(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR00/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR00/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/77043 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/45 ( ) C12N 15/38 ( ) C07K 14/13 ( ) A61K 48/00 ( ) (54) Szczepionka DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV) (30) Pierwszeństwo: , FR, 99/ , US, 60/144,490 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 16/03 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/12 (73) Uprawniony z patentu: MERIAL, Lyon, FR (72) Twórca(y) wynalazku: LAURENT JEAN-CHARLES FISCHER, Lyon, FR SIMONA BARZU-LE ROUX, Lentilly, FR JEAN-CHRISTOPHE FRANCIS AUDONNET, Lyon, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Sylwia Grzelak PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy ulepszonych szczepionek DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV). Stosowanie cząsteczek kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) do szczepienia jest znane od początku lat 90. (Wold i wsp. Science 1990) ). Ta technika szczepień indukuje odporność komórkową i humoralną po transfekcji in vitro komórek szczepionego osobnika przez cząsteczki DNA lub RNA kodujące i wyrażające białka immunologicznie czynne. Szczepionka DNA składa się przynajmniej z jednego plazmidu, który może ulec ekspresji przez maszynerię komórkową szczepionego osobnika i nośnika lub zaróbki dopuszczalnych farmaceutycznie. Sekwencja nukleotydów tego plazmidu koduje i wyraża, między innymi, jeden lub kilka immunogenów, takich jak białka lub glikoproteiny zdolne do indukowania u szczepionego osobnika komórkowej (mobilizacja limfocytów T) i humoralnej (stymulacja produkcji przeciwciał specyficznie skierowanych przeciwko immunogenowi) odpowiedzi odpornościowej (Davis H.L. Current Opinion Biotech. 1997, 8, ). Wszystkie immunogeny pochodzące od patogenu nie są antygenami dostatecznie naturalnie skutecznymi aby indukować odpowiedź odpornościową ochronną optymalną u szczepionego zwierzęcia. Jest więc konieczne polepszenie odpowiedzi odpornościowej. Każda droga podania zawiera swoje własne ograniczenia i trudności, tak więc szczepionka DNA skuteczna przy jednej drodze podania może być nieskuteczna przy innej. Wybór drogi podania musi uwzględniać potrzeby praktyków i hodowców, trudności związane z unieruchomieniem zwierząt lub naturą produktu. Choć może być stosowana droga domięśniowa, droga podskórna jest bardzo interesująca do szczepienia zwierząt domowych szczególnie zwierząt małych i trudnych przy manipulacji. Szczepionki DNA powinny więc być ulepszone tak aby umożliwić ich skuteczne podawanie na różnej drodze. Szczepionki DNA były już stosowane eksperymentalnie w szczególności szczepionka DNA kodująca hemaglutyninę (HA) wirusa różyczki (Etchart i wsp. J. Gen. Virol ), którego podawanie donosowe u myszy okazało się być bardziej skuteczne niż podawanie doustne. Innym przykładem jest szczepionka DNA kodująca białko otoczki (Env) ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), której podanie podskórne nie było skuteczne w porównaniu z podawaniem drogą domięśniową (Ishii i wsp. AIDS Res. Hum. Retro ). Szczepionki DNA były też stosowane eksperymentalnie przeciwko wirusom zwierzęcym, szczególnie przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV - choroby Carre'go). Znane są niektóre immunogeny CDV, w szczególności białko nukleokapsydu (N), białko matrycy (M), białko fuzji (F) i hemaglutynina (HA) (WO-A ). Jednak podanie podskórne szczepionki DNA kodującej hemaglutyninę i białko fuzji CDV nie pozwoliło na wykrycie produkcji przeciwciał u myszy i zaledwie słabą produkcję przeciwciał po podaniu domięśniowym tej szczepionki DNA (Sixt i wsp. J. Virol ). Indukcja odpowiedzi odpornościowej i zależności między różnymi elementami układu odpornościowego biorące udział w tej odpowiedzi mogą być różne u różnych gatunków zwierząt. Liczne informacje pochodzące z doświadczeń na modelu mysim pozwoliły na lepsze zrozumienie funkcjonowania odpowiedzi odpornościowej u myszy, ale tych informacji nie można bezpośrednio przenieść na inne gatunki szczególnie dlatego, że jest łatwiej indukować odpowiedź odpornościową u myszy niż u innych gatunków (van Drunen Little-van den Hurk i wsp. J. Gen. Virol ; Böhm i wsp. Vaccine ). Proponowane były różne drogi podawania szczepionki DNA (dootrzewnowa, dożylna, domięśniowa, podskórna, śródskórna, do śluzówek itd.). Proponowano różne drogi podawania, a w szczególności cząsteczki złota otoczone DNA i wstrzeliwane do komórek skóry szczepionego osobnika (Tang i wsp. Nature ) i iniekcje za pomocą wstrzeliwanego strumienia płynu pozwalające na transfekcję naraz komórek skóry i leżących pod nimi komórek (Furth i wsp. Analytical Bioch ). Do transfekcji DNA in vitro stosowano związki chemiczne: A) Lipidy kationowe Lipidy kationowe są podzielone na cztery podgrupy 1) lipidy kationowe zawierające czwartorzędowe sole amonowe jak, na przykład, DOTMA (dioleiloksypropylotrimetyloamon, produkowany przez Gibco pod nazwą Lipofektyna), DOTAP (trimetylo-2-3-(oktadeka-9-enooiloksy)-1-propanoamon; Gregoriadis i wsp. FEBS Letters

3 PL B ), DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanamon; WO-A ), DLRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(dodecyloksy)-1-propanoamon (Felgner i wsp. Ann. N Y Acad. Sci ). Te lipidy kationowe zawierające sole amonu czwartorzędowego mogą być zasocjowane, lub nie, z dodatkowym obojętnym lipidem, takim jak DOPC (dioleilofosfatydylocholina) lub DOPE (dioleilo-fosfatydylo-etanolamina) (J.P. Behr, Bioconjugate Chemistry ). 2) lipoaminy jak, na przykład, DOGS (dioktadecyloamidoglicylospermina, produkowana przez Promega pod nazwą Transfectam; Abdallah i wsp. Biol. Cell ), DC-Chol (dimetyloaminoetanokarbamoilo-cholesterol; Gao i Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun , ), BGSC (bis-guanidyno-spermidyno-cholesterol), BGTC (bis-guanidyno-tren-cholesterol) (Vigneron i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ). 3) lipidy kationowe zawierające czwartorzędowe sole amonu i lipoaminy jak, na przykład, DOSPA (N,N-dimetylo-N-(2-(sperminokarboksyamido)etylo)-2,3-bis(dioleiloksy)-1-propanimidupięciochlorek, sprzedawany przez Gibco pod nazwą LipofectAmine ; Hawley-Nelson i wsp., Focus ), GAP-DLRIE (N-(3-aminopropylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(dodecloksy)-1-propanoamina; Wheeler i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci USA ; Norman i wsp. Vacine ) lipidy zawierające sole amidyny jak, na przykład, ADPDE, ADODE (Ruysschaert i wsp. Biochem. Biophys. Res. Commun ). B) polimery jak, na przykład, SuperFect TM (cząsteczki aktywowanych dendrymerów), produkowane przez Qiagen; Xu i wsp. Mol. Genet. Metab ) i C) czynniki biochemiczne jak, na przykład, toksyny, w szczególności toksyny cholery. Niektóre z tych związków były też stosowane do formułowania szczepionek DNA z wynikami dość umiarkowanymi. Wiedza o transfekcji in vitro nie jest do przeniesienia na szczepienie DNA gdzie ostatecznym celem jest zapewnienie ochronnej reakcji odpornościowej. Efekty negatywne na indukcję skutecznej ochrony immunologicznej były nawet stwierdzane ze związkami, o których wiadomo, że sprzyjają transfekcji in vitro. Niektóre formulacje związków chemicznych są w wysokich dawkach toksyczne dla komórek transfekowanych. W pracach Etcharta (Etchart i wsp. J. Gen. Virol ), stosowanie DOTAP nie miało efektu adiuwantu podczas podawania szczepionki DNA drogą donosową, podczas gdy posiadało go na drodze podawania ustnej. DOTAP był też stosowany na modelu mysim w szczepionkach DNA kodujących hemaglutyninę (HA) wirusa grypy podawanych drogą donosową (Ban i wsp. Vaccine ), ale dodatek DOTAP hamował odpowiedź odpornościową. Stosowanie DC-Chol lub DOTAP/DOPE na modelu mysim w szczepionkach DNA kodujących białko powierzchniowe (S) wirusa zapalenia wątroby typu B podawanego drogą domięśniową pozwoliło na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał podczas gdy stosowanie lipofektyny (lub DOTMA) nie zwiększyło tej odpowiedzi (Gregoriadis i wsp. FEBS Letters ). DC-Chol/DOPE był też stosowany w szczepionkach DNA przeciw ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV, białko Env), na modelu mysim, którego podanie na drodze domięśniowej zaindukowało bardziej skuteczną odpowiedź odpornościową, podczas gdy podanie drogą podskórną lub doskórną jej nie zwiększyło (Ishii i wsp. AIDS Res. Hum. Retro ). Podobnie publikacja WO-A proponuje wytworzenie kompleksów kwas nukleinowy + lipidy kationowe do transfekcji nabłonka śluzówki ssaków dla terapii genowej lub ekspresji antygenu przeznaczonego do indukcji odpowiedzi odpornościowej. Ten dokument celuje w drogę przez śluzówki poprzez inhalację, na przykład, przez nabłonek płuc. Precyzuje, że jego wyniki są inne niż uprzednich prac. Dodaje, że dla drogi domięśniowej (pozajelitowej) nagi DNA jest bardziej skuteczny niż mieszanina DNA + lipid. Dodatek pewnych cytokin, w szczególności interleukin lub interferonów może umożliwić wzmocnienie odpowiedzi odpornościowej indukowanej w szczególności przez szczepionki DNA. Każda cytokina wywołuje reakcję, która jest dla niej specyficzna i w mniejszym lub większym stopniu orientuje odpowiedź odpornościową w stronę odpowiedzi komórkowej lub w stronę odpowiedzi humoralnej (Pasquini i wsp. Immunol. Cell. Biol ; Kim i wsp. J. Interferon Cytokine Res ). Efekty adiuwantowe cytokiny pochodzącej z jednego gatunku niekoniecznie są te same w odmiennym kontekście odpornościowym, w szczególności jeśli ta cytokina jest podana innemu gatunkowi, a więc do heterologicznego systemu odpornościowego. Dodatek cytokiny może również nie mieć żadnego efektu adiuwanta lub dać odwrócenie pożądanego efektu, to znaczy zmniejszenie lub hamowanie odpowiedzi odpornościowej. Tak więc szczepionka DNA kodująca prosty łań-

4 4 PL B1 cuch immunoglobuliny w formie fuzji z GM-CSF nie zwiększa odpowiedzi odpornościowej, podczas gdy podanie bezpośrednie u myszy tej fuzji białkowej jest skuteczne, tak jak jest podanie fuzji białkowej złożonej z Fv i cytokiny IL-1beta lub podanie szczepionki DNA kodującej tę ostatnią fuzję białka (Hakim i wsp. J. Immunol ). Użycie plazmidów koeksprymujących cytokinę IL-2 i białko otoczki wirusa zapalenia wątroby typu B w konformacji fuzji lub bez fuzji daje w efekcie zwiększenie humoralnych i komórkowych odpowiedzi immunologicznych (Chow i wsp. J. Virol ). Jednak stosowanie plazmidu bicistronowego kodującego glikoproteinę gp120 wirusa ludzkiego nabytego niedoboru odporności (HIV-1) i cytokinę IL-2 indukowało specyficzną odpowiedź odpornościową anty-gp120 słabszą niż uzyskaną przez stosowanie plazmidu monocistronowego kodującego tylko gpl20 (Barouch i wsp. J. Immunol ). Koiniekcja u myszy dwóch wektorów ekspresyjnych, z których jeden koduje glikoproteinę G wirusa wścieklizny a drugi mysi GM-CSF stymuluje aktywność limfocytów B i T podczas gdy koiniekcja plazmidu kodującego interferon gamma (zamiast mysiego GM-CSF) daje w efekcie zmniejszenie odpowiedzi odpornościowej (Xiang i wsp. Immunity ). Pewne modyfikacje na poziomie antygenów takie jak delecje części sekwencji nukleotydów kodujących antygen, insercja fragmentu DNA w sekwencji nukleotydów kodującej antygen lub w regionach nie ulegających translacji powyżej lub poniżej mogą też polepszyć skuteczność szczepionki DNA, w szczególności poprawiając poziom ekspresji antygenu lub jego prezentację. Ale w praktyce manipulacje na poziomie sekwencji nukleotydów kodującej antygen mogą pociągnąć za sobą zmniejszenie lub utratę pierwotnej aktywności odpornościowej. Tak więc delecja domeny transbłonowej w genie kodującym antygen G wirusa wścieklizny zmniejszyła poziom ochrony indukowany w modelu mysim po podaniu drogą domięśniową szczepionki DNA kodującej ten zmodyfikowany antygen (Xiang i wsp. Virol ). Delecja domeny transbłonowej w genie kodującym glikoproteinę gd wirusa opryszczki bydlęcej (BHV) nie pozwoliła na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał i zaindukowała tylko ochronę częściową u gatunków bydląt szczepionych drogą domięśniową (van Drunen Little-van den Hurk i wsp. J. Gen. Virol ). Odpowiedzi odpornościowe humoralne i komórkowe i ochrona nadawana są identyczne u świnek morskich badanych po immunizacji za pomocą albo szczepionki DNA kodującej glikoproteinę GP wirusa Ebola, albo szczepionki DNA kodującej tę glikoproteinę GP, ale w postaci wydzielanej (Xu i wsp. Nature Medicine ). Wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (ang. human tissue plasminogen activator lub human tpa) do genu kodującego antygen Pf322 malarii nie pozwoliła na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał u myszy szczepionej na drodze domięśniowej (Haddad i wsp. FEMS , ). Dodatek w fazie sekwencji tpa do genu kodującego antygen VP7 mysiego rotawirusa także nie pozwolił na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał u myszy szczepionej drogą doskórną podczas gdy fuzja białkowa wytworzona z antygenu VP4 i tpa pozwoliła na ten przyrost, ale bez indukcji skutecznej ochrony (Choi i wsp. Virology ). Modyfikacje przeprowadzone na sekwencji nukleotydów antygenu nie mogą na ogół być bezpośrednio przeniesione na inny antygen, jako że antygeny nie zawsze mają te same uwarunkowania strukturalne. Celem wynalazku jest polepszenie skuteczności szczepienia DNA. Celem jest w szczególności uzyskanie lepszej odpowiedzi odpornościowej, a zwłaszcza skutecznej ochrony u zwierząt domowych i sportowych, w szczególności u psów, przez szczepienie DNA, przez różne drogi podania w szczególności drogę podskórną. Celem zgłaszającego jest opracowanie szczepionek DNA ulepszonych indukujących skuteczną i ochronną odpowiedź odpornościową przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV) (chorobie Carre'go). Szczepionka DNA jest ulepszona albo przez swoje formułowanie, albo przez dodanie GM-CSF albo przez optymalizację antygenu lub antygenów, albo przez kombinacje tych propozycji. Korzystnie szczepionka DNA jest ulepszona albo przez dodanie GM-CSF albo przez optymalizację antygenu lub antygenów, albo przez dodanie GM-CSF i przez optymalizację antygenu lub antygenów. Z definicji szczepionka DNA zawiera jako czynnik aktywny plazmid kodujący i wyrażający gen lub fragment genu. Określenie plazmid obejmuje jednostkę transkrypcji DNA zawierającą sekwencję polinukleotydów zawierającą sekwencję genu, który ma być wyrażany i elementy potrzebne do jego ekspresji in vivo. Korzystna jest forma kolistego plazmidu, superzwinięta lub nie. Forma liniowa także wchodzi w zakres wynalazku.

5 PL B1 5 Każdy plazmid zawiera promotor zdolny do zapewnienia w komórkach gospodarza ekspresji wstawionego genu pod jego kontrolą. Chodzi na ogół o silny promotor eukariotyczny, a w szczególności o wczesny promotor cytomegalowirusa CMV-IE, pochodzenia ludzkiego lub mysiego lub ewentualnie z innego źródła takiego jak szczur, świnka morska. W bardziej ogólny sposób promotor jest albo pochodzenia wirusowego albo pochodzenia komórkowego. Jako promotor wirusowy inny niż CMV-IE można podać wczesny lub późny promotor wirusa SV40 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Może też chodzić o promotor wirusa, z którego pochodzi gen, na przykład, własny promotor genu. Jako promotor komórkowy można podać promotor genu cytoszkieletu taki jak, na przykład, promotor desminy lub promotor aktyny. Gdy szereg genów jest obecnych w tym samym plazmidzie mogą one być prezentowane w tej samej jednostce transkrypcyjnej lub w dwóch różnych jednostkach. Szczepionki DNA są formułowane przez dodanie jako adiuwanta lipidów kationowych zawierających sól czwartorzędową amonu, w szczególności DMRIE, który korzystnie jest zasocjowany z obojętnym lipidem w szczególności DOPE, by stworzyć DMRIE-DOPE. Wynalazek dotyczy szczepionki DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV), obejmującej plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen CDV oraz elementy konieczne dla jego ekspresji in vivo, kationowy lipid (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1- -propanoamon (DMRIE), i dioleilo-fosfatydylo-etanolaminę (DOPE), która to szczepionka gdy jest podawana domięśniowo lub podskórnie indukuje wydajną odpowiedź immunologiczną lub zabezpieczającą u psów przeciw CDV. Szczepionka korzystnie ponadto obejmuje białko GM-CSF psa. Szczepionka korzystnie ponadto obejmuje wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą białko GM-CSF psa w warunkach umożliwiających wyrażanie takiej sekwencji in vivo, korzystniej wektorem ekspresyjnym jest plazmid. W korzystnej szczepionce sekwencja nukleotydowa kodująca immunogen CDV jest sekwencją genu, z którego wydeletowano część kodującą domenę transbłonową. W korzystnej szczepionce plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen CDV ponadto obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą sygnałowy tpa. W innej korzystnej szczepionce plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen CDV ponadto obejmuje stabilizujący intron, którym korzystnie jest intron II genu beta-globiny królika. W równie korzystnej szczepionce plazmid zawiera sekwencję nukleotydową kodującą antygen HA z CDV, korzystniej sekwencja nukleotydowa kodująca antygen HA jest zoptymalizowana przez substytucję sekwencji kodującej sygnałowy HA przez sekwencję nukleotydową kodującą sygnałowy tpa, za pomocą delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową HA, przez wstawienie intronu powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej HA lub przez kombinację takich modyfikacji. W korzystnej szczepionce plazmid zawiera sekwencję nukleotydową kodującą antygen F z CDV, korzystniej sekwencja nukleotydowa kodująca antygen F jest zoptymalizowana przez substytucję sekwencji kodującej sygnałowy F, przez sekwencję nukleotydową kodującą sygnałowy tpa, za pomocą delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową F, przez wstawienie intronu powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej F lub przez kombinację takich modyfikacji. W korzystnej szczepionce sygnałowy tpa jest ludzkim sygnałowym tpa. W równie korzystnej szczepionce intronem jest infron II genu beta-globiny królika. Korzystna szczepionka ponadto obejmuje na tym samym lub na innym plazmidzie sekwencję nukleotydową kodującą białko M lub białko N z CDV. Równie korzystna szczepionka obejmuje pierwszy plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodująca antygen HA z CDV zoptymalizowaną przez substytucję sekwencji kodującej sygnałowy HA przez sekwencję nukleotydową kodującą ludzki sygnałowy tpa, za pomocą delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową HA i przez wstawienie infronu II beta-globiny królika powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej HA, i drugi plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą antygen F z CDV zoptymalizowaną przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową F i przez wstawienie intronu II beta-globiny królika powyżej sekwencji nukleotydowej kodującej F, korzystniej ponadto obejmuje plazmid ekspresyjny kodujący GM- CSF psa. Szczepionki DNA są formułowane przez dodanie jako adiuwantów lipidów kationowych zawierających sól czwartorzędową amonu o wzorze:

6 6 PL B1 w której R 1 jest liniową resztą alifatyczną nasyconą lub nienasyconą, mającą 12 do 18 atomów węgla, R 2 jest inną resztą alifatyczną zawierającą 2 do 3 atomów węgla, a X jest grupą hydroksylową lub aminową. Takim adiuwantem jest DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanoamon; (WO-A ), korzystnie DMRIE jest połączony z obojętnym lipidem jakim jest DOPE (dioleilo-fosfatydylo-etanolamina) aby wytworzyć DMRIE-DOPE. Korzystnie, zrekombinowany wektor miesza się z tym adiuwantem bezpośrednio przed użyciem i jest korzystne, aby przed podaniem zwierzęciu tak przygotowanej mieszaniny, była ona pozostawiona w celu wytworzenia kompleksów, na przykład, na okres od 10 do 60 minut, w szczególności na 30 minut. Stosunek molarny DMRIE : DOPE jest korzystnie od 95 : 5 do 5 : 95, a korzystniej 1 : 1. Stosunek wagowy plazmid : adiuwant DMRIE lub DMRIE : DOPE może mianowicie być od 50 : 1 do 1 : 10, szczególnie od 10 : 1 do 1 : 5, korzystnie od 1 : 1 do 1 : 2. Według innego wykonania, dodaje się do szczepionki GM-CSF (czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów ang. granulocyte macrophage - colony stimulating factor; Clark S.C. i wsp. Science ; Grant S.M. i wsp. Drugs ), co może być zrobione przez włączenie białka GM-CSF bezpośrednio do kompozycji szczepionki lub korzystnie przez wstawienie sekwencji kodującej GM-CSF do wektora ekspresyjnego w warunkach pozwalających na jego ekspresję in vivo. Jako wektor ekspresyjny korzystnie stosuje się plazmid, na przykład, plazmid zawierający sekwencję nukleotydową kodującą interesujący antygen lub antygeny lub inny plazmid. Wybór GM- CSF przeprowadza się zależnie od zwierzęcia, które ma być szczepione, tak więc dla psów stosowany jest GM-CSF psa. Według kolejnego wykonania sekwencja (lub sekwencje) nukleotydowa kodująca immunogen jest w postaci zoptymalizowanej. Przez optymalizację należy rozumieć każdą modyfikację sekwencji nukleotydów, w szczególności taką, której efektem będzie przynajmniej wyższy poziom ekspresji tej sekwencji nukleotydów przez zwiększenie stabilności mrna kodującego ten antygen, przez indukowaną sekrecję pozakomórkową tego antygenu, której bezpośrednią lub pośrednią konsekwencją będzie zwiększenie indukowanej odpowiedzi odpornościowej. W niniejszym wynalazku optymalizacja interesującego antygenu składa się korzystnie z delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową interesującego antygenu (przez delecję rozumie się całkowite usunięcie lub częściową delecję wystarczającą aby domena transbłonową nie była już, lub zasadniczo już, funkcjonalna) i/lub oprócz dodania w ramce odczytu sekwencji nukleotydów kodującej sygnał tpa (ang. tissue plasminogen activator Montgomery i wsp. Cell. Mol. Biol ; Harris i wsp. Mol. Biol. Med ) i/lub wstawienie intronu stabilizującego powyżej genu do wrażania. Delecja fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową interesującego antygenu sprzyja sekrecji do podłoża zewnątrzkomórkowego tak obciętych antygenów i w ten sposób zwiększa ich możliwości kontaktu z komórkami systemu odpornościowego. Wstawienie sekwencji nukleotydów kodującej sygnał tpa (sygnałowy tpa) ułatwia translację informacyjnego RNA, do którego jest przyłączony sygnałowy tpa i zwiększa w ten sposób poziom ekspresji tego informacyjnego RNA, a przez to produkcję antygenów. Sygnał tpa odgrywa też rolę w sekrecji syntetyzowanego antygenu. Insercja intronu stabilizującego w genie kodującym interesujący antygen pozwala na uniknięcie wadliwego składania swego informacyjnego RNA i utrzymuje jego fizyczną integralność. Korzystnie sygnałowy tpa jest pochodzenia ludzkiego. Sekwencja nukleotydów ludzkiego sygnałowego tpa jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu NM_ Korzystnie, intron jest intronem II genu beta-globiny królika (van Ooyen i wsp. Science ), którego sekwencja nukleotydów jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu V00882 i ma odnośniki pod intronem nr 2.

7 PL B1 7 Celem obecnego wynalazku jest ulepszona szczepionka DNA zdolna do indukcji odpowiedzi odpornościowej i ochronnej u psa przeciwko wirusowi nosówki psów wywołującego nosówkę psa zwaną też chorobą Carre'go (ang. Canine Distemper Virus lub CDV). Wirus nosówki psa jest morbiliwirusem, członkiem rodziny Paramyxoviridae. Ten wirus zakaża gatunek psa, ale także dzikie koty (Harder i wsp; J. Gen. Virol ). Obecny wynalazek pozwala na uzyskanie skutecznej i ochronnej szczepionki DNA przeciwko wirusowi nosówki psów, w szczególności na drodze podskórnego podania, która jak dotąd pozostawała drogą indukującą śladowy poziom ochrony (Sixt i wsp. J. Virol ). Według wynalazku szczepionka DNA przeciwko CDV jest ulepszona przez swoje formułowanie z adiuwantem DMRIE-DOPE. Taka szczepionka może być ulepszana przez łączenie z GM-CSF psa (Nash i wsp. Blood ) albo optymalizowana przez optymalizację przynajmniej jednego antygenu CDV, a w końcu przez dodanie GM-CSF psa i optymalizację przynajmniej jednego antygenu CDV. Sekwencja nukleotydów kodująca GM-CSF psa jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu S Dodanie GM-CSF psa można przeprowadzić przez włączenie polipeptydu GM-CSF psa do kompozycji szczepionki korzystnie przez wstawienie sekwencji nukleotydów kodującej GM-CSF psa do wektora ekspresyjnego in vivo, korzystnie do plazmidu. Korzystnie, sekwencja nukleotydów kodująca GM-CSF psa jest wstawiona do drugiego plazmidu ekspresyjnego, odmiennego od tego (lub tych), w którym wstawiony jest gen lub geny kodujące antygen/y CDV. Optymalizacja antygenów pochodzących od CDV jest przeprowadzana przez podstawienie sekwencji sygnałowej w szczególności tej sygnałowego tpa pochodzenia ludzkiego (GenBank numer dostępu NM_000930), sekwencji peptydu sygnałowego hemaglutyniny (HA) i/lub białka fuzji (F), przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową HA i/lub F i/lub przez wstawienie intronu, szczególnie intronu genu beta-globiny królika (którego sekwencja nukleotydów określona jako intron nr 2 jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu V00882) powyżej sekwencji nukleotydów kodującej HA i/lub F. Szczepionka DNA przeciwko CDV według wynalazku może więc kodować i wyrażać jeden pojedynczy optymalizowany antygen CDV (HA lub F) lub oba, to znaczy optymalizowany HA i optymalizowany F. Ewentualnie sekwencja kodująca białko matrycy (M) CDV w swojej formie natywnej (bez modyfikacji) i/lub sekwencja nukleotydowa kodująca nukleoproteinę (N) CDV w swojej formie natywnej (bez modyfikacji) mogą być wstawione i wyrażane w plazmidzie i kombinowane z plazmidami zawierającymi optymalizowany HA i/lub optymalizowany F. Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny CDV stosowane w tym wynalazku oraz różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są zilustrowane w obecnym wynalazku i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych podane są w załączonych przykładach i w WO-A , w szczególności w jego przykładach 8 i 9 i na fig. 2 i 3. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CDV ze względu na podanie drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i składa się z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pns024, fig. 4) kodującego antygen HA CDV optymalizowanego przez podstawienie sekwencji sygnałowej HA przez sekwencję ludzkiego peptydu sygnałowego tpa, przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową HA i przez wstawienie intronu II genu betaglobiny królika powyżej genu HA oraz drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pns021, fig. 3) kodującego antygen F CDV optymalizowanego przez delecję domeny transbłonowej i przez wstawienie intronu II genu betaglobiny królika powyżej genu F. Korzystnie według wynalazku szczepionka DNA przeciwko CDV ze względu na podanie drogą podskórną jest formułowana z DMRIE-DOPE i składa się z plazmidu ekspresyjnego kodującego GM- CSF psa i dwóch plazmidów zdefiniowanych uprzednio (na przykład, pns024 i pns021). Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u psa przeciwko kompleksowi oddechowemu albo kaszlowi kennelowemu (wirus paragrypy-2 psa lub CPI-2). Wirus CPI-2 jest Paramyksowirusem, także członkiem rodziny Paramyxoviridae (Bittle i wsp., J. Am. Vet. Med. Assoc ; Moloney i wsp. Aust Vet J ). Szczepionka DNA przeciwko CPI-2 może być korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona z dodatkiem

8 8 PL B1 GM-CSF psa lub optymalizowanym przynajmniej jednym antygenem CPI-2 lub dodatkiem GM-CSF psa i optymalizowanym przynajmniej jednym antygenem CPI-2. Dodatek GM-CSF psa można wprowadzić tak jak jest to opisane dla CDV. Optymalizację antygenów pochodzących z CPI-2 przeprowadza się przez substytucję za pomocą jednej sekwencji sygnałowej w szczególności tpa pochodzenia ludzkiego, sekwencji sygnałowej hemaglutyniny-neuraminidazy (HN) CPI-2 i/lub białka fuzji (F) CPI-2 i/lub przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową HN i/lub F i/lub przez wstawienie intronu, w szczególności intronu II genu beta-globiny królika powyżej sekwencji nukleotydów kodującej HN i/lub F. Szczepionka DNA przeciwko CPI-2 może więc kodować i wyrażać jeden optymalizowany antygen CPI-2 (HN lub F) lub dwa (HN i F). Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny CPI-2 możliwe do użycia i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CPI-2 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb034, fig. 6) kodującego antygen HN CPI-2 optymalizowany przez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tpa na miejsce sekwencji sygnałowej HN, przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów HN kodującego domenę transbłonową i przez wstawienie intronu II genu beta globiny królika powyżej HN i z drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb032, fig. 5) kodującego antygen F CPI-2 optymalizowanego przez delecję sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową F i przez wstawienie intronu II genu beta-globiny królika powyżej genu F. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CPI-2 ze względu na podanie drogą podskórną jest formułowana z DMRIE-DOPE i składa się z plazmidu ekspresyjnego kodującego GM-CSF psa i dwóch plazmidów zdefiniowanych uprzednio (na przykład, psb034 i psb032). Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u psa przeciwko wirusowi opryszczki psa typu 1 (CHV-1). Wirus CHV-1 jest członkiem rodziny Alphaherpesvirinae. Ten wirus jest odpowiedzialny za wirusowy nieżyt nosa i tchawicy u psa. Sekwencje nukleotydów kodujące glikoproteiny gb, gc i gd są znane (Limbach i wsp., J. Gen. Virol ). Szczepionka DNA przeciwko CHV-1 jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona albo z dodatkiem GM-CSF psa lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu CHV-1 lub dodatkiem GM-CSF psa i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu CHV-1. Dodatek GM-CSF psa można wprowadzić tak jak jest to opisane dla CDV. Optymalizację antygenów pochodzących z CHV-1 przeprowadza się przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową glikoproteiny gb i/lub glikoproteiny gc i/lub glikoproteiny gd CHV-1. Ulepszona szczepionka DNA przeciwko CHV-1 może więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen CHV-1 (gb, gc lub gd) lub dwa z nich lub trzy. Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny CHV-1 do wykorzystania w szczepionce i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach oraz w WO-A-98/03199, w szczególności w jego przykładach 7 i 8 i na fig. 13 i 14. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CHV-1 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb016, fig. 7) kodującego antygen gb CHV-1 optymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową, drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb019, fig. 8) kodującego antygen gc CHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb017, fig. 9) kodującego antygen gd CHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko CHV-1 ze względu na podanie drogą podskórną jest formułowana z DMRIE-DOPE i składa się z plazmidu ekspresyjnego kodującego GM-CSF psa i trzech plazmidów zdefiniowanych uprzednio (na przykład, psb016, psb019 i psb017). Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u kota przeciwko wirusowi opryszczki kota typu 1 (FHV-1).

9 PL B1 9 Wirus FHV-1 jest członkiem rodziny Alphaherpesvirinae, wirus ten jest odpowiedzialny za wirusowy nieżyt nosa i tchawicy u kota (Fargeaud i wsp., Arch. Virol ). Szczepionka DNA przeciwko FHV-1 jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona albo z dodatkiem GM- CSF kota lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu FHV-1 lub dodatkiem GM-CSF kota i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu FHV-1. Dodatek GM-CSF kota można wprowadzić przez włączenie polipeptydu GM-CSF kota do kompozycji szczepionki korzystnie przez wstawienie sekwencji nukleotydów kodującej GM-CSF kota (na przykład, dostępnej w bazie danych GenBank pod numerem dostępu AF053007) do wektora ekspresyjnego in vivo, korzystnie do plazmidu. Korzystnie, sekwencja nukleotydów kodująca GM-CSF kota jest wstawiona do drugiego plazmidu ekspresyjnego, odmiennego od tego (lub tych), w którym wstawiony jest gen lub geny kodujące antygeny FHV-1. Optymalizację antygenów pochodzących z FHV-1 przeprowadza się przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową glikoproteiny gb i/lub glikoproteiny gc i/lub glikoproteiny gd FHV-1. Ulepszona szczepionka DNA przeciwko FHV-1 może więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen FHV-1 (gb, gc lub gd) lub dwa z nich lub trzy. Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny FHV-1 do wykorzystania w szczepionce i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach i w WO-A-98/03660, w szczególności w jego przykładach 14 i 15 i fig. 11 i 12. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko FHV-1 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb021, fig. 10) kodującego antygen gb FHV-1 optymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową, drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb023, fig. 11) kodującego antygen gc FHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb024, fig. 12) kodującego antygen gd FHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko FHV-1 pod kątem podania drogą podskórną jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego kodującego GM-CSF kota i trzech uprzednio zdefiniowanych plazmidów (na przykład, psb021, psb023 i psb024). Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u konia przeciwko wirusowi opryszczki konia typu 1 (EHV-1). Wirus EHV-1 jest członkiem rodziny Alphaherpesvirinae, wirus ten jest odpowiedzialny za wirusowe poronienie u konia (Crabb i wsp., Virus Res ). Ustalono całkowitą sekwencje genomu tego wirusa (Telford i wsp. Virology ). Szczepionka DNA przeciwko EHV-1 jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona albo z dodatkiem GM-CSF konia lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu EHV-1 lub w końcu dodatkiem GM- CSF konia i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu EHV-1. Dodatek GM-CSF konia można wprowadzić przez włączenie polipeptydu GM-CSF konia do kompozycji szczepionki korzystnie przez wstawienie sekwencji nukleotydów (SEQ ID N 69, fig. 26) kodującej GM-CSF konia do wektora ekspresyjnego in vivo, korzystnie do plazmidu. Korzystnie sekwencja nukleotydów kodująca GM-CSF konia jest wstawiona do drugiego plazmidu ekspresyjnego, odmiennego od tego (lub tych), w którym wstawiony jest gen lub geny kodujące antygeny EHV-1. Optymalizację antygenów pochodzących z EHV-1 przeprowadza się przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową glikoproteiny gb i/lub glikoproteiny gc i/lub glikoproteiny gd EHV-1. Ulepszona szczepionka DNA przeciwko EHV-1 może więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen EHV-1 (gb, gc lub gd) lub dwa z nich lub trzy. Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny EHV-1 do wykorzystania w szczepionce i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach i w WO-A-98/03198, w szczególności w jego przykładach 8 i 10 i fig. 2 i 4. Droga domięśniowa jest korzystna u konia. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko EHV-1 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb028, fig. 13) kodującego antygen gb EHV-1 optymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową, drugiego plazmidu ekspre-

10 10 PL B1 syjnego (na przykład, psb029, fig. 14) kodującego antygen gc EHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb030, fig. 15) kodującego antygen gd EHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową. Można jednak stosować drogę podskórną. W tym przypadku szczepionka DNA przeciwko EHV-1 jest korzystnie formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego kodującego GMCSF konia i trzech uprzednio zdefiniowanych plazmidów (na przykład, psb028, psb029 i psb030). Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u konia przeciwko wirusowi opryszczki konia typu 4 (EHV-4). Wirus EHV-4 jest członkiem rodziny Alphaherpesvirinae. Wirus EHV-4 jest odpowiedzialny za zapalenie płuc i nieżyt nosa u konia (Crabb i wsp., Adv. Virus Res ). Ustalono całkowitą sekwencje genomu tego wirusa (Telford i wsp. J. Gen. Virol ). Szczepionka DNA przeciwko EHV-4 jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona albo z dodatkiem GM-CSF konia lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu EHV-4 lub dodatkiem GM-CSF konia i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu EHV-4. Dodatek GM-CSF konia można wprowadzić tak jak opisano dla EHV-1. Optymalizację antygenów pochodzących z EHV-4 przeprowadza się przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową glikoproteiny gb i/lub glikoproteiny gc i/lub glikoproteiny gd EHV-4. Ulepszona szczepionka DNA przeciwko EHV-4 może więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen EHV-4 (gb, gc lub gd) lub dwa z nich lub trzy. Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny EHV-4 do wykorzystania w szczepionce i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach i w WO-A-98/03198, w szczególności w jego przykładach 9 i 11 i na fig. 3 i 5. Korzystnie szczepionka DNA przeciwko EHV-4 pod kątem podania drogą domięśniową jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb025, fig. 16) kodującego antygen gb EHV-4 optymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową, drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb026, fig. 17) kodującego antygen gc EHV-4 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodujący domenę transbłonową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, psb027, fig. 18) kodującego antygen gd EHV-4 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową. Do drogi podskórnej szczepionka DNA przeciwko EHV-4 jest korzystnie formułowana z DMRIE- DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego kodującego GM-CSF konia i trzech uprzednio zdefiniowanych plazmidów (na przykład, psb025, psb026 i psb027). Chociaż wynalazek opisany jest w odniesieniu do konkretnych szczepionek DNA, to może być on zastosowany także do szczepionek DNA skierowanych przeciwko innym patogenom tych gatunków zwierząt. Tak więc różne walencje opisane przez to zgłoszenie mogą stanowić cel ulepszonej szczepionki w szczególności przez dodanie adiuwantów lub GM-CSF, lub ewentualnie optymalizacji genu lub kombinacji tych propozycji, jak to jest tu opisane szczegółowo dla niektórych walencji. W tym samym zamyśle opisane szczepionki mogą być dla określonego gatunku zwierzęcia kombinowane między sobą i/lub ze szczepionkami DNA skierowanymi przeciwko innym patogenom tego samego gatunku. Tak więc opisane rozwiązania umożliwiają wytworzenie ulepszonej multiwalentnej szczepionki DNA pozwalające na uzyskanie skutecznej ochrony u psa przeciwko przynajmniej dwóm patogenom psa wybranym z grupy złożonej z: CDV, CPI-2, CHV-1, wirusa wścieklizny (rabdrowirus), parwowirusa psa (CPV), koronawirusa psa (CCV), Borrelia burgdorferi. Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej multiwalentnej szczepionki DNA pozwalającej na uzyskanie skutecznej ochrony u kota przeciwko przynajmniej dwóm patogenom kota wybranym z grupy złożonej z: FHV-1, kaliciwirusa kota (FCV) wirusa wścieklizny (rabdowirus), parwowirusa kota (FPV), wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kota (FIPV), wirusa białaczki kota (FeLV), wirusa nabytego niedoboru odporności kota (FIV). Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonych multiwalentnych szczepionek DNA pozwalających na uzyskanie skutecznej ochrony u konia przeciwko przynajm-

11 PL B1 11 niej dwóm patogenom konia wybranym z grupy złożonej z: EHV-1, EHV-4, wirusa grypy konia, wirusa wschodniego zapalenia mózgu konia, wirusa zachodniego zapalenia mózgu konia, wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu konia, wirusa wścieklizny, Clostridium tetani, Borrelia burgdorferi. Multiwalentne szczepionki DNA mogą być ulepszone przez ich formułowanie z adiuwantem, w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Może on też być fakultatywnie łączony z dodatkiem GM-CSF jak to było poprzednio opisane lub z optymalizacją przynajmniej jednego interesującego antygenu jak to uprzednio opisano, w końcu z dodaniem GM-CSF i optymalizacją przynajmniej jednego interesującego antygenu. Ulepszone multiwalentne szczepionki DNA są złożone z jednego lub więcej plazmidów ekspresyjnych tak że te szczepionki prowadzą do ekspresji in vivo przynajmniej jednego immunogenu pierwszego patogenu i przynajmniej jednego immunogenu przynajmniej innego patogenu zakażającego ten sam gatunek zwierzęcia. Przynajmniej jeden z tych immunogenów jest korzystnie wybrany wśród członków następującej grupy: - F CDV, HA CDV, F CPI-2, HN CPI-2, gb CHV-1, gc CHV-1 i gd CHV-1 dla psów, - gb FHV-1, gc FHV-1 i gd FHV-1 dla kotów, i - gb EHV-1, gc EHV-1, gd EHV-1, gb EHV-4, gc EHV-4 i gd EHV-4 dla koni. Ulepszone szczepionki DNA monowalentne lub multiwalentne mogą być także połączone z przynajmniej jedną szczepionką klasyczną (nieaktywną, żywą atenuowaną, podjednostkową) lub szczepionką rekombinowaną stosując wektor ekspresyjny in vivo (na przykład, wirus krowianki, adenowirus, wirus opryszczki) skierowaną przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi w szczególności innemu zakażającemu ten sam gatunek. Specjalista może odnieść się do WO-A dla metod konstrukcji plazmidów zawierających te walencje dla koni, WO-A dla walencji kotów i WO-A dla walencji psów. Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również prowadzenie sposobu szczepienia zwierząt domowych lub sportowych w szczególności psów, kotów lub koni. Ten sposób szczepienia obejmuje podanie jednej z tych ulepszonych szczepionek DNA monowalentnych lub multiwalentnych takich jak opisano uprzednio. Ten sposób szczepienia obejmuje podanie jednej lub więcej dawek ulepszonej szczepionki DNA. Ilość DNA stosowana w tych szczepionkach jest zawarta między około 10 μg i około 1000 μg, a korzystnie miedzy około 50 μg i około 500 μg dla danego plazmidu. Specjalista w dziedzinie posiada potrzebne kompetencje, aby dokładnie określić skuteczną dawkę DNA do stosowania w każdym protokole szczepienia. Objętości dawki mogą być korzystnie między 0,5 i 5 ml, a korzystniej między 1 i 3 ml. Ulepszone szczepionki DNA mogą być podawane w ramach tego sposobu szczepienia poprzez różne drogi podawania, proponowane w uprzednim stanie wiedzy dla szczepień polinukleotydowych i za pomocą znanych technik szczepienia. Według dwóch korzystnych opisanych sposobów prowadzenia szczepienia, sposoby szczepienia obejmują podanie na drodze domięśniowej lub na drodze podskórnej ulepszonych szczepionek DNA. Wynalazek będzie niżej opisany za pomocą sposobów jego wykonania przedstawionych jako nieograniczające przykłady, które odnoszą się do załączonych figur rysunku, na których: Fig. 1: Plazmid pab 110, Fig. 2: Plazmid pvr1012, Fig. 3: Plazmid pns021, Fig. 4: Plazmid pns024, Fig. 5: Plazmid psb032, Fig. 6: Plazmid psb034, Fig. 7: Plazmid psb016, Fig. 8: Plazmid psb019, Fig. 9: Plazmid psb017, Fig. 10: Plazmid psb021, Fig. 11: Plazmid psb023, Fig. 12: Plazmid psb024, Fig. 13: Plazmid psb028, Fig. 14: Plazmid psb029, Fig. 15: Plazmid psb030,

12 12 PL B1 Fig. 16: Plazmid psb025, Fig. 17: Plazmid psb026, Fig. 18: Plazmid psb027, Fig. 19: Plazmid pjp084, Fig. 20: sekwencja genu GM-CSF psa, Fig. 21: Plazmid pjp089, Fig. 22: sekwencja genu GM-CSF 3R3, Fig. 23: Plazmid pjp090, Fig. 24: sekwencja genu GM-CSF kota 3R4, Fig. 25: Plazmid pjp097, Fig. 26: sekwencja genu GM-CSF konia, Fig. 27: sekwencja genu CPI-2 F, a Fig. 28: sekwencja genu CPI-2 HN. Lista sekwencji: SEQ ID N 1: oligonukleotyd NS030 SEQ ID N 2: oligonukleotyd NS031 SEQ ID N 3: oligonukleotyd NS034 SEQ ID N 4: oligonukleotyd NS035 SEQ ID N 5: oligonukleotyd NS036 SEQ ID N 6: oligonukleotyd NS037 SEQ ID N 7: oligonukleotyd SB090 SEQ ID N 8: oligonukleotyd SB091 SEQ ID N 9: oligonukleotyd PB326 SEQ ID N 10: oligonukleotyd PB329 SEQ ID N 11: oligonukleotyd PB381 SEQ ID N 12: oligonukleotyd PB382 SEQ ID N 13: oligonukleotyd PB383 SEQ ID N 14: oligonukleotyd PB384 SEQ ID N 15: oligonukleotyd SB101 SEQ ID N 16: oligonukleotyd SB102 SEQ ID N 17: oligonukleotyd SB103 SEQ ID N 18: oligonukleotyd SB104 SEQ ID N 19: oligonukleotyd SB105 SEQ ID N 20: oligonukleotyd SB106 SEQ ID N 21: oligonukleotyd SB107 SEQ ID N 22: oligonukleotyd SB108 SEQ ID N 23: oligonukleotyd SB109 SEQ ID N 24: oligonukleotyd SB110 SEQ ID N 25: oligonukleotyd SB111 SEQ ID N 26: oligonukleotyd SB112 SEQ ID N 27: oligonukleotyd SB113 SEQ ID N 28: oligonukleotyd SB114 SEQ ID N 29: oligonukleotyd SB115 SEQ ID N 30: oligonukleotyd SB116 SEQ ID N 31: oligonukleotyd SB117 SEQ ID N 32: oligonukleotyd SB118 SEQ ID N 33: oligonukleotyd AB325 SEQ ID N 34: oligonukleotyd AB326 SEQ ID N 35: oligonukleotyd AB327 SEQ ID N 36: oligonukleotyd AB328 SEQ ID N 37: oligonukleotyd AB329 SEQ ID N 38: oligonukleotyd AB330 SEQ ID N 39: oligonukleotyd NS003 SEQ ID N 40: oligonukleotyd NS004 SEQ ID N 41: oligonukleotyd NS005 SEQ ID N 42: oligonukleotyd NS006

13 PL B1 13 SEQ ID N 43: oligonukleotyd NS007 SEQ ID N 44: oligonukleotyd NS008 SEQ ID N 45: oligonukleotyd SB119 SEQ ID N 46: oligonukleotyd SB120 SEQ ID N 47: oligonukleotyd SB121 SEQ ID N 48: oligonukleotyd SB122 SEQ ID N 49: oligonukleotyd SB123 SEQ ID N 50: oligonukleotyd SB124 SEQ ID N 51: oligonukleotyd SB125 SEQ ID N 52: oligonukleotyd SB126 SEQ ID N 53: oligonukleotyd SB127 SEQ ID N 54: oligonukleotyd SB128 SEQ ID N 55: oligonukleotyd SB129 SEQ ID N 56: oligonukleotyd SB130 SEQ ID N 57: oligonukleotyd SB131 SEQ ID N 58: oligonukleotyd SB132 SEQ ID N 59: oligonukleotyd SB133 SEQ ID N 60: oligonukleotyd SB134 SEQ ID N 61: oligonukleotyd SB135 SEQ ID N 62: oligonukleotyd SB136 SEQ ID N 63: oligonukleotyd SB137 SEQ ID N 64: oligonukleotyd JP578 SEQ ID N 65: oligonukleotyd JP579 SEQ ID N 66: sekwencja genu GM-CSF psa (patrz fig. 20) SEQ ID N 67: sekwencja genu GM-CSF kota 3R3 (patrz fig. 22) SEQ ID N 68: sekwencja genu GM-CSF kota 3R4 (patrz fig. 24) SEQ ID N 69: sekwencja genu GM-CSF konia (patrz fig. 26) SEQ ID N 70: oligonukleotyd JP734 SEQ ID N 71: oligonukleotyd JP735 SEQ ID N 72: sekwencja genu CPI-2 F (patrz fig. 27) SEQ ID N 73: sekwencja genu CPI-2 HN (patrz fig. 28) Przykłady Dla każdego z rozważanych patogenów każdy gen kodujący główne antygeny powierzchniowe (forma natywna i forma zmodyfikowana) był celem odpowiedniej konstrukcji w eukariotycznym plazmidzie ekspresyjnym. Formy wydzielane antygenów powierzchniowych uzyskano przez delecję fragmentów genów kodujących domeny transbłonowe i cytoplazmatyczne. We wszystkich przypadkach domeny transbłonowe glikoprotein zidentyfikowano na podstawie profili hydropatii odpowiednich sekwencji białek. Tabela podana w przykładzie 11 podsumowuje rozmiary białek typu dzikiego (w aminokwasach) pozycje zidentyfikowane domen transbłonowych, wielkości skróconych białek jak i nazwy odpowiednich plazmidów ekspresyjnych. P r z y k ł a d 1: Podstawowe konstrukcje plazmidów Eukariotyczny plazmid ekspresyjny pvr1020 (C.J. Luke i wsp. J. of Infectious Diseases 1997, 175: 95-97) pochodna plazmidu pvr1012 (fig. 1, przykład 7 WO-A , ponownie przedstawiony na fig. 2 obecnego zgłoszenia), zawiera ramkę kodującą sekwencję sygnałową ludzkiego aktywatora tkankowego plazminogenu (tpa). Plazmid pvr1020 został zmodyfikowany przez trawienie BamHl- Bglll i wstawienie sekwencji kodującej kilka miejsc klonowania (BamHI, Notl, EcoRI, Xbal, Pmll, Pstl, Bglll) wynikającej z parowania następujących oligonukleotydów: PB326 (40 mer) (SEQ ID N 9) 5' GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' i PB329 (40 mer) (SEQ ID N 10) 5' GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3'. Powstały wektor, pab110 (fig. 1) był stosowany do konstrukcji plazmidów zawierających formy skrócone genów kodujących hemaglutyninę (HA) wirusa nosówki psa (CDV) i dla hemaglutyninyneuraminidazy (HN) wirusa paragrypy typu 2 (CPI-2). Intron II genu β-globiny królika sklonowano w wektorze pcrii (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) po uzyskaniu fragmentu DNA odpowiadającego PCR za pomocą następujących oligonukleotydów: