, superzwinięta lub nie. Postać liniowa także mieści się w zakresie tego wynalazku. Każdy plazmid zawiera promotor zdolny do zapewnienia w komórkach gospodarza ekspresji genu wstawionego pod jego kontrolą. Chodzi na ogół o silny promotor eukariotyczny i w szczególności o wczesny promotor cytomegalowirusa CMV-IE, pochodzenia ludzkiego lub mysiego, lub ewentualnie innego pochodzenia, takiego jak szczur, świnka morska. Bardziej ogólnie promotor jest pochodzenia wirusowego albo pochodzenia komórkowego. Jako promotor wirusowy inny niż CMV-IE można wymienić wczesny lub późny promotor wirusa SV40 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Może to być również promotor wirusa, z którego pochodzi gen, na przykład, własny promotor genu. Jako promotor komórkowy można wymienić promotor genu cytoszkieletu, taki jak, na przykład, promotor desminy lub promotor aktyny. Gdy kilka genów jest obecnych na tym samym plazmidzie, mogą one być obecne w tej samej jednostce transkrypcyjnej lub w dwóch różnych jednostkach. Plazmidy mogą także zawierać inne elementy regulacji transkrypcji, takie jak, na przykład, sekwencje stabilizujące, takie jak intron, korzystnie intron II genu β-globiny królika (van Ooyen i wsp., Science, 1979, 206: ), sekwencja sygnałowa białka kodowanego przez gen tkankowego aktywatora

4 4 PL B1 plazminogenu (tpa; Montgomery i wsp. Cell. Mol. Biol. 1997, 43: ) i sygnał poliadenylacji (polia) w szczególności z genu bydlęcego hormonu wzrostu (bgh) (US-A ) lub z genu β-globiny królika. Wynalazek obejmuje również kompozycje immunogenne i szczepionki zawierające końskie białko GM-CSF a i przynajmniej jeden preparat immunogenu lub szczepionki konia i zaróbkę lub nośnik dopuszczalny w weterynarii. Pojęcie preparatu immunogenu obejmuje tu dowolny preparat, który jest zdolny po podaniu koniowi do indukowania odpowiedzi odpornościowej skierowanej przeciwko rozważanemu końskiemu patogenowi, która jest wzmagana przez obecność białka GM-CSF. Korzystnie jest to preparat szczepionki zdolny do indukcji skutecznej ochrony lub pewnego stopnia ochrony przed patogenem, stopnia ochrony, który jest zwiększany przez obecność białka końskiego GM-CSF. Preparaty immunogenu i szczepionki będące składnikiem kompozycji według wynalazku obejmują wszystkie znane typy, takie jak inaktywowane preparaty, żywe atenuowane preparaty, preparaty podjednostkowe i preparaty rekombinantowe (przy użyciu wektora do ekspresji in vivo, w szczególności pochodzenia wirusowego lub plazmidowego). Jak widać powyżej, białko GM-CSF można dodać jako takie do preparatu immunogenu lub szczepionki, aby wytworzyć, w obecności zarobki lub nośnika dopuszczalnego w weterynarii, kompozycję immunogenną lub szczepionkę gotową do podania. Białko GM-CSF można też połączyć z systemem do przedłużonego uwalniania zaprojektowanym do stopniowego uwalniania białka. Zgodnie z bardziej korzystnym wykonaniem wynalazku korzystne jest jednak wyrażanie białka GM-CSF in vivo przy użyciu wektora do ekspresji in vivo, takiego jak opisano powyżej. W tym przypadku korzystne jest także, aby preparat immunogenu lub szczepionki był typu rekombinantowego, opartego na zastosowaniu wektora ekspresyjnego in vivo, tego samego lub innego typu. Można również stosować ten sam wektor ekspresyjny in vivo zawierający i wyrażający przynajmniej jeden immunogen końskiego patogenu i końskiego białka GM-CSF. Zalety stosowania GM-CSF do szczepień polegają w szczególności na zmniejszaniu dawki używanego immunogenu lub wektora lub DNA. Ponadto u niektórych zwierząt, które nie reagują w czasie podawania zwykłej szczepionki, zastosowanie GM-CSF pozwala na stymulację odpowiedzi odpornościowej i jej zwiększenie aż do poziomu ochronnego. Obecny wynalazek obejmuje więc korzystnie kompozycje immunogenne i szczepionki zawierające: - wektor do ekspresji in vivo zawierający sekwencję nukleotydową kodującą koński GM-CSF, w warunkach pozwalających na ekspresję u konia funkcjonalnego białka końskiego GM-CSF, - przynajmniej jeden wektor do ekspresji in vivo zawierający przynajmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jeden koński immunogen; przy czym rozumie się, że ten wektor lub niektóre lub wszystkie te wektory (gdy jest kilka wektorów kodujących różne immunogeny) mogą w ten sposób stanowić także wektor GM-CSF (wektor zawiera przynajmniej jedną sekwencję GM-CSF i jedną sekwencję immunogenną), i - zaróbkę lub nośnik dopuszczalny w weterynarii. Przykłady konstruktów plazmidowych do stosowania w tym wynalazku zawierających koński immunogen, są podane w publikacji WO-A Wynalazek obejmuje także szczepionki DNA zawierające plazmid kodujący i wyrażający równocześnie koński GM-CSF i przynajmniej jeden koński immunogen. Wynalazek dotyczy wszystkich końskich patogenów. Można wymienić bardziej konkretnie następujące patogeny: wirus opryszczki końskiej typu 1 lub typu 4 (a korzystnie kombinacja obu typów), wirus grypy końskiej, tężec, Borrelia burgdorferi, wschodnie, zachodnie i wenezuelskie końskie zapalenie mózgu, wirus wścieklizny. Dla szczepionek podjednostkowych i szczepionek zrekombinowanych, końskie immunogeny są korzystnie wybrane z grupy zawierającej glikoproteiny gb, gc i gd wirusa opryszczki końskiej typu 1 lub typu 4, hemaglutyniny (HA) i nukleoproteiny (NP) wirusa grypy końskiej, fragment podjednostkowy C toksyny tężca, białko OspA Borrelia burgdorferi, geny E2 i C wschodniego, zachodniego i wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu i gen G wirusa wścieklizny. Przedmiotem obecnego wynalazku są również kompozycje, które są nieswoistymi stymulatorami odporności tj. mogą być stosowane jako ogólny stymulator odporności u koni. Kompozycje te podawane są zarówno w obecności jak i w nieobecności deklarowanych warunków patologicznych, na ogół niezależnie od jakiejkolwiek szczepionki, w celu wzmocnienia mechanizmów obronnych konia. Kompozycje te zawierają GM-CSF we wszystkich postaciach opisanych powyżej, białko lub rekombinant, korzystnie rekombinant (wirusowy lub plazmidowy wektor do ekspresji in vivo) i zaróbkę lub podłoże dopuszczalne w weterynarii. Cechy tych wektorów były już opisane.

5 PL B1 5 Kompozycje, które są nieswoistymi stymulatorami i kompozycje immunogenne i szczepionki według wynalazku mogą także zawierać jeden lub więcej adiuwantów odporności, w szczególności wybranych z tych, zwyczajowo stosowanych w szczepieniu koni przeciw rozważanemu patogenowi (om). Kompozycje stymulujące i konwencjonalne (inaktywowane, żywe atenuowane, podjednostki) kompozycje immunogenne i szczepionki mogą też zawierać jako klasyczny adiuwant związki typu karbomer lub wodorotlenek glinu, lub być formułowane w postaci emulsji olej w wodzie. Dla kompozycji stymulujących i kompozycji immunogennych i szczepionek zrekombinowanych opartych na wirusowym wektorze ekspresyjnym odpowiednie są emulsje olej-w-wodzie. Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania wynalazku dla kompozycji stymulujących typu plazmidowego i kompozycji immunogennych i szczepionek typu plazmidowego, plazmid kodujący i wyrażający koński GM-CSF, plazmid kodujący i wyrażający GM-CSF i przynajmniej jeden koński immunogen jak i mieszaniny plazmidów zawierających ten ostatni i przynajmniej jeden koński immunogen mogą być korzystnie formułowane z użyciem lipidu kationowego zawierającego czwartorzędową sól amoniową, o wzorze: w którym R 1 oznacza liniową resztę alifatyczną, nasyconą lub nienasyconą, mającą 12 do 18 atomów węgla. R 2 oznacza inną resztę alifatyczną zawierającą 2 lub 3 atomy węgla, a X oznacza grupę hydroksylową lub aminową. Korzystnie jest to DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecyloksy)-1-propanoamoniowy; WO-A ), korzystnie sprzężony z obojętnym lipidem, w szczególności DOPE (dioleilo-fosfatydylo-etanolamina), aby korzystnie tworzyć DMRIE-DOPE. Korzystnie mieszaninę zrekombinowanego wektora z tym adiuwantem przyrządza się bezpośrednio przed użyciem i korzystnie pozostawia do skompleksowania, na przykład, przez czas w zakresie od 10 do 60 minut, konkretnie około 30 minut przed podaniem jej zwierzęciu. Gdy DOPE jest obecny, stosunek molarny DMRIE- DOPE wynosi korzystnie od 95 : 5 do 5 : 95, bardziej szczególnie 1 : 1. Stosunek wagowy plazmid : adiuwant DMRIE i/lub DMRIE : DOPE może być w zakresie od 50 : 1 do 1 : 10 szczególnie od 10 : 1 do 1 : 5, korzystnie od 1 : 1 do 1 : 2. Według innego korzystnego wykonania wynalazku dla kompozycji stymulujących typu rekombinowanego i kompozycji immunogennych i szczepionek typu rekombinowanego (wektor wirusowy lub plazmid) można stosować jako adiuwant polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego lub kopolimery bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej. Korzystne są usieciowane, polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego w szczególności korzystne są etery polialkenylowe cukrów lub polialkoholi. Związki te są znane jako karbomer (Pharmeuropa vol. 8, nr 2, czerwiec 1996). Specjalista w dziedzinie może też odnieść się do US-A , w którym opisane są takie polimery akrylowe usieciowane przez związek polihydroksylowany mający przynajmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż 8, i w którym przynajmniej trzy hydroksylowe atomy wodoru są zastąpione przez nienasycone reszty alifatyczne mające przynajmniej dwa atomy węgla. Korzystne są te reszty, które zawierają 2 do 4 atomów węgla, na przykład, winylowe, allilowe i inne grupy etylenowo nienasycone. Reszty nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Szczególnie odpowiednie są produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA). Są one usieciowane przez alilosacharozę lub allilopentaerytritol. Wśród tych produktów można wymienić Carbopol 974P, Carbopol 934P i Carbopol 971P. Wśród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylu, korzystne są EMA (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowymi lub usieciowanymi, na przykład, usieciowanymi przez eter diwinylowy. Można odnieść się do publikacji J. Fields i wsp. Nature,

6 6 PL B1 186: , 4 czerwca Pod względem ich budowy polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego i EMA są złożone korzystnie z jednostek podstawowych o następującym wzorze: - w którym R 1 i R 2, które mogą być takie same lub różne, oznaczają H lub CH 3, x = 0 lub 1, korzystnie x = 1, y = 1 lub 2, przy czym x + y = 2. Dla EMA x = 0 i y = 2. Dla karbomerów x = y = 1. Przez rozpuszczenie tych polimerów w wodzie otrzymuje się kwaśny roztwór, który zostaje zobojętniony, korzystnie do ph fizjologicznego, i tworzy się roztwór adiuwantu, do którego będzie włączona sama szczepionka jako taka. Grupy karboksylowe polimeru są wówczas częściowo w postaci COO -. Korzystnie wytwarza się roztwór karbomeru lub EMA w wodzie destylowanej, korzystnie w obecności chlorku sodu, a otrzymany roztwór ma kwaśne ph. Ten roztwór wyjściowy rozcieńcza się dodając go lub znaczną jego część do wymaganej ilości (dla uzyskania żądanego stężenia końcowego) wody z dodatkiem NaCl, korzystnie soli fizjologicznej (NaCl 9 g/l) w całości lub w kilku partiach wraz z równoczesnym lub późniejszym zobojętnieniem (ph 7,3 do 7,4), korzystnie za pomocą NaOH. Ten roztwór o ph fizjologicznym będzie użyty, jako taki, do zmieszania z preparatem immunogenu lub szczepionką w szczególności konserwowaną w postaci zliofilizowanej, ciekłej lub zamrożonej. Stężenie polimeru w końcowej kompozycji szczepionki będzie w zakresie od 0,01% do 2% wagowo/objętościowych, zwłaszcza od 0,06 do 1% wagowo/objętościowego, najbardziej korzystnie od 0,1 do 0,6% wagowo/objętościowego. W innym wykonaniu wynalazku podaje się nieswoisty immunostymulant lub adiuwant wykorzystany w zastosowaniach według wynalazku w celu stymulowania odporności i/lub immunizacji, i/lub szczepienia gatunków koni. Podanie jest korzystnie przeprowadzane na drodze pozajelitowej, takiej jak droga domięśniowa, doskórna lub podskórna. Można je przeprowadzić jeden raz lub wielokrotnie. Ilość DNA stosowana w kompozycjach stymulujących i kompozycjach immunogennych i szczepionkach według wynalazku wynosi około 10 μg do około 2000 μg, a korzystnie około 50 μg do około 1000 μg dla danego plazmidu. Specjalista ma odpowiednie kompetencje, aby dokładnie określić skuteczną dawkę DNA do stosowania dla każdego protokołu terapeutycznego lub szczepienia. Jeśli stosowany jest żywy wektor, dawki mogą być w zakresie między 10 4 i pfu (jednostek tworzących łysinki), korzystnie między 10 6 i 10 8 pfu. Dla kompozycji zawierającej białko GM-CSF dawki mogą być w zakresie między 1 μg i 5 mg, korzystnie między 50 μg i 1 mg. Objętości dawek mogą być konkretnie w zakresie między 0,5 i 5 ml, korzystnie między 2 i 3 ml. W opisie wyraz zawiera lub zawierający należy rozumieć jako obecność określonego elementu, liczby całkowitej lub etapu, lub grupy elementów, liczb całkowitych lub etapów, ale nie wykluczenie jakiegoś innego elementu, liczby całkowitej lub etapu lub grupy elementów, liczb całkowitych lub etapów. Wynalazek będzie obecnie omówiony bardziej szczegółowo za pomocą sposobów wykonania jako nieograniczających przykładów i odnoszących się do rysunków, w których: Fig. 1: Sekwencje genu i białka końskiego GM-CSF, Fig. 2: Mapa restrykcyjna plazmidu pjp097. Lista sekwencji Sekw. Id. Nr dla konstruktów Sekw. Id. Nr 1 Oligonukleotyd JP705 Sekw. Id. Nr 2 Oligonukleotyd JP706 Sekw. Id. Nr 3 Oligonukleotyd JP729 Sekw. Id. Nr 4 Oligonukleotyd JP730 Sekw. Id. Nr 5 Oligonukleotyd JP731 Sekw. Id. Nr 6 Oligonukleotyd JP734

7 PL B1 7 Sekw. Id. Nr 7 Oligonukleotyd JP735 Sekw. Id. Nr 8 Sekwencja genu końskiego GM-CSF (patrz Fig. 1) Sekw. Id. Nr 9 Sekwencja białka końskiego GM-CSF (patrz Fig. 1) P r z y k ł a d y Wszystkie konstrukty plazmidowe wytworzono stosując standardowe techniki biologii molekularnej (klonowanie, trawienie enzymami restrykcyjnymi, synteza komplementarnego DNA jednoniciowego, reakcja łańcuchowa polimerazy, wydłużanie oligonukleotydu przez polimerazę DNA itd.) opisane przez Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989). Wszystkie fragmenty restrykcyjne stosowane w tym wynalazku jak i różne fragmenty po reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) wyizolowano i oczyszczono za pomocą zestawu Geneclean (BIO101 Inc. La Jolla, CA). P r z y k ł a d 1. Przygotowanie całkowitego RNA z końskich limfocytów stymulowanych mitogenami in vitro Krew konia zebrano w probówce zawierającej EDTA przez pobranie krwi z żyły szyjnej. Komórki jednojądrzaste zebrano przez wirowanie w gradiencie Ficollu, a następnie umieszczono je w hodowli na szalce Petri'ego o średnicy 60 mm. Końskie komórki jednojądrzaste w hodowli stymulowano następnie albo konkanawaliną A (cona) (stężenie końcowe około 5 μg/ml) albo fitohemaglutyniną (PHA) (stężenie końcowe około 10 μg/ml). Po stymulacji limfoblasty ConA i PHA zebrano przez zeskrobanie z szalek hodowlanych, a całkowity RNA z tych komórek ekstrahowano stosując zestaw mrna isolation kit for White Blood Wells (Boehringer Mannheim/Roche Cat # ). P r z y k ł a d 2. Izolacja genu kodującego koński GM-CSF Zsyntetyzowano oligonukleotydy JP705 i JP706 o następujących sekwencjach: JP705 (Sekw. Id. Nr 1) (20 merów) 5' TGGGCACTGTGGYCTGCAGC 3' JP706 (Sekw. Id. Nr 2) (17 merów) 5' AGCATGTGRATGCCATC 3' Te oligonukleotydy stosowano z zestawem 5'/3'RACE (Boehringer Mannheim/Roche Cat # ), aby wygenerować klony 3'RACE 6S4, 6W6 i 6W7. Sekwencja konsensusowa 3' uzyskana na podstawie tych 3 klonów była stosowana do syntezy oligonukleotydów JP729, JP730 i JP731, które miały posłużyć do wytwarzania odpowiednich klonów 5'RACE: JP729 (Sekw. Id. Nr 3) (21 merów) 5' AGCTCCCAGGGCTAGCTCCTA 3' JP730 (Sekw. Id. Nr 4) (21 merów) 5' CCCTGTTTGTACAGCTTCAGG 3' JP731 (Sekw. Id. Nr 5) (21 merów) 5' TGTTGTTCAGAAGGCTCAGGG 3' Odpowiednie klony 5'RACE, które uzyskano, były klonami 7D2 i 7D10. Sekwencje konsensusowe wygenerowane na podstawie klonów 3'RACE i klonów 5'RACE zastosowano do amplifikacji całej sekwencji genu końskiego GM-CSF zgodnie z techniką odwrotnej transkrypcji, po której nastąpiła PCR. Całkowity RNA wyekstrahowany z końskich limfocytów stymulowanych ConA lub PHA (przykład 1) był stosowany jako matryca do syntezy pierwszej nici DNA komplementarnego. Ta pierwsza nić DNA komplementarnego była wytworzona przez wydłużenie oligonukleotydu p(dt)15 (Boehringer Mannheim/Roche Cat # ). Uzyskany jednoniciowy komplementarny DNA zastosowano następnie jako matrycę do reakcji PCR z następującymi oligonukleotydami: JP734 (Sekw. Id. Nr 6) (44 mery) 5' CATCATCATGTCGACGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCT 3' i JP735 (Sekw. Id. Nr 7) (41 merów) 5' CATCATCATGCGGCCGCTACTTCTGGGCTGCTGGCTTCCAG 3', aby zamplifikować fragment PCR wielkości około 500 par zasad (bp). Ten fragment oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (= fragment A). P r z y k ł a d 3: Konstrukcja plazmidu pjp097 i sekwencji genu końskiego GM-CSF Fragment A (przykład 2) strawiono Notl i SalI i uzyskany w ten sposób fragment Notl-Sall zligowano z plazmidem pvr1012 (Hartikka i wsp. Human Gene Therapy ), uprzednio strawionym Notl i SalI, aby uzyskać plazmid pjp097 (5334 bp, Fig. 2). Fragment Notl-Sall sklonowany w tym plazmidzie był zsekwencjonowany w całości. Ta sekwencja (Sekw. Id. Nr 8), która koduje białko o wielkości 144 aminokwasów (Sekw. Id. Nr 9), jest końską cytokiną GM-CSF przedstawioną na Fig. 1.

8 8 PL B1 P r z y k ł a d 4: Aktywność biologiczna in vitro produktu genu końskiego GM-CSF Komórki CHO-K1 (komórki jajnika chomika, dostępne z biblioteki szczepów American Type Culture Collection pod numerem dostępu CCL-61) hodowano w podłożu Minimal Essential Medium czyli MEM (Gibco-BRL) w szalkach Petr ego o średnicy 60 mm i transfekowano je 5 μg plazmidu pjp097 uprzednio skompleksowanego 10 μl LipofectAmine PLUS (Nr kat , Gibco-BRL, Cleveland, OH, USA). Warunki tworzenia kompleksów DNA/LipofectAmine i transfekcji komórek były zgodne z zaleceniami dostawcy (Gibco-BRL). 48 godzin po transfekcji supernatanty hodowli zebrano i zamrożono. Komórki szpiku kostnego pobrane od świń hodowano na podłożu półstałym Methocult (Kat # H4230 StemCell Technologies). Do tych hodowli następnie dodano lub nie dodano (kontrola negatywna) 10 μl supernatantu z hodowli komórek transfekowanych plazmidem pjp097. Przeprowadzono dwie niezależne transfekcje plazmidem pjp097, którym nadano kody pjp097 T1 i pjp097 T2. Każdy supernatant (10 μl rozcieńczonych dziesięciokrotnie) testowano równolegle na trzech płytkach hodowlanych. Kontrolę negatywną stanowił supernatant z hodowli CHO. Po 14 dniach hodowli płytki badano pod kątem tworzenia się kolonii makrofagów i zliczono powstałe kolonie. Supernatanty komórek CHO transfekowanych plazmidem pjp097 dały następujące wyniki: Plazmid/rozcieńczenie supernatantu liczba płytek średnia liczba kolonii na płytkę odchylenie standardowe kontrola pjp097 T1 (egm-csf) pjp097 T2 (egm-csf) Wyniki te wskazują, że produkt genu końskiego GM-CSF wyrażany przez plazmid pjp097 ma aktywność typu GM-CSF wobec komórek in vitro. P r z y k ł a d 5: Przygotowanie plazmidów stosowanych w wynalazku Do przygotowania plazmidów przeznaczonych do szczepienia koni, można stosować dowolną technikę umożliwiającą otrzymanie zawiesiny oczyszczonych plazmidów. Techniki te są dobrze znane specjalistom. Plazmidy te wytwarza się przez hodowanie bakterii Escherichia coli K12 transformowanych plazmidami stosowanymi w niniejszym wynalazku. Można w szczególności wymienić technikę lizy alkalicznej, po której następują dwa kolejne ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu w obecności bromku etydyny, jak opisano w Sambrook J i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Można też odnieść się do zgłoszeń patentowych WO-A-95/21250 i WO-A-96/02658, w których opisano sposoby wytwarzania na skalę przemysłową plazmidów do stosowania do szczepień. Dla celów wytwarzania szczepionek, plazmidy zawiesza się, aby otrzymać roztwory o wysokim stężeniu (>2 mg/ml) odpowiednim do przechowywania. W tym celu plazmidy zawiesza się albo w wodzie ultraczystej albo w buforze TE (10 mm Tris-HCl; 1 mm EDTA; ph 8,0). P r z y k ł a d 6: Wytwarzanie szczepionek według wynalazku i ich podawanie Roztwór wyjściowy plazmidu pjp097 rozcieńcza się buforem TE, solą fizjologiczną lub buforem PBS i miesza z różnymi plazmidami szczepionkowymi wyrażającymi ochronne immunogeny. Mogą to być plazmidy, na przykład, cytowane w przykładach zgłoszenia patentowego PCT WO 98/ Konie szczepi się dawkami 100 μg, 250 μg lub 500 μg na plazmid. Tak otrzymane różne mieszaniny plazmidów immunogennych i plazmidu pjp097 końskiego GM-CSF są podawane razem drogą domięśniową (strzykawka + igła) do mięśni szyi lub klatki piersiowej. W tym przypadku dawki szczepionek są wstrzykiwane w objętości 2 ml. Iniekcje domięśniowe można też przeprowadzać stosując aparat do iniekcji typu jet (bez igły), który strzela dawkę, na przykład, 0,5 ml. Jeśli jest to konieczne, można przeprowadzić kilka kolejnych podań u tego samego zwierzęcia, aby wstrzyknąć objętości większe od 0,5 ml. Kolejne strzały przeprowadza się wówczas w różnych miejscach tak, aby strefy wstrzykiwania były rozdzielone o około 1 do 2 centymetrów. Iniekcje można także przeprowadzić na drodze doskórnej stosując aparat strumieniowy do iniekcji (bez igły) dostarczający dawkę 0,2 ml w pięciu punktach (0,04 ml na miejsce wstrzyknięcia) (na przykład aparat PIGJET Endoscoptic, Laon, Francja).

9 PL B1 9 Konie szczepi się typowo podając dwie iniekcje mieszaninami plazmidów, stosowanych w niniejszym wynalazku, przeprowadzone w odstępach 4-5 tygodni. P r z y k ł a d 7. Formulacja plazmidów stosowanych w wynalazku Mieszaninę plazmidów stosowanych w niniejszym wynalazku i plazmidu pjp097 rozcieńcza się buforem TE, solą fizjologiczną lub buforem PBS tak, aby otrzymać stężenie 1 mg/ml. Przygotowuje się 0,75 mm roztwór DMRIE-DOPE przez zawieszenie liofilizatu DMRIE-DOPE w odpowiedniej objętości jałowej wody. Tworzenie kompleksów plazmidowy DNA-lipid przeprowadza się przez rozcieńczenie w równych częściach 0,75 mm roztworu DMRIE-DOPE roztworem DNA 1 mg/ml. Roztwór DNA wprowadza się stopniowo za pomocą sterylnej igły 26G wzdłuż ściany butelki zawierającej roztwór kationowego lipidu, tak aby uniknąć wytwarzania piany. Następnie miesza się łagodnie od momentu, gdy dwa roztwory zmieszają się. Otrzymuje się w końcu kompozycję zawierającą 0,375 mm DMRIE-DOPE i 500 μg/ml DNA. Jest wskazane, aby wszystkie stosowane roztwory były w temperaturze otoczenia we wszystkich opisanych powyżej operacjach. Kompleksowanie DNA/DMRIE-DOPE przebiega w temperaturze otoczenia przez 30 minut przed immunizacją zwierząt, jak to opisano w przykładzie 6. Należy rozumieć, że wynalazek określony przez załączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do poszczególnych sposobów wykonania wskazanych w powyższym opisie, ale obejmuje warianty, które nie wykraczają poza kontekst ani ducha niniejszego wynalazku.

10 10 PL B1

11 PL B1 11

12 12 PL B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Adiuwant szczepionki lub nieswoisty immunostymulant dla koni, znamienny tym, że obejmuje wektor do ekspresji in vivo zawierający sekwencję nukleotydową jak przedstawiona w Sekw. Id. Nr: 8 kodującą koński GM-CSF w warunkach umożliwiających ekspresję u konia funkcjonalnego białka GM-CSF. 2. Adiuwant szczepionki lub nieswoisty immunostymulant według zastrz. 1, znamienny tym, że wektor jest wektorem wirusowym lub plazmidem. 3. Adiuwant szczepionki lub nieswoisty immunostymulant według zastrz. 2, znamienny tym, że wektor jest wybrany z grupy składającej się z wirusa ospy, adenowirusa i wirusa opryszczki. 4. Adiuwant szczepionki lub nieswoisty immunostymulant według zastrz. 3, znamienny tym, że wirus opryszczki jest wirusem opryszczki końskiej. 5. Adiuwant szczepionki lub nieswoisty immunostymulant według zastrz. 3 znamienny tym, że wirus ospy jest wybrany z grupy składającej się z wirusa krowianki, wirusa ospy kanarków, wirusa ospy ptasiej, wirusa ospy świń, wirusa ospy szopów i wirusa ospy wielbłądów. 6. Kompozycja do immunostymulacji dla koni, znamienna tym, że obejmuje nieswoisty immunostymulant określony w zastrz. 1-5, i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. 7. Kompozycja immunogenna lub szczepionka dla koni, znamienna tym, że obejmuje adiuwant określony w zastrz. 1-5, preparat immunogenu lub szczepionki przeciw patogenowi końskiemu i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. 8. Kompozycja immunogenna lub szczepionka dla koni według zastrz. 7, znamienna tym, że preparat immunogenu lub szczepionki jest wybrany z grupy składającej się z preparatu inaktywowanego, preparatu żywego atenuowanego, preparatu podjednostkowego i preparatu rekombinowanego.

13 PL B Kompozycja immunogenna lub szczepionka dla koni, znamienna tym, że obejmuje adiuwant szczepionki określony w zastrz. 1-5, w którym wektor do ekspresji in vivo dodatkowo zawiera co najmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej jeden koński immunogen lub co najmniej immunologicznie aktywny fragment immunogenu patogenu końskiego i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. 10. Kompozycja immunogenna lub szczepionka dla koni, znamienna tym, że obejmuje adiuwant szczepionki określony w zastrz. 1-5 i co najmniej jeden immunogen koński lub co najmniej jeden immunologicznie aktywny fragment immunogenu patogenu końskiego i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. 11. Adiuwant szczepionki lub nieswoisty immunostymulant dla koni, znamienny tym, że składa się z białka końskiego GM-CSF wytworzonego przez układ ekspresyjny zawierający i wyrażający sekwencję nukleotydową jak przedstawiona w Sekw. Id. Nr: Adiuwant szczepionki lub nieswoisty immunostymulant według zastrz. 11, znamienny tym, że układ ekspresyjny jest wektorem ekspresyjnym in vitro pochodzenia wirusowego lub plazmidowego. 13. Adiuwant szczepionki lub nieswoisty immunostymulant według zastrz. 12, znamienny tym, że wirusowym układem do ekspresji in vitro jest bakulowirus. 14. Kompozycja do immunostymulacji dla koni, znamienna tym, że zawiera nieswoisty immunostymulant określony w zastrz i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. 15. Immunogenna kompozycja lub szczepionka dla koni, znamienna tym, że zawiera adiuwant szczepionki określony w zastrz , preparat immunogenu lub szczepionki przeciw patogenowi konia i dopuszczalną weterynaryjnie substancję pomocniczą lub nośnik. 16. Immunogenna kompozycja lub szczepionka dla koni według zastrz. 15, znamienna tym, że preparat immunogenu lub szczepionki jest wybrany z grupy składającej się z preparatu inaktywowanego, preparatu żywego atenuowanego, preparatu podjednostkowego i preparatu zrekombinowanego. 17. Zastosowanie nieswoistego immunostymulanta określonego w zastrz. 1-5, do wytwarzania kompozycji do immunostymulacji dla koni. 18. Zastosowanie adiuwanta szczepionki określonego w zastrz. 1-5, do wytwarzania immunogennej kompozycji lub szczepionki dla koni, dodatkowo zawierającej immunogen koński lub preparat immunogenu lub szczepionki.

14 14 PL B1 Rysunki

15 PL B1 15

16 16 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.