(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (2) OPIS PATENTOWY (9) PL () (2) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 8.6.2, PCT/EP/56 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 2.2.2, WO/7788 (3) B (5) Int.Cl. C2N 5/34 (26.) A6K 39/2 (26.) A6P 43/ (26.) (54) Immunogenny preparat lub szczepionka obejmująca co najmniej jeden plazmid kodujący i wyrażający gen wybrany z grupy złożonej z ORF świńskiego cirkowirusa typu 2 (PCV-2) i ORF2 z PCV-2 (73) Uprawniony z patentu: MERIAL, LYON, FR (3) Pierwszeństwo:.6.999, US, 6/38,352 (43) Zgłoszenie ogłoszono:.8.23 BUP 6/3 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 5/ (72) Twórca(y) wynalazku: JEAN-CHRISTOPHE FRANCIS AUDONNET, LYON, FR MICHAEL BUBLOT, DELMAR, US JENNIFER MARIA PEREZ, EAST NADDAU, US CATHERINE ELISABETH CHARREYRE, SAINT-LAURENT DE MURE, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Grzelak PL B

2 2 PL B Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest immunogenny preparat lub szczepionka obejmująca, co najmniej jeden plazmid kodujący i wyrażający gen wybrany z grupy złożonej z ORF świńskiego cirkowirusa typu 2 (PCV-2) i ORF2 z PCV-2. Świński cirkowirus (PCV - ang. porcine circovirus) odpowiedzialny jest za poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający - PMWS (Porcine Multisystemic Wasting Syndrome lub Post- -Weaning Multisystemic Wasting Syndrome). Wszystkie cytowane w niniejszym opisie dokumenty i wszystkie dokumenty podane w cytowanych tu dokumentach są niniejszym włączone jako referencje. PCV oryginalnie wykryto jako niecytopatogenne zanieczyszczenie w liniach komórek nerki świni PK/5. Wirus ten został zaklasyfikowany wśród Circoviridae razem z wirusem zakaźnej anemii kurcząt (CAV - Chicken Anaemia Virus) i wirusem PBFDV (wirus choroby dzioba i piór u papug - Psittacine Beak and Feather Disease Virus). Są to małe wirusy bezotoczkowe (od 5 do 24 nm), których wspólną cechą jest posiadanie genomu w postaci kolistego jednoniciowego DNA o wielkości,76 do 2,3 tysiąca par zasad (kb). Początkowo sądzono, że genom ten koduje polipeptyd o wielkości około 3 kda (Todd i wsp. Arch. Virol. 99, 7: 29-35). Niedawne prace wykazały jednak bardziej złożoną transkrypcję (Meehan B.M. i wsp., J. Gen. Virol. 997, 78: ). Ponadto między trzema znanymi gatunkami cirkowirusów nie ma znaczących homologii sekwencji nukleotydowych lub na poziomie wspólnych determinantach antygenowych. Wirus PCV pochodzący z komórek PK/5 jest uważany za niepatogenny. Jego sekwencja jest znana z B.M. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 997 (78) Dopiero bardzo niedawno niektórzy autorzy pomyśleli, że szczepy PCV mogą być patogenne i skorelowane z występowaniem zespołu PMWS (G.P.S. Nayar i wsp. Can. Vet. J., 997, 38: i Clark E.G. Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 997: 499-5). Nayar i wsp. za pomocą technik PCR wykryli DNA PCV u świń z zespołem PMWS. Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne skierowane przeciwko cirkowirusom spotykanym u świń, u których obserwuje się objawy charakterystyczne dla zespołu PMWS były w stanie wykazać różnice między tymi cirkowirusami a cirkowirusami świń wyizolowanymi z hodowli komórek PK-5 (Allan G.M. i wsp. Vet. Microbiol., 999, 66: 5-23). Zespół PWMS wykryty w Kanadzie, Stanach Zjednoczonych i Francji jest charakteryzowany klinicznie przez stopniową utratę wagi i objawy takie jak szybkie oddychanie, duszność i żółtaczka. Z patologicznego punktu widzenia przejawia się jako nacieki limfocytowe lub ziarniniakowe, uogólnione powiększenie węzłów chłonnych (limfadenopatie) i rzadziej zapalenie wątroby i limfocytowe lub ziarniniakowe zapalenie nerek (Clark E.G. Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 997: 449-5; La Semaine Vétérinaire Nr 26, suplement do La Semaine Vétérinaire 996 (834): La Semaine Vétérinaire 997 (857): 54; G.P.S. Nayer i wsp. Can. Vet. J., 997, 38: ). Te cirkowirusy uzyskane z Ameryki Północnej i Europy są bardzo blisko spokrewnione ze stopniem identyczności dla sekwencji nukleotydowej wynoszącym ponad 96%, natomiast stopień identyczności jest mniejszy od 8%, jeśli porównuje się sekwencje nukleotydowe tych cirkowirusów z sekwencjami cirkowirusów świni izolowanych z komórek PK-5. Tak, więc zaproponowano dwie podgrupy wirusów, PCV-2 dla cirkowirusów sprzężonych z zespołem PMWS i PCV- dla cirkowirusów izolowanych z komórek PK-5 (Meehan B.M. i wsp., J. Gen. Virol., 998, 79: ; WO-A-99824). Zgłaszający stwierdził, że konstrukty plazmidów kodujące i wyrażające immunogeny PCV-2 mogą być stosowane do immunizacji świń przeciwko zespołowi PMWS. Immunogeny PCV-2 mogą być stosowane w kombinacji z immunogenami PCV- tak, aby również immunizować zwierzęta przeciwko PCV-2. Jest mniej korzystne stosowanie samych immunogenów z PCV-. Do immunizacji świń mogą być stosowane konstrukty plazmidów kodujące i wyrażające immunogen PCV- lub PCV-2, w szczególności obejmujące otwarte ramki odczytu (ORF) i/lub 2 z PCV- i ORF i/lub 2 z PVC-2. Niniejszy wynalazek dotyczy immunogennego preparatu lub szczepionki, która obejmuje, co najmniej jeden plazmid kodujący i wyrażający gen wybrany z grupy złożonej z ORF świńskiego cirkowirusa typu 2 (PCV-2), ORF2 z PCV-2, przy czym ORF i ORF2 dotyczy nukleotydów i sekwencji nukleotydowej AF55392 w Gen Bank, i jako adiuwant kationowy lipid o wzorze

