(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej ( S ) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP99/03024 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W099/56772, PCT Gazette nr 45/99 (51) IntCl7 A61K 39/29 (54) Nowa kompozycja (30) Pierwszeństwo: ,GB, (73) Uprawniony z patentu: SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS S.A., Rixensart, BE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 21/01 (72) Twórcy wynalazku: Claude Artois, Rixensart, BE Michael J. Clark, Rixensart, BE Clothilde Thiriart, Rixensart, BE Stefan Gabriel Józef Thoelen, Rixensart, BE (45) o udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/05 (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o. PL B1 (57) 1. Wodna kompozycja szczepionki zawierająca powierzchniowy antygen hepatitis B, inaktywowany wirus hepatitis A (HAV) i formol, w której jest zawarte 0,015-0,1 mg fosforanu glinu na μg powierzchniowego antygenu hepatitis B i 0,05-0,10 mg wodorotlenku glinu na ml. 2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, w której stężenie formolu wynosi około μg na ml. 3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 albo 2, w której stężenie HAV wynosi około EU na ml. 4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 do podawania dorosłym, która zawiera: 40 μg HBsAg 1440 EU HAV 0,85 mg soli glinu (0,8 mg fosforanu glinu plus 0,05 mg wodorotlenku glinu) 20 μg formolu

2 Nowa kompozycja Zastrzeżenia patentowe 1. Wodna kompozycja szczepionki zawierająca powierzchniowy antygen hepatitis B, inaktywowany wirus hepatitis A (HAV) i formol, w której jest zawarte 0,015-0,1 mg fosforanu glinu na μg powierzchniowego antygenu hepatitis B i 0,05-0,10 mg wodorotlenku glinu na ml. 2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, w której stężenie formolu wynosi około μg na ml. 3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 albo 2, w której stężenie HAV wynosi około EU na ml. 4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 do podawania dorosłym, która zawiera: 40 μg HBsAg 1440 EU HAV 0,85 mg soli glinu (0,8 mg fosforanu glinu plus 0,05 mg wodorotlenku glinu) 20 μg formolu 5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 do podawania dorosłym, która zawiera: 40 μg HbsAg 1440 EU HAV 0,85 mg soli glinu (0,8 mg fosforanu glinu plus 0,05 mg wodorotlenku glinu) 20 μg formolu w 1,0 ml dawce. 6. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 do podawania młodzieży i/lub dzieciom, która zawiera: 20 μg HBsAg 720 EU HAV 0,45 mg soli glinu (0,4 mg fosforanu glinu plus 0,05 mg wodorotlenku glinu) w 1ml dawce. 7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 do podawania młodzieży i/lub dzieciom, która zawiera: 20 μg HBsAg 720 EU HAV 0,45 mg soli glinu (0,4 mg fosforanu glinu plus 0,05 mg wodorotlenku glinu) 8. Kompozycja szczepionki według dowolnego z poprzedzających zastrz., w której powierzchniowy antygen hepatitis B jest antygenem S. 9. Kompozycja szczepionki według dowolnego z poprzedzających zastrz., w której antygen hepatitis A pochodzi ze szczepu HM Kompozycja szczepionki według dowolnego z poprzedzających zastrz, do podawania ludziom w 2-dawkowym schemacie. 11. Kompozycja szczepionki według zastrz. 10, w której dwie dawki są podawane jako 0,6 (tj. dawki są podawane w miesiącu 0 i miesiącu 6). * * * Szczepionki dla profilaktyki zakażeń hepatitis A i hepatitis B są dobrze znane. Na przykład szczepionka Engerix-B (znak towarowy) z firmy SmithKline Beecham Biologials jest stosowana do zapobiegania Hepatitis B. Ta szczepionka zawiera antygen powierzchniowy hepatitis B (zwłaszcza 226 aminokwasowy antygen S opisany w publikacji Harford i in.

3 w Postgraduate Medical Journal, 1987, 63 (suppl.2), 65-70) i jest formułowana przy użyciu wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Szczepionka Havrix (znak towarowy) również z finny SmithKline Beecham Biologicals może być stosowana do zapobiegania zakażeniom hepatitis A i również jest formułowana z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Ta szczepionka zawiera atenuowany łańcuch wirusa HM-175 Hepatitis A inaktywowany formolem (formaldehyd); patrz. Andre i in. [Prog. Med. Virol. 1990, tom 37, strony 72-95]. Szczepionka Twinrix (znak towarowy) która jest połączeniem antygenów hepatitis A i hepatitis B może być stosowana do jednoczesnej ochrony przeciw hepatitis A i hepatitis B. Patent europejski EP (Chemo Sero) opisuje ogólną koncepcję łączenia antygenu hepatitis A i antygenu hepatitis B dla wytworzenia połączonej szczepionki. W tyra opisie podano że stosowany adiuwant nie jest krytyczny: musi jedynie być zdolny do zwiększania aktywności immunologicznej w pożądanym stopniu i nie powodować żadnych efektów ubocznych. Podano że może być stosowany żel glinowy, a w szczególności żel wodorotlenku glinu i żel fosforanu glinu. Zgłoszenie PCT opublikowane jako WO 93/24148 (SmithKline Beecham) opisuje wytwarzanie szczepionek zawierających antygen powierzchniowy hepatitis B z fosforanem glinu stosowanym jako adiuwant. Opisano wieloważną szczepionkę połączoną która może ewentualnie zawierać antygen hepatitis A. Nie opisano stosowania formolu. Patent europejski EP (SmithKline Beecham) opisuje nowe formulacje szczepionki zawierające składnik hepatitis B, zwłaszcza antygen powierzchniowy hepatitis B w połączeniu z fosforanem glinu oraz 3-de-O-acetylowanym monofosforylolipidem A. Obecnie nieoczekiwanie stwierdziliśmy, że szczepionki zawierające antygeny hepatitis B i/lub hepatitis A dają szczególnie dobre wyniki jeżeli szczepionka jest formułowana w specyficzny sposób. Przy zastosowaniu formulacji według wynalazku możliwe jest podawanie szczepionek w schemacie 2 dawek a nie w 3 dawkach. W pierwszym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy wodnej kompozycji szczepionki zawierającej antygen powierzchniowy hepatitis B, która jest sformułowana z fosforanem glinu jako adiuwantem, a stężenie fosforanu glinu jest tak dobrane że występuje stosunek 0,015-0,1 mg fosforanu glinu na μg antygenu powierzchniowego hepatitis B. Korzystnie stosunek mieści się w zakresie 0,02 do 0,08 mg fosforanu glinu na μg HbsAg. W dalszym aspekcie niniejszego wynalazku inaktywowany wirus hepatitis A (HAV) może być ewentualnie dodany do formulacji według wynalazku z wytworzeniem połączonej szczepionki hepatitis A plus B która może być podawana w schemacie 2 dawek. Antygenem hepatitis A korzystnie jest szczep HM-175 stosowany w handlowo dostępnym produkcie Havrix (SmithKline Beecham Biologicals). Stężenie antygenu hepatitis A w formulacji szczepionki według wynalazku korzystnie wynosi około jednostek EU na ml. Definicja jednostki EU jest podana w wyżej cytowanej publikacji Andre i in. (1990). Kompozycje według wynalazku które zawierają HAV mogą dodatkowo zawierać wodorotlenek glinu, całkowita ilość wodorotlenku glinu na ogół wynosi 0,05-0,10 mg na ml. Całkowita ilość soli glinu w 0,5 lub 1 ml dawce zazwyczaj mieści się w zakresie 0,4-1,0 mg. W kompozycji szczepionki według wynalazku korzystne jest dodanie formolu (formaldehydu) tak aby stężenie formolu wynosiło μg na ml. Korzystnie stężenie formolu wynosi około μg na ml. Zazwyczaj antygenem hepatitis B jest antygen powierzchniowy hepatitis B (HBsAg). Wytwarzanie antygenu powierzchniowego Hepatitis B (HBsAg) jest dobrze udokumentowane. Patrz na przykład Harford i in. w Develop. Biol. Standard, 54, strona 125 (1983), Gregg i in. w Biotechnology, 5 strona 479 (1987), EP-A , EP-A oraz cytowane w nich publikacje. Stosowane tutaj określenie antygen powierzchniowy hepatitis B" lub HbsA obejmuje dowolny antygen HBsAg lub jego fragment wykazujący immunogenność antygenu powierzchniowego HBV. Należy rozumieć, że obok sekwencji 226 aminokwasów antygenu S HBsAg (patrz Tiollais i in., Nature, 317, 489 (1985) i cytowane tam publikacje) HBsAg jak tu opisano może, jeżeli jest to pożądane, zawierać całość lub cześć sekwencji pre-s jak opisano w wyżej cytowanych publikacjach oraz w EP-A Opisany HBsAg może również oznaczać od-

4 miany, na przykład escape mutant opisany w publikacji patentowej WO 91/ W dalszym aspekcie HBsAg może zawierać białko opisane jako SL* w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP , tj. białko, sekwencję aminokwasów składająca się z części sekwencji aminokwasów białka dużego wirusa hepatitis B (L) (pod typ ad lub ay), charakteryzujący się tym że sekwencja aminokwasów składa się z: (a) reszt 12-52, następnie reszt , a następnie reszt tego białka L; albo (b) reszty 12, następnie reszt 14-52, następnie reszt , a następnie reszt tego białka L. HBsAg może również oznaczać polipeptydy opisane w publikacjach patentowych EP lub EP Zazwyczaj HBsAg ma postać cząstek. Może zawierać samo białko S albo może występować jako cząstki kompozytowe, na przykład (L*,S), gdzie L* ma wyżej podane znaczenie a S oznacza białko S antygenu powierzchniowego hepatitis B. Korzystnie HBsAg jest zaadsorbowany na fosforanie glinu jak opisano w publikacji patentowej WO 93/ Korzystnie antygen hepatitis B jest antygenem S HBsAg jak stosowany w handlowo dostępnym produkcie Engerix-B (SmithKline Beecham Biologicals). Formulacje szczepionki według wynalazku zawierają immunoochronną ilość antygenów i mogą być wytwarzane konwencjonalnymi technikami. Wytwarzanie szczepionek jest generalnie opisane w publikacji New Trends and Developments in Vaccines, wydanej p r z e z Voller i in., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, Kapsułkowanie w liposomach opisał na przykład Fullerton w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki US Przyłączanie białek do makrocząsteczek opisał na przykład Likhite, w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki US oraz Armor i in., w patencie US Kompozycje szczepionek według wynalazku są korzystnie podawane w schemacie 0,6 miesięcy, tj. pierwsza dawka w miesiącu 0 a druga dawka w 6 miesięcy. Kompozycje szczepionki według wynalazku są szczególnie odpowiednie dla dorosłych a również są odpowiednie do podawania młodzieży i dzieciom. Poniższe przykłady ilustrują wynalazek. Przykład 1. Specyficzne formulacje Specyficzne formulacje mieszczące się w zakresie wynalazku obejmują następujące: a) Kompozycja szczepionki do podawania dorosłym, która zawiera: 40 μg HBsAg 1440 E U HAV 0,85 mg soli glinu (0,8 mg fosforanu glinu plus 0,05 mg wodorotlenku glinu) 20 μg formolu b) Kompozycja szczepionki do podawania dorosłym, która zawiera: 40 μg HBsAg 1440 EU HAV 0,85 mg soli glinu (0,8 mg fosforanu glinu plus 0,05 mg wodorotlenku glinu) 20 μg formolu w 1,0 ml dawce. c) Kompozycja szczepionki do podawania młodzieży i/lub dzieciom, która zawiera: 20 μg HbsAg 720 EU HAV 0,45 mg soli glinu (0,4 mg fosforanu glinu plus 0,05 mg wodorotlenku glinu) w 1 ml dawce. d) Kompozycja szczepionki do podawania młodzieży i/lub dzieciom, która zawiera: 20 μg HBsAg 720 EU HAV 0,45 mg soli glinu (0,4 mg fosforanu glinu plus 0,05 mg wodorotlenku glinu)

5 Przykład 2. Badania HAB Jedną grupę 47 zdrowych dorosłych osobników szczepiono kompozycją szczepionki (1 ml objętości) zawierającą: 1440 EU antygenu HAV 40 μg HBsAg (antygen S) 0,8 mg AlPO4 0,05 mg wodorotlenku glinu 20 μg formolu. Jest ona oznaczana w poniższych tabelach skrótem 1440/NF Jedną grupę 47 zdrowych dorosłych osobników szczepiono: a) w jedno ramię kompozycją szczepionki zawierającą 40 μg HBsAg sformułowanego z 0,8 mg AlPO4, 20 μg/ml formolu (ta kompozycja jest dalej oznaczana skrótem NF40 w dawce 1 ml; oraz b) w drugie ramię szczepionką HAVRIX 1440 zawierającą 1440 EU antygenu HAV na 0,5 mg wodorotlenku glinu i zawierającą 20 μg /ml formolu w 1 ml dawce. Schemat szczepień dla HAB 054 był 0,6 (tj. dawki podawano w miesiącu 0 i miesiącu 6). Serologiczne wyniki Hepatitis B w miesiącach 2, 6 i 7 (serokonwersja (SC), seroochrona (SP) i średnie miano geometryczne (GMT)) były nieoczekiwanie wysokie w porównaniu do historycznych wyników otrzymanych w innych badaniach (HBV NF 021) które obejmowały ochotników z tej samej grupy wiekowej. Badania NBV NF 021 (patrz tabela 1) obejmowały trzy grupy: grupa 1: szczepiona formulacją zawierającą 40 μg HbsAg na 0,5 μg AlPO4 w 0,5 ml objętości bez formolu, schemat 0,6 miesięcy (jest oznaczana w tabeli skrótem NF 40 μg, 0,6M) grupa 2: szczepiona formulacją zawierającą 20 μg HbsAg na 0,5 μg AlPO4 w 0,5 ml objętości bez formolu, schemat 0,6 miesięcy (jest oznaczana w tabeli skrótem NF 20 μg, 0,6M) grupa 3: szczepiona formulacją Engerix B (20 μg) przy użyciu klasycznego 3 dawkowego schematu szczepień 0, 1, 6 miesięcy (trzeci rząd w tabeli 1). Wyniki 1) W badaniach HBV NF 021, serologiczne wyniki Hepatitis B w 7 miesiącu w grupach 1 i 2 nie były zadowalające w porównaniu z grupą 3 (niższe SC, SP i GMT +/- 1/3 (500 do 600) poziomów otrzymanych po trzech dawkach Engerix-B (1500). 2) W badaniach HAB 054 miana otrzymane po 2 dawkach szczepionki były tego samego rzędu wielkości jak te które by otrzymano po trzech dawkach Engerix B. Tabela 1: Badania HBV - NF 021 serokonwersja % seroochrona % miano średniej geometrycznej mies. 2 mies. 7 mies. 8 mies. 2 mies. 7 mies. 8 mies. 2 mies. 7 mies. 8 NF 40 μg (0,6M) NF 20 μg (0,6M) Engerix B 20 μg (0, 1, 6M) Tabela 2: Badania HAB 054 HAB 2-dawkowy program dla dorosłych (schemat 0,6 miesięcy) N = 94 HAB 054 Serokonwersja (w %) Anti-HBs 1 2 miesiąc 2 miesiąc 6 miesiąc 7 miesiąc 9 miesiąc HAV 1440/NF

6 cd. tabeli NF 40 (Havrix 1440 w drugie ramię) HAV 1440/NF40: NF40 zawiera 0,85 mg soli Al - 0,8 AlO4 20 μg formolu w 1 ml - 0,05 Al(OH)3 zawiera 0,8 mg A lp04-20 μg formolu w 1 ml Tabela 3: Badania HAB 054 HAB 2-dawkowy program dla dorosłych (schemat 0,6 miesięcy) N = 94 HAB 054 Seroochrona (w %) Anti-HBs miesiąc 2 miesiąc 6 miesiąc 7 miesiąc 9 miesiąc 12 HAV 1440/NF NF 40 (Havrix 1440 w drugie ramię) HAV 1440/NF40: NF40 zawiera 0,85 mg soli Al - 0,8 A lpo4 20μg formolu w 1 ml - 0,05 Al(OH)3 zawiera 0,8 mg AlPO4-20 μg formolu w 1 ml Tabela 4: Badania HAB 054 HAB 2-dawkowy program dla dorosłych (schemat 0,6 mięsiecy) N = 94 Anti - HBs Miano średniej geometrycznej (w %) Anti-HBs miesiąc 2 miesiąc 6 miesiąc 7 miesiąc 9 miesiąc 12 HAV1440/NF40 8, NF 40 (Havrix 1440 w drugie ramię) 8, HAV 1440/NF40: NF40 zawiera 0,85 mg soli Al - 0,8 A lpo4 20 μg formolu w 1 ml - 0,05 Al(OH)3 zawiera 0,8 mg A lpq4-20 μg formolu w 1 ml Tabela 5: Badania HAB 054 HAB 2-dawkowy program dla dorosłych (schemat 0,6 miesięcy) N = 94 HAB 054 S+ % - HAVs dzień 15 miesiąc 1 miesiąc 6 miesiąc 7 miesiąc 9 miesiąc 12 HAV1440/NF NF 40 (Havrix 1440 w drugie ramię) HAV1440/NF40: NF40 zawiera 0,85 mg soli Al - 0,8 A lpo4 20 μg formolu w 1 ml - 0,05 Al(OH)3 zawiera 0,8 mg AlPO4-20 μg formolu w 1 ml

7 T a be l a 6: Badania HAB 054 HAB 2-dawkowy program dla dorosłych (schemat 0,6 miesięcy) N = 94 ANTI-HAV Miano średniej geometrycznej - Anti-HAVs dzień 15 miesiąc 1 miesiąc 6 miesiąc 7 miesiąc 9 miesiąc 12 HAV 1440/NF ,393 7, NF 40 (Havrix 1440 w drugie ramię) ,748 4, HAV1440/NF40: NF40 zawiera 0,85 mg soli Al - 0,8 AlPO4 20 μg formolu w 1 ml - 0,05 Al(OH)3 zawiera 0,8 mg A lpo4-20 μg formolu w 1 ml Przykład 3: Badania HAB 063, HAB 071 i HAB 075 HAB 2-dawkowy program dla młodzieży w wieku lat 3.1: Badania HAB 063 Kompozycja szczepionki zawierała: 720 HAV EU / 20 μg HBsAg 0,25 mg soli glinu 40 μg formolu Wyniki przedstawiono w tabeli 7. Tabela 7: Badania HAB 063 HAB 2 dawkowy program dla młodzieży w wieku lat (schemat 0,6 miesięcy); N = 52 Przeciwciało PI (m l) PI (m2) PI (m6) Pll (m7) Anti - HAV S + % ,2 96,2 100 GMT (EL. U/ml) Anti - HBs S + % 51, ,2 98,1 Seroochrona % 30,8 28,8 71,2 98,1 GMT (mlu/ml) Badania HAB 071 W tym badaniu stosowano dwie grupy. Kompozycja szczepionki grupy 1 zawierała: 720 HAV EU / 20 μg HBsAg 0,425 mg soli glinu 40 μg formolu w 0,5 ml dawce w schemacie 0,6 miesięcy. Kompozycja szczepionki grupy 2 (Twinrix junior) zawierała: 360 EU HAV/ 10 μg HBsAg 0,225 mg soli glinu 40 μg formolu w 0,5 ml dawce w schemacie 0,1,6 miesięcy.

8 Tabela 8: Badania HAB 071 Wysokość dawki HAB (grupa 1) PI (m l) PI (m2) PI (m6) PI (m7) schemat 0,6 n = 50 n = 48 n = 49 n = 49 przeciwciała Anti - HAV s + % 100,0 100,0 100,0 100,0 GMT (EL. U/ml) przeciwciała Anti - HBs S + % 74,0 70,8 85,7 100,0 Seroochrona % 40,0 27,1 57,1 100,0 GMT (EL U/ml) Twinrix Junior (grupa 2) PI (m l) PI (m2) PI (m2) PI (m7) Schemat 0,1, 6 n = 49 n = 48 n = 48 n = 48 przeciwciała Anti-HAV S + % 95,9 100,0 97,9 100,0 GMT (EL. U/ml) przeciwciała Anti-HBs S + % 61,2 97,9 100,0 100,0 Seroochrona % 36,7 83,3 97,9 100,0 GMT (EL. U/ml) Badania HAB 075 W tym badaniu stosowano dwie grupy. Kompozycja szczepionki grupy 1(Twinrix ) zawierała: 720 EU HAV / 20 μg HBsAg 0,45 mg soli glinu w 1 ml dawce w schemacie 0, 6 miesięcy. N=67 Kompozycja szczepionki grupy 2 zawierała: 1440 HAV EU / 40 μg HBsAg 0,85 mg soli glinu w 1 ml dawce w schemacie 0, 6 miesięcy, N = 5

9 Tabela 9: Badania HAB 075 grupa PI (m 1) PI (m2) PI (m6) PII (m7) 1 Anti-HAV S+% 97,0 95,5 100,0 100,0 GMT Anti-HBs S+% 62,7 74,6 95,5 100,0 SP% 22,4 32,8 61,2 100,0 2 GMT Anti-HAV S+% 100,0 100,0 100,0 100,0 GMT Anti-HBs S+% 67,3 85,5 94,5 100,0 SP% 32,7 41,8 72,7 100,0 GMT Przykład 4: Badania HAB 084 HAB 2-dawkowy program dla młodzieży w wieku lat W tym badaniu stosowano dwie grupy. Kompozycja szczepionki grupy 1(Twinrix ) zawierała: 720 EU HAV / 20 μg HBsAg 0,45 mg soli glinu w 1 ml dawce w schemacie 0, 6 miesięcy