3 PL B 3 w którym R jest liniową resztą alifatyczną nasyconą lub nienasyconą, mającą 2 do 8 atomów węgla, R 2 jest inną resztą alifatyczną obejmującą 2 lub 3 atomy węgla, i X grupą hydroksylową lub aminową. Korzystnie kationowym lipidem jest N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-- -propanoamon (DMRIE), korzystniej DMRIE jest połączony z obojętnym lipidem, równie korzystnie DMRIE jest połączony z dioleilofosfatydylo-etanolaminą (DOPE). Korzystne jest, jeśli immunogenny preparat lub szczepionka ponadto obejmuje świńską cytokinę, korzystniej świńską cytokiną jest GM-CSF, przy czym bardziej korzystnie taki immunogenny preparat lub szczepionka obejmuje plazmid kodujący i wyrażający świńską cytokinę. Immunogenny preparat lub szczepionka korzystnie ponadto obejmuje plazmid kodujący i wyrażający inny świński immunogen. Ponadto korzystne jest, jeśli immunogenny preparat lub szczepionka obejmuje mieszankę DMIRE-DOPE i plazmidu lub mieszaniny plazmidów lub są one mieszane tuż przed użyciem. W korzystnym wykonaniu wynalazku immunogenny preparat lub szczepionka obejmuje plazmid lub mieszaninę plazmidów, które kodują i wyrażają ORF i/lub ORF2 szczepu PCV-2 zdeponowanego w ECACC pod numerem dostępu V9729, V9728, V9727, V9868 lub V9869. Jest oczywistym, że wynalazek może również obejmować plazmidy kodujące i wyrażające ekwiwalentne sekwencje nukleotydowe to znaczy sekwencje, które nie zmieniają ani funkcjonalności ani specyficzności szczepu (na przykład, specyficzności szczepu typu i szczepu typu 2) rozważanego genu lub polipeptydu kodowanego przez ten gen. Będzie to również dotyczyło sekwencji różniących się ze względu na degenerację kodu. Sekwencje PCV-2 stosowane w przykładach są przedstawione w Meehan i wsp. powyżej (Szczep Imp. ; ORF nukleotydy ; ORF2 nukleotydy i odpowiadają odpowiednio ORF4 i ORF3, w US 9/6,92 z 25 września 998 i COL4 i COL3 w WO-A-99824). Inne szczepy PCV-2 i ich sekwencje opublikowano w WO-A i nazwano Imp8, Imp999, Imp i Imp -482 jak i w Hamel A.L. i wsp. J. Virol., czerwiec 998, tom 72, 6: (GenBank AF2727) i w I. Morozov i wsp. J. Clinical Microb., wrzesień 998 tom 36, 9: , jak i GenBank AF86834, AF86835 i AF86836 co daje dostęp do odpowiednich sekwencji ORF. Rozwiązania opisane w wynalazku mogą również dotyczyć ekwiwalentnych sekwencji w tym znaczeniu, że są one zdolne do hybrydyzacji do sekwencji nukleotydowej rozważanego genu w warunkach o wysokiej ostrości. Wśród ekwiwalentnych sekwencji mogą być także wymienione fragmenty genów zachowujące immunogenność całej sekwencji. Homologia całych genomów wirusów typu i 2 wynosi około 75%. Dla ORF homologia wynosi około 86%, a dla ORF2 około 66%. Przeciwnie, homologie między genomami a między ORF w obrębie typu 2 są ogólnie na poziomie powyżej 95%. Za ekwiwalentne dla ORF będą uznane również sekwencje, które mają homologie równą lub większą od 88% w szczególności od 9%, korzystnie od 92% lub 95% z sekwencją dla ORF szczepu Imp, a dla ORF2 te sekwencje, które mają homologie równą lub większą niż 8%, w szczególności większą niż 85%, korzystnie większą niż 9% lub 95% z sekwencją ORF2 szczepu Imp. ORF i ORF2 zgodnie z publikacją Meehan 998 potencjalnie kodują białka o przewidywanej masie cząsteczkowej 37,7 kd i 27,8 kd, odpowiednio. ORF3 i ORF4 (według Meehan i wsp. 998 odpowiadają odpowiednio ORF7 i ORF, w WO-A-99824) i kodują potencjalnie białka o przewidywanej odpowiednio masie cząsteczkowej,9 i 6,5 kd. Sekwencja dla tych ORF jest również dostępna w GenBank jako AF Powyższe sekwencje mogą być włączone do plazmidów i być stosowane zgodnie z wynalazkiem same lub w kombinacji, na przykład, z ORF i/lub ORF2.

4 4 PL B Inne ORF-3 i 5, 6, 8-9, -2 ujawnione w opisie US 9/6,92 z 25 września 998 (COL -3 i 5, 6, 8-9, -2 w WO-A-99824) mogą być stosowane tak jak zostało to niniejszym opisane, w kombinacji lub w inny sposób ze sobą lub z ORF i 2. W podobny sposób mogą być zastosowane sekwencje ekwiwalentne w szczególności te dla ORF pochodzących z różnych szczepów PCV-2 tutaj cytowanych. Precyzując stopień homologii za ekwiwalentne mogą być uznane te sekwencje, które pochodzą ze szczepu PCV, którego ORF2 i/lub ORF ma homologię jak zdefiniowano powyżej z odpowiadającym mu ORF szczepu. Stąd dla ORF3 według Meehan należy uznać, że homologia ma być, na przykład, równa lub większa od 8%, w szczególności większa niż 85%, korzystnie większa niż 9% lub 95% z ORF3 szczepu Imp. Dla ORF4 według Meehan, 998, homologia ta może też być równa lub większa od 86%, w szczególności większa niż 9%, a korzystnie większa niż 95% z ORF4 szczepu Imp. Na podstawie genomowej sekwencji nukleotydowej, na przykład, tej ujawnionej w WO-A będzie działaniem rutynowym w dziedzinie określenie tych ORF stosując standardowe oprogramowanie takie jak MacVector. Także przyrównanie genomów z tym ze szczepu i porównanie z ORF dla szczepu pozwala specjaliście na łatwe ustalenie ORF w genomie innego szczepu (na przykład, tych ujawnionych w WO-A ). Stosowanie programu lub robienie przyrównania nie jest nadmiernym eksperymentowaniem i daje bezpośredni dostęp do ekwiwalentnych ORF. Termin plazmid w niniejszym oznacza dowolną jednostkę transkrypcyjną DNA w postaci sekwencji polinukleotydowej obejmującej sekwencję PCV, która ma ulec ekspresji oraz elementy potrzebne do jej ekspresji in vivo. Korzystna jest kolista forma plazmidu, superskręcona, lub inna. Plazmid w formie liniowej jest również włączony w zakres wynalazku. W opisie wynalazku przedstawione są bardziej szczegółowo plazmidy nazwane pjp9 (zawierający gen ORF2 z PCV-2, fig. ), pjp (zawierający gen ORF z PCV-2, fig. 2), pjp2 (zawierający gen ORF2 z PCV-, fig. 3) i pjp2 (zawierający gen ORF z PCV-, fig. 4). Każdy plazmid obejmuje promotor zdolny do zapewnienia w komórkach gospodarza ekspresji genu wstawionego pod jego kontrolą. Będzie to zwykle silny promotor eukariotyczny, taki jak w szczególności wczesny promotor cytomegalowirusa CMV-IE, pochodzenia ludzkiego lub mysiego, lub ewentualnie innego pochodzenia takiego jak szczur, świnka morska. Bardziej ogólnie promotor jest albo pochodzenia wirusowego, albo pochodzenia komórkowego. Jako promotor wirusowy inny niż CMV-IE można wymienić wczesny lub późny promotor wirusa SV4 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Takim promotorem może być również promotor z wirusa, z którego pochodzi gen, na przykład, promotor specyficzny dla genu. Jako promotor komórkowy można wymienić promotor genu cytoszkieletu taki jak, na przykład, promotor desminy lub alternatywnie promotor aktyny. Jeżeli kilka genów jest obecnych na tym samym plazmidzie, mogą się znajdować w tej samej jednostce transkrypcji lub w dwóch różnych jednostkach. Plazmidy mogą także zawierać inne elementy regulatorowe transkrypcji takie jak przykładowo sekwencje stabilizujące typu intron, korzystnie intron II genuβ-globiny królika (van Ooyen i wsp., Science, 979, 26: ), sekwencji sygnałowej białka kodowanego przez gen tkankowego aktywatora plazminogenu (tpa; Montgomery i wsp. Cell. Mol. Biol. 997, 43: ) i sygnał poliadenylacji (polia) w szczególności genu bydlęcego hormonu wzrostu (bgh) (US-A ) lub genu β-globiny królika. Opisane są również preparaty immunogenne i szczepionki DNA obejmujące przynajmniej jeden plazmid kodujący i wyrażający jeden z immunogenów PCV- i PCV-2, korzystnie jeden z wymienionych powyżej ORF, a dodatkowo zaróbkę lub rozcieńczalnik dopuszczalny w weterynarii, ewentualnie z dodatkiem dopuszczalnego w weterynarii adiuwantu. Bardziej szczegółowo opisane zostały immunogenne preparaty i szczepionki zawierające przynajmniej jeden plazmid kodujący i wyrażający jeden z immunogenów PCV- lub PCV-2, kompozycje formułowane z adiuwantem, w szczególności kationowym lipidem zawierającym czwartorzędową sól amonową o wzorze:

5 PL B 5 w którym R jest liniową resztą alifatyczną, nasyconą lub nienasyconą, o 2 do 8 atomach węgla, R 2 jest inną resztą alifatyczną zawierającą 2 lub 3 atomy węgla, i X jest grupą hydroksylową lub aminową. Korzystnie będzie to DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)--propanoamon; WO-A-96349), korzystnie zasocjowane z obojętnym lipidem, w szczególności DOPE (dioleilofosfatydyloetanolaminą), tak aby wytworzyć DMRIE-DOPE. Korzystnie, mieszaninę zrekombinowanego plazmidu z tym adiuwantem przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem. Ponadto korzystne jest, jeśli przed podaniem jej zwierzęciu, w przygotowanej mieszaninie umożliwi się wytworzenie kompleksu, przez odstawienie jej na pewien czas, przykładowo na okres od do 6 minut, w szczególności zalecane jest 3 minut. O ile DOPE jest obecny stosunek molarny DMRIE:DOPE jest korzystnie od 95:5 do 5:95, korzystniej :. Stosunek wagowy plazmid : adiuwant DMRIE lub DMRIE :DOPE może w szczególności wynosić od 5: do :, szczególnie od : do :5, a korzystniej od : do :2. Jako adiuwant można stosować polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego lub polimery bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej. Korzystne są polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego usieciowane, w szczególności eterami polialkenylowymi cukrów lub polialkoholi. Te związki są znane jako karbomer (Pharmeuropa tom 8, nr 2, czerwiec 996). Specjaliści w dziedzinie mogą się również odnieść do amerykańskiego patentu US-A-2,99,462 (włączonego jako referencje), w którym opisano takie polimery akrylowe usieciowane związkiem polihydroksylowanym zawierającym przynajmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż 8, przy czym atomy wodoru przynajmniej trzech grup hydroksowych są zastąpione przez nienasycone reszty alifatyczne o przynajmniej dwóch atomach węgla. Korzystne reszty zawierają 2 do 4 atomów węgla, np. grup winylowych, allilowych i innych nienasycone grup etylenowych. Reszty nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA) są szczególnie odpowiednie. Są one usieciowane alillo-sacharozą lub za pomocą allilo-pentaerytiritolem. Wśród nich można wymienić Carbopol 974P, 934P i 97P. Wśród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej, korzystne są kopolimery EMA (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowymi lub usieciowanymi, przykładowo usieciowanymi przez eter diwinylowy. W tej kwestii można się odnieść do publikacji J. Fields i wsp., Nature 86 : , 4 czerwca 96, włączone tu jako referencje. Z punktu widzenia budowy polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego oraz kopolimery EMA są korzystnie utworzone z podstawowych jednostek o następującym wzorze: w którym: -R i R 2 ; które są takie same lub różne, oznaczają H lub CH 3 - x = albo, korzystnie x = - y = albo 2, przy czym x + y = 2. Dla kopolimerów EMA x = i y = 2. Dla karbomerów x = y =. Rozpuszczanie tych polimerów w wodzie daje roztwór kwaśny, który należy zneutralizować, korzystnie do ph fizjologicznego, w celu otrzymania roztworu adiuwanta, do którego włączona będzie szczepionka właściwa. Grupy karboksylowe polimeru są wówczas częściowo w postaci COO-. Dla tego typu adiuwanta jest korzystne przygotowanie roztworu adiuwanta, w szczególności karbomeru w wodzie destylowanej, korzystnie w obecności chlorku sodu. Otrzymany roztwór ma kwaśny ph. Taki roztwór wyjściowy rozcieńcza się dodając go do pożądanej ilości (dla uzyskania odpowiedniego stężenia końcowego) lub istotnej części tej ilości, do wody z dodatkiem NaCl, korzystnie soli fizjologicznej (NaCl 9 g/l) w całości albo partiami z równoczesnym lub późniejszym zobojętnianiem (ph 7,3 do 7,4), korzystnie przy użyciu NaOH. Roztwór ten o fizjologicznym ph stosuje się jako taki do

6 6 PL B mieszania ze plazmidem, w szczególności przechowywanym w postaci liofilizowanej, ciekłej albo zamrożonej. Stężenie polimeru w końcowej kompozycji szczepionki wynosi,% do 2% wag./obj., w szczególności,6% do % wag./obj., korzystniej,% do,6% wag./obj. W specyficznym wykonaniu immunogeny preparat lub szczepionka zawiera plazmid lub mieszaninę plazmidów kodujących i wyrażających PCV-2 ORF i ORF2. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również wytworzenie kombinowanych szczepionek przeciw świńskiemu cirkowirusowi umożliwiających również szczepienie przeciwko innym patogenom świni w szczególności tym, które mogą być związane z zespołem PMWS. Jako przykład można podać chorobę Aujeszky'ego, wirus świńskiej grypy, PRRS, świński parwowirus, wirus cholery świń, Actinobacillus pleuropneumoniae. Rozwiązania takie będą dotyczyły mieszanin plazmidów zawierających przynajmniej jeden plazmid występujący w immunogennym preparacie lub szczepionce według wynalazku i przynajmniej jeden inny plazmid kodujący i wyrażający immunogen wybrany, na przykład, z grupy złożonej z glikoprotein gb i gd wirusa choroby Aujeszky'ego (wirus pseudowścieklizny lub PRV), hemaglutyniny i nukleoproteiny wirusa świńskiej grypy HN, hemaglutyniny i nukleoproteiny wirusa świńskiej grypy H3N2, genów ORF5 i ORF3 wirusa PRRS szczepów Lelystad i USA, białko VP2 świńskiego parwowirusa, białka E i E2 wirusa cholery świń (HCV), wydeletowanych genów apxl, apxll i apxiii z Actinobacillus pleuropneumoniae (plazmidy patrz na przykład WO-A ). Takie mieszaniny plazmidów pobierane są, na przykład, w dopuszczalnej w weterynarii zaróbce lub rozcieńczalniku w ten sposób tworząc immunogenne preparaty lub wielowartościowe szczepionki DNA. Preparaty lub wielowartościowe szczepionki DNA mogą być w szczególności korzystnie formułowane z lipidem kationowym jak opisano powyżej w szczególności DMIRE, i korzystnie połączone z lipidem obojętnym, DOPE, aby wytworzyć DMRIE-DOPE. Preparaty jednowartościowych lub wielo wartościowych szczepionek DNA według wynalazku formułowane lub nie z adiuwantem, jak opisano powyżej, mogą również być korzystnie uzupełnione cytokiną korzystnie świńską cytokiną, w szczególności GM-CSF świni. Dodanie świńskiej GM-CSF (ang. granulocytemacrophage colony stimulating factor, czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów i makrofagów; Clark S.C. i wsp. Science 987, 23: 229; Grant S.M. i wsp. Drugs, 992, 53: 56) może być przeprowadzone w szczególności przez włączenie do preparatu lub do szczepionki białka świńskiej GM-CSF albo plazmidu kodującego i wyrażającego gen GM-CSF świni (Inumaru S. i Takamatsu H. Immunol. Cell. Biol. 995, 73: ). Korzystnie gen GM-CSF świni jest wstawiony do plazmidu innego od tych kodujących immunogeny PCV lub inne świńskie immunogeny. W szczególności plazmidem kodującym i wyrażającym świńską GM-CSF może być plazmid pjp58 (figura 5). Immunogenne preparaty i jednowartościowe lub wielowartościowe szczepionki DNA według wynalazku mogą być także kombinowane z przynajmniej jedną konwencjonalną szczepionką (atenuowaną żywą, inaktywowaną lub podjednostkową) lub szczepionką rekombinowaną (wektor wirusowy) skierowaną przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi świni, przy czym patogenem, przeciwko któremu kierowana jest szczepionka jest ten sam lub inny patogen. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają w szczególności wytworzenie kombinacji z zawierającymi adiuwant konwencjonalnymi szczepionkami (atenuowane żywe, inaktywowane lub podjednostkowe). Z szczepionek inaktywowanych lub podjednostkowych można wymienić te zawierające w szczególności żel glinowy, sam lub zmieszany z saponiną jako adiuwantem, lub te formułowane w postaci emulsji olej w wodzie. Rozwiązania według wynalazku pozwalają na immunizację, która umożliwia indukcję odpowiedzi odpornościowej u świń w stosunku do cirkowirusa opisanego w wynalazku. W szczególności możliwe jest przeprowadzenie sposobu szczepienia, który jest skuteczny u świń. Te sposoby immunizacji i szczepienia obejmują podanie jednego z preparatów lub jednej z jedno wartościowych lub wielowartościowych szczepionek DNA jakie zostały opisane powyżej. Sposoby immunizacji i szczepienia będą obejmować podanie jednej lub większej liczby kolejnych dawek tych preparatów lub szczepionek DNA. Preparaty i szczepionki DNA mogą być podawane zgodnie ze sposobem immunizacji lub szczepienia za pomocą różnych dróg podawania przedstawionych w stanie techniki dla szczepień polinukleotydami. W szczególności będą one podawane drogą domięśniową i śródskórną za pomocą znanych technik podawania, w szczególności strzykawką zaopatrzoną w igłę, strumieniem cieczy (Furth i wsp. Analytical Bioch., 992, 25, ) lub przez strzelanie cząsteczkami złota powleczonymi DNA (Tang i wsp. Nature, 992, 356: 52-54).

7 PL B 7 Ten sposób nie tylko pozwala na podawanie dorosłym świniom, ale także młodym i ciężarnym samicom; w tym ostatni, przypadku umożliwia to w szczególności nadanie biernej odporności noworodkom (przez przeciwciała matczyne). Korzystnie szczepione są samice świń przed rozmnażaniem; i/lub przed kryciem i/lub w czasie ciąży. Korzystnie przynajmniej jedno szczepienie przeprowadza się przed kryciem, po którym to wskazane jest przeprowadzenie kolejnego szczepienia w czasie ciąży, przykładowo około połowy ciąży (po upływie 6-8 tygodni ciąży); i/lub pod koniec ciąży (po upływie -3 tygodni ciąży). Tak, więc korzystną procedurą jest szczepienie przed kryciem i szczepienie przypominające w czasie ciąży. Następnie można przeprowadzić ponowne szczepienie przed każdym kryciem i/lub w czasie ciąży w czasie około połowy ciąży i/lub pod koniec ciąży. Korzystnie, ponowne szczepienia prowadzone są w czasie ciąży. Prosiaki, takie jak prosiaki od szczepionych samic (na przykład, szczepionych jak to tu przedstawiono) szczepi się w ciągu pierwszych tygodni życia. Przykładowo szczepienie jest przeprowadzane w pierwszym i/lub drugim i/lub trzecim i/lub czwartym i/lub piątym tygodniu życia. Korzystnie, prosiaki najpierw szczepi się w ciągu pierwszego tygodnia życia lub w trakcie trzeciego tygodnia życia (przykładowo w trakcie odstawienia od piersi). Korzystnie takim prosiakom podaje się dawkę przypominającą po dwóch do czterech tygodniach. Ilość DNA stosowana w szczepionkach według wynalazku zawiera się między około μg i około 2 μg, a korzystnie między około 5 μg i około μg. Specjalista posiada odpowiednie kompetencje by dokładnie określić skuteczną dawkę DNA do stosowania dla każdego protokołu immunizacji lub szczepienia. Objętości dawek mogą być zawarte między,5 i 5 ml, korzystnie między 2 i 3 ml. Korzystnym sposobem immunizacji lub szczepienia polega na podawaniu szczepionek DNA według wynalazku drogą domięśniową. Wynalazek będzie dalej szczegółowo opisany przez sposoby wykonania przedstawione w nie ograniczających przykładach w odniesieniu do figur rysunku, na którym: Na figurze : przedstawiono plazmid pjp9, Na figurze 2 przedstawiono plazmid pjp, Na figurze 3: przedstawiono plazmid pjp2, Na figurze 4: przedstawiono plazmid pjp2, Na figurze 5: przedstawiono plazmid pjp58. Lista sekwencji dotyczy: SEQ ID Nr : Oligonukleotyd JP779 SEQ ID Nr 2: Oligonukleotyd JP78 SEQ ID Nr 3: Oligonukleotyd JP78 SEQ ID Nr 4: Oligonukleotyd JP782 SEQ ID Nr 5: Oligonukleotyd JP783 SEQ ID Nr 6: Oligonukleotyd JP784 SEQ ID Nr 7: Oligonukleotyd JP785 SEQ ID Nr 8: Oligonukleotyd JP786 SEQ ID Nr 9: Oligonukleotyd RG972 SEQ ID Nr : Oligonukleotyd RG973 P r z y k ł a d y Szczepy PCV-2 użyteczne do klonowania określonych ORF to, przykładowo szczepy zdeponowane w ECACC o numerach dostępu V9729 (Imp8), V9728 (Imp) i V9727 (Imp999) (zdeponowane 2 października 997), V9868 (Imp ) i V9869 (Imp-482) (zdeponowane 6 stycznia 998). Poniżej przedstawione przykłady są oparte na wykorzystaniu szczepu Imp. Specjalista z dziedziny będzie w stanie zastosować przedstawione metody dla innych szczepów PCV-2. P r z y k ł a d. Konstrukcja plazmidu pjp9 Plazmid pgem7z-imp Stoon-EcoRI Nr 4 zawierający genom wirusa PCV-2 w postaci fragmentu EcoRI (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol ) strawiono EcoRI, aby wyizolować, po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment EcoRI-EcoRI o długości 768 par zasad (bp). Ten fragment został zligowany ze sobą. Gen ORF2 wirusa PCV-2 szczepu -Stoon (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol ; sekwencja GenBank nr dostępu AF55392) zamplifikowano stosując matrycę złożoną z samoligowa-

8 8 PL B nego fragmentu EcoRI-EcoRI za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) stosując następujące oligonukleotydy: JP779 (SEQ ID Nr ) (35 mer): 5' CATC ATC ATGTCGAC ATGACGTATCCAAGG AGGCG3' oraz JP78 (SEQ ID Nr 2) (36 mer): 5'TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3', tak aby wytworzyć fragment PCR o długości 73 bp. Ten fragment strawiono SalI i Bglll, i wyizolowano po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment restrykcyjny 75 bp SalI-BglII. Uzyskany fragment następnie zligowano z plazmidem pvr2 (Hartikka J. i wsp. Human Gene Therapy ), uprzednio strawionym SalI i Bglll i w ten sposób otrzymano plazmid pjp9 (5567 bp) (fig. ). P r z y k ł a d 2. Konstrukcja plazmidu pjp Przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy stosując plazmid pgem7z-imp-stoon (patrz przykład ) (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol ) i następujące oligonukleotydy: JP78 (SEQ ID Nr 3) (35 mer): 5' C ATC ATC ATGTCGAC ATGCCC AGC AAGAAGAATGG3' oraz JP782 (SEQ ID Nr 4) (36 mer): 5'TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3', tak aby wytworzyć fragment PCR o 97 bp zawierający gen ORF z wirusa PCV-2. Ten fragment strawiono SalI i Bglll aby po elektroforezie w żelu agarozowym wyizolować fragment restrykcyjny 955 bp Sall-BglII. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pvr2 (przykład ), aby uzyskać plazmid pjp (58 bp) (fig. 2). P r z y k ł a d 3. Konstrukcja plazmidu pjp2 (PCV- ORF2) Przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy z plazmidem ppcv (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol ) i następującymi oligonukleotydami: JP783 (SEQ ID Nr 5) (35 mer): 5' CATC ATC ATGTCGAC ATGACGTGGCC A AGGAGGCG3' oraz JP784 (SEQ ID Nr 6) (4 mer): 5'TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3', w celu wytworzenia fragmentu PCR o 73 bp zawierającego gen ORF2 z wirusa PCV- (szczep PK-5, numer dostępu dla sekwencji w GenBank U4986). Uzyskany fragment strawiono SalI i Bglll aby po elektroforezie w żelu agarozowym wyizolować fragment restrykcyjny Sall-BgIII o 75 bp. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pvr2 (przykład ), i uzyskano plazmid pjp2 (5565 bp) (fig. 3). P r z y k ł a d 4. Konstrukcja plazmidu pjp2 (PCV- ORF) Plazmid ppcv zawierający genom wirusa PCV w postaci fragmentu Pstl (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 997, 78, ) strawiono Pstl aby po elektroforezie w żelu agarozowym wyizolować fragment Pstl-Pstl o długości 759 par zasad (bp). Ten fragment zligowano sam ze sobą. Gen ORF wirusa PCV- ze szczepu PK-5 (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 997, 78, ; sekwencja w GenBank nr dostępu U4986) zamplifikowano stosując matrycę złożoną z samoligowanego fragmentu Pstl-Pstl za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z następującymi oligonukleotydami: JP785 (SEQ ID Nr 7) (35 mer): 5' CATC ATC ATGTCGAC ATGCC AAGC A AG AA AAGCGG3' i JP786 (SEQ ID Nr 8) (36 mer): 5'TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3', w celu wytworzenia fragmentu PCR 965 bp zawierającego gen ORF wirusa PCV- (szczep PK-5). Uzyskany fragment strawiono SalI i Bglll, aby po elektroforezie w żelu agarozowym wyizolować fragment restrykcyjny 946 bp Sall-BglII. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pvr2 (przykład ), i uzyskano plazmid pjp2 (584 bp) (fig. 4). P r z y k ł a d 5: Konstrukcja plazmidu pjp58 (wyrażającego świński GM-CSF) Krew świni zebrano w probówce zawierającej EDTA za pomocą pobrania krwi z żyły szyjnej. Komórki jednojądrzaste zebrano za pomocą wirowania na gradiencie Ficollu, a następnie umieszczono je w hodowli in vitro na podłożu RPMI 64 (Gibco BRL) i stymulowano przez podanie konkanawaliny A (Sigma) w stężeniu końcowym około 5 μg/ml w podłożu hodowlanym. Po 72 godzinach stymulacji te limfoblasty zebrano a całkowity RNA z tych komórek ekstrahowano stosując zestaw do ekstrakcji Micro-Scalę Total RNA Separation Kit" (Clontech) według zaleceń producenta. Na całkowitym RNA

9 PL B 9 wyekstrahowanym z świńskich limfoblastów przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji przy pomocy zestawu lst Strand cdna Synthesis Kit" (Perkin Elmer), a następnie przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy z następującymi oligonukleotydami: RG972 (33 mer): (SEQ ID Nr 9) 5 'TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGC AGAACCTG3' i RG973 (34 mer): (SEQ ID Nr ) 5' TATGCGGCCGCTACGTATC ACTTCTGGGCTGGTT3', w celu wytworzenia fragmentu PCR o długości około 45 par zasad (bp). Ten fragment strawiono Notl, aby po elektroforezie w żelu agarozowym wyizolować fragment Notl 45 bp. Uzyskany fragment następnie zligowano z plazmidem pvr2 (przykład ) korzystnie strawionym Notl i defosforylowanym i uzyskano plazmid pjp58 (545 bp) (fig. 5). Sprawdzono sekwencję genu pgm-csf sklonowanego w plazmidzie pjp58 i stwierdzono, że jest identyczna z dostępną w bazie danych Gen- Bank (numer dostępu D274). P r z y k ł a d 6. Wytworzenie oczyszczonych plazmidów do szczepienia świń Bakterie Escherichia coli K2 (szczepy DHB lub SCS) transformowano plazmidami pjp9, pjp, pjp58, pjp2 i pjp2 z przykładów do 5 powyżej. Pięć odpowiednio otrzymanych transformowanych klonów z tymi pięcioma plazmidami następnie hodowano oddzielnie z wytrząsaniem w 37 C w podłożu pełnym LB. Hodowle bakterii zebrano pod koniec fazy wykładniczej i plazmidy ekstrahowano techniką lizy alkalicznej. Wyekstrahowane plazmidy następnie oczyszczono na gradiencie chlorku cezu według metody opisanej przez Sambrook i wsp. (Molecular Biology: A Laboratory Manual, wyd. 2, 989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Po ostatecznej ekstrakcji bromku etydyny i strąceniu w obecności alkoholu absolutnego oczyszczone plazmidy ponownie zawieszono w buforze TE ( mm Tris/EDTA, ph 8,), aby uzyskać roztwory podstawowe zawierające 2 mg plazmidu na ml. Te roztwory podstawowe przechowywano w -2 C przed użyciem. P r z y k ł a d 7: Kontrola ekspresji ORP i 2 wirusa PCV-2 W celu sprawdzenia produktów ekspresji genów PCV-2 ORF2 i PCV-2 ORP sklonowanych odpowiednio w plazmidach pjp9 i pjp plazmidy te transfekowano do komórek CHO-K (jajnik: chomika chińskiego) (ATCC Nr CCL-6) stosując zestaw do transfekcji Lipofectamine Plus (Gibco- BRL Nr Katalogu 964-3), według zaleceń producenta. 48 godzin po transfekcji transfekowane komórki płukano i utrwalano przez 3 minuty w temperaturze pokojowej roztworem 95% lodowatego kwasu octowego. Zastosowano pięć przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla białek PCV-2 ORF (F99 D3GA i F2 7G5GD) i białek ORF2 (F9 4C7CF, F9 2BBC i F9 3A8BC) jako pierwsze przeciwciała. Do ujawnienia specyficznego znakowania stosowano koniugat anty-mysi IgG znakowany Cy3. Zaobserwowano fluorescencję specyficzną w stosunku do PCV-2 dla trzech monoklonalnych przeciwciał dla ORF2 w komórkach transfekowanych plazmidem pjp9, a nie w tych transfekowanych plazmidem pjp. Przeciwnie, fluorescencję specyficzną dla PCV-2 zaobserwowano dla dwóch przeciwciał monoklonalnych dla PCV-2 ORF w komórkach transfekowanych plazmidem pjp, ale nie w tych transfekowanych plazmidem pjp9. Nie wykryto fluorescencji z monoklonalnymi przeciwciałami PCV-2 w komórkach CHO transfekowanych samym plazmidem pvr2 ani w komórkach CHO, które nie były transfekowane. Ten sam wynik ekspresji uzyskano z surowicą poliklonalną specyficzną dla wirusa PCV-2. W tym przypadku znakowany fluoresceiną koniugat anty-igg świni był zastosowany do detekcji specyficznej fluorescencji. Nie wykryto fluorescencji z tą surowicą poliklonalną w komórkach CHO transfekowanych samym plazmidem pvr2 ani w nie transfekowanych komórkach CHO. P r z y k ł a d 8: Szczepienie świń nagim DNA 8. Jednodniowe prosiaki Grupy prosiaków urodzonych przy pomocy cięcia cesarskiego w dniu protokołu umieszczono w jednostce izolacyjnej. Prosięta szczepiono w wieku 2 dni drogą domięśniową różnymi roztworami szczepionkowymi plazmidu. Przygotowano roztwory szczepionkowe przez rozcieńczenie roztworów podstawowych w sterylnej soli fizjologicznej (,9% NaCl). Prosięta były szczepione: samym plazmidem pjp9, albo mieszaniną plazmidów pjp9 i pjp, albo mieszaniną plazmidów pjp9 i pjp58, albo mieszaniną plazmidów pjp9, pjp i pjp58. Roztwory szczepionkowe obejmują 5 μg każdego plazmidu.

10 PL B Objętość: Roztwory szczepionkowe wstrzykiwano drogą domięśniową w całkowitej objętości 2 ml. W praktyce ze względu na wiek prosiąt przy szczepieniu (-2 dni) podaje się ml zastrzyk z każdej strony szyi (=2x ml). Przeprowadzano dwie iniekcje szczepionki w odstępie dwóch tygodni, to znaczy w dniach D2 i D4 protokołu. Przeprowadzano prowokację w D2 protokołu przez ustno-nosowe podanie wirusowej zawiesiny wirulentnego szczepu PCV-2. Prosięta następnie monitorowano przez 3 tygodnie pod kątem pojawienia się specyficznych objawów klinicznych dla poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego. Monitorowane objawy to: Temperatura w odbycie: codzienny pomiar przez pierwsze 4 dni, a następnie dwa pomiary w czasie 3 tygodnia po prowokacji. Waga: ważenie prosiaków tuż przed prowokacją, a następnie raz na tydzień przez 3 tygodnie po prowokacji. Pobieranie próbek krwi do testowania wiremii i przeciwciał: próbki krwi pobierano w D2, D4, D2, D28, D35 i D42. Autopsja: w D42 przeżywające świnie humanitarnie zabijano i poddawano autopsji, w celu znalezienia uszkodzeń anatomiczno-patologicznych i przygotowania preparatów histologicznych z wątroby, węzłów chłonnych, śledziony, nerek i grasicy, aby móc poszukiwać uszkodzeń w tych tkankach tygodniowe prosięta 5- do 7-tygodniowe prosiaki już nie posiadające matczynych przeciwciał przeciwko wirusowi PC V-2 szczepiono drogą domięśniową: samym plazmidem pjp9, albo mieszaniną plazmidów pjp9 i pjp, albo mieszaniną plazmidów pjp9 i pjp58, albo mieszaniną plazmidów pjp9, pjp i pjp58. Dawki szczepionki są takie same jak wskazane w przykładzie 8. (5 μg na plazmid). Roztwory szczepionkowe wstrzykiwano drogą domięśniową w objętości 2 ml (pojedyncze podanie 2 ml do mięśnia szyi). Przeprowadzano dwa szczepienia w odstępnie 2 dni (D i D2). Przeprowadzano prowokację 4 dni po ostatnim szczepieniu (D35) przez domięśniowe podanie wirusowej zawiesiny wirulentnego szczepu PCV-2. Świnie następnie monitorowano przez 8 dni pod kątem występowania specyficznych klinicznych objawów poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego u prosiąt. Kliniczne śledzenie prosiaków po prowokacji jest identyczne z tym opisanym w przykładzie 8. poza tym, że całkowity czas obserwacji tym razem wynosił 8 tygodni. P r z y k ł a d 9: Szczepienie świń DNA formułowanym z DMRIE-DOPE Możliwe jest zastosowanie zamiast roztworów nagiego plazmidowego DNA opisanych w przykładzie 8, roztworów plazmidowego DNA formułowanych z DMRIE-DOPE. Roztwór DNA (zawierający jeden lub więcej plazmidów według przykładu 6) w mg/ml przygotowuje się w,9% NaCl. Roztwór DMRIE-DOPE przygotowuje się o stężeniu,75 mm przez zawieszenie liofilizatu DMRIE-DOPE w odpowiedniej objętości sterylnej wody destylowanej. Tworzenie kompleksów plazmidowy DNA -lipid kationowy przeprowadza się przez rozcieńczenie w równych częściach,75 mm roztworu DMRIE-DOPE z roztworem DNA mg/ml w,9% NaCl. Roztwór DNA wprowadza się stopniowo za pomocą sterylnej igły 26G wzdłuż ściany fiolki zawierającej roztwór kationowego lipidu, aby uniknąć wytwarzania piany. Następnie miesza się łagodnie od momentu zmieszania się dwóch roztworów. W ten sposób uzyskuje się końcową kompozycję zawierającą,375 mm DMRIE-DOPE i 5 μg/ml DNA. Jest wskazane, aby wszystkie stosowane roztwory miały temperaturę pokojową dla wszystkich powyżej opisanych czynności. Tworzenie kompleksu DNA/DMRIE-DOPE przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 3 min przed immunizacją świń. Następnie szczepi się świnie zgodnie z wskazaniami opisanymi w przykładach 8. i 8.2. P r z y k ł a d : Szczepienie prosiąt i wyniki Eksperyment : Grupy po 3 lub 4 prosięta urodzone przez cesarskie cięcie w dniu umieszczono w izolatorach. Prosięta szczepiono w dniu 2 albo samym pjp9 albo mieszaniną plazmidów pjp9 i pjp oraz

11 PL B solą fizjologiczną w grupie kontrolnej. Każdy plazmid rozcieńczono w sterylnej soli fizjologicznej (NaCl,9%) do końcowego stężenia 25 μg/μl). Wstrzykiwano 2 ml objętości drogą domięśniową w dwóch punktach po ml ( punkt z każdej strony szyi). Drugi zastrzyk szczepionki lub placebo podawano w dniu 4. Szczepienie DNA jest dobrze tolerowane przez prosiaki i nie zaobserwowano żadnych ujemnych efektów. Prosiaki poddano prowokacji w dniu 2 przez ustno-nosowe podanie zawiesiny wirusa PCV-2 po ml do każdego nozdrza. Po prowokacji prosiaki ważono jeden raz w tygodniu. Mierzono temperaturę w odbycie w dniach 7, 2, 22, 24, 27, 29, 3, 34, 37, 4, 44. W dniu 44 pobrano wymazy kału z każdego prosiaka w celu zbadania wydalania PCV-2. Wirus wykrywano i oznaczano ilościowo za pomocą ilościowego PCR. W dniu 45 przeprowadzono sekcję i pobrano próbki tkanek do izolacji wirusa. Objawy kliniczne Nie ma znaczącej różnicy dla średnich przyrostów masy ciała lub średnich temperatur ciała między grupami. Uszkodzenia zaobserwowane przy sekcji Jedyną znaczącą obserwacją u świń po zabiciu jest uogólnione powiększenie węzłów chłonnych (limfadenopatia) oskrzeli. Uszkodzenia klasyfikowano według następujących kryteriów: = brak widocznego powiększenia węzłów chłonnych, = łagodne powiększenie węzłów chłonnych, ograniczone do oskrzelowych węzłów chłonnych, 2 = umiarkowane powiększenie węzłów chłonnych, ograniczone do oskrzelowych węzłów chłonnych, 3 = silne powiększenie węzłów chłonnych rozszerzone na oskrzelowe, podżuchwowe, przedłopatkowe i pachwinowe węzły chłonne, std to skrót od odchylenia standardowego N - liczba zwierząt w każdej grupie Grupy Stopień limfadenopatii średnia std N pjp9,2,3 4 pjp9 + pjp 2,,7 3 kontrole 3,, 3 N = liczba prosiąt w każdej grupie Obserwuje się zmniejszenie liczby uszkodzeń gruczołów limfatycznych u 3 z 4 prosiąt immunizowanych pjp9 i z 3 prosiaków immunizowanych mieszaniną plazmidów pjp9 i pjp. Ta różnica nie jest znacząca (p>,5) ze względu na wysokie wartości odchyleń standardowych (std). Obciążenie wirusem w tkance węzłów chłonnych: Przeprowadzono ilościową reizolację wirusa z homogenatów tkanek przygotowanych z oskrzelowych i krezkowych gruczołów limfatycznych. Przedstawione dane odpowiadają mianom wirusa w homogenatach tkankowych po przekształceniu do log. Miana PCV-2 Grupy Węzły chłonne oskrzeli Węzły chłonne krezkowe średnia std średnia std N pjp9,9,8,9,8 4 pjp9 +,7,6,2,2 3 pjplll kontrole 2,,,8, 4 Najwięcej wirusa wydają się zawierać oskrzelowe węzły chłonne. Zmniejszenie obciążenia wirusami obserwuje się w węzłach oskrzelowych i krezkowych z prosiąt immunizowanych pjp9 oraz mieszaniną plazmidów pjp9 i pjpl. To obniżenie jest znaczące (p,5) dla mieszaniny plazmidów. Wydalanie wirusów Oceniano wymazy z kału od prosiąt po prowokacji pod kątem uwalniania PCV-2 stosując PCR w oparciu o amplifikację orf2 z PCV-2. Każde oznaczenie przeprowadzono w trzech powtórzeniach na 2 ml próbki. Nieszczepione kontrole dają wynik negatywny dla PCV-2 przed prowokacja i pozytywny po prowokacji potwierdzając zasadność oznaczenia PCR. Wartości są wyrażone jako log (liczba cząsteczek DNA PCV-2 w próbce 2 μl).

12 2 PL B Log liczby cząsteczek DNA PCV-2 Grupy średnia std N pjp9 3,3,3 4 pjp9 + pjp 2,9,7 3 kontrole 3,6,6 4 Różnice między grupami nie są znaczące (p>,5) Eksperyment 2: 4 dniowe zwyczajne prosięta (8 na grupę) szczepiono 2 podaniami mieszaniny plazmidów pjp9 i pjp formułowanej z DMRIE DOPE w dniu i dniu 2. Dla każdego podania wstrzykiwano 2 ml drogą domięśniową w szyję za uchem. Kompozycja szczepionki wynosi 25 μg każdego plazmidu/ml roztworu fizjologicznego (,9% NaCl) i,375 mm DMRIE DOPE. W grupie kontrolnej prosięta szczepiono solą fizjologiczną. W dniu 32 prosiaki poddano prowokacji drogą ustno-nosową, wprowadzając 5 ml zawiesiny wirusa PCV-2 o mianie 5,8 TCID5/ml strzykawką do każdego nozdrza. Prosięta obserwowano pod kontem pojawienia się objawów klinicznych, prostracja, wymioty, duszność, kaszel, anoreksja i hipertermia (codziennie zapisywano temperaturę w odbycie w ciągu 28 dni po prowokacji), wolniejszy wzrost (prosiaki ważono w dniach 32, 4, 46, 53, 6). Objawy są oceniane na podstawie następujących kryteriów Aneks ) (Wartość dla jednego prosięcia jest równa sumie wyników odpowiadających różnym dniom obserwacji). W dniu 6 przeprowadzano sekcje i uszkodzenia oceniano według następujących kryteriów: Aneks 2 (Wartość dla jednego prosięcia jest równa sumie wyników odpowiadających różnym obserwowanym narządom). Zbierano próbki tkanek, szczególnie gruczołów chłonnych. W dniach 32, 39, 42, 46, 49, 53, 56, 6 pobrano wymazy kału, aby śledzić wydzielanie wirusa. Objawy kliniczne Zaobserwowano znaczące zmniejszenie objawów klinicznych w grupie immunizowanych prosiąt w porównaniu z kontrolami. W grupie kontrolnej prosiak padł z objawami PMWS, w grupie szczepionej nie padł żaden. Wyniki kliniczne Grupy średnia std N szczepione 3,5 7, 8 kontrole 29,3 5,6 8 (p <, test Kruskala-Wallisa) Zaobserwowano znaczące zmniejszenie trwania hipertermii po prowokacji w grupie immunizowanych świń (p,5). Czas trwania (dni) temperatury w odbycie 4 C Grupy średnia std N szczepione,9 2, 8 kontrole 8,4 3,9 8 Codzienny przyrost masy po prowokacji nie różni się znacząco pomiędzy grupą szczepionych a kontrolą. Uszkodzenia zaobserwowane przy sekcji Znaczące zmniejszenie uszkodzeń obserwuje się u immunizowanych prosiaków w porównaniu z kontrolami, szczególnie dla limfadenopatii (p,5). Ogólne uszkodzenia i wyniki limfadenopatii Grupy średnia std N Globalne uszkodzenia szczepione 7,6 3,3 8 kontrole 3, 7,5 8 Wartości dla gruczołów chłonnych szczepione 3, 2,7 8 kontrole 5,7 2,9 8 Obciążenie wirusem w tkankach węzłów chłonnych Obciążenie wirusem w krezkowych i śródpiersiowych gruczołach chłonnych określono za pomocą immunochemii. Następujące kryteria wykorzystywane są do określenia wyników:

13 PL B 3 - = brak fluorescencji, - = trochę ognisk fluorescencyjnych na preparatach niektórych organów, - 2 = około jedno ognisko na zdjęcie, - 3 = całkowicie fluoryzujący narząd. W grupach immunizowanych zaobserwowano znaczące zmniejszenie obciążenia wirusem (p,5). Obciążenie wirusem Grupy Węzły chłonne krezkowe Węzły chłonne śródpiersiowe średnia std średnia std N szczepione,5,6,3,2 8 kontrole,8,8 2,,8 8 Wydalanie wirusa Wymazy z kału oceniano za pomocą PCR na wydzielanie PCV-2. Wyniki oceniano na podstawie następujących kryteriów: = brak PCV-2 = obecność PCV-2. W grupie immunizowanej 38% prosiąt w porównaniu z 88% w grupie kontrolnej wydziela PCV-2 w kale. Czas wydzielania wirusów jest znacząco zmniejszony w grupie szczepionej w porównaniu z kontrolą. Średni czas trwania wydzielania wirusów (dni) Grupy średnia std N szczepione,2 2, 8 kontrole,4 6,3 8 Jest oczywistym, że wynalazek określony przez załączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do poszczególnych sposobów wykonania wskazanych w powyższym opisie, ale obejmuje inne warianty, które nie wykraczają poza zakres ujawnienia wynalazku. prostracja wymioty duszność kaszel anoreksja Objawy Aneks : Wartości dla objawów klinicznych nie, tak; 2 nie może wstać nie, tak nie, umiarkowane, 2 wysokie nie, tak nie, tak hipertermia nie, 4 C, 2 4 C wzrost śmierć Wartość nie, DWG tydzień x DWG tydzień x- i > gram/dzień, 2 DWG tygodnia gram/dzień nie, x wartość z dnia przed śmiercią dla danego dnia wartość jest sumą wartości dla wszystkich objawów Aneks 2: Wartości dla uszkodzeń makroskopowych Skóra (barwa) tusza śluz Normalna biała żółta Normalna chuda bardzo chuda kachektyczna Normalny biały żołn

14 4 PL B cd. tabeli podskórna łączna zwoje (gg) płyn z klatki piersiowej serce płuca opłucna puchlina brzuszna otrzewna żołądek jelito cienkie jelito grube płytki Peyera wątroba nerka pęcherz normalna błyszcząca żółta normalne I duże i lub zastoinowe > I duże i lub zastoinowe > I bardzo duże normalny błyszczący widoczny normalne uszkodzone normalne uszkodzenie < 4 uszkodzenie > 4 < 6 uszkodzenie > 6 Normalna uszkodzenie normalna błyszcząca widoczna normalna uszkodzenie normalny uszkodzenie wrzód normalne uszkodzenie normalne uszkodzenie normalne widoczne na części jelita widoczne na 2 części jelita bardzo znaczące normalna uszkodzenie normalna uszkodzenie normalny uszkodzenie

15 Lista sekwencji PL B 5

16 6 PL B

17 PL B 7 Zastrzeżenia patentowe. Immunogenny preparat lub szczepionka, znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden plazmid kodujący i wyrażający gen wybrany z grupy złożonej z ORF świńskiego cirkowirusa typu 2 (PCV-2), ORP2 z PCV-2, przy czym ORPT i ORF2 dotyczy nukleotydów i sekwencji nukleotydowej AF55392 w Gen Bank, i jako adiuwant kationowy lipid o wzorze w którym R jest liniową resztą alifatyczną, nasyconą lub nienasyconą, mającą 2 do 8 atomów węgla, R 2 jest inną resztą alifatyczną obejmującą 2 lub 3 atomy węgla, i X grupą hydroksylową lub aminową. 2. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz., znamienna tym, że kationowym lipidem jest N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)--propanoamon (DMRIE). 3. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że DMRIE jest połączony z obojętnym lipidem. 4. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że DMRIE jest połączony z dioleilofosfatydylo-etanolaminą (DOPE). 5. Immunogenny preparat lub szczepionka według jednego z zastrz. do 4, znamienna tym, że ponadto obejmuje świńską cytokinę. 6. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 5, znamienna tym, że świńską cytokiną jest GM-CSF. 7. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 5 lub 6, znamienna tym, że obejmuje plazmid kodujący i wyrażający świńską cytokinę.

18 8 PL B 8. Immunogenny preparat lub szczepionka według dowolnego z zastrz. do 7, znamienna tym, że ponadto obejmuje plazmid kodujący i wyrażający inny świński immunogen. 9. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 4, znamienna tym, że obejmuje mieszankę DMIRE-DOPE i plazmidu lub mieszaniny plazmidów lub są one mieszane tuż przed użyciem.. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. do 9, znamienna tym, że obejmuje plazmid lub mieszaninę plazmidów, które kodują i wyrażają ORF i/lub ORF2 szczepu PCV-2 zdeponowanego w ECACC pod numerem dostępu V9729, V9728, V9727, V9868 lub V9869. Rysunki

19 PL B 9

20 2 PL B

21 PL B 2

22 22 PL B Departament Wydawnictw UP RP Cena 4, zł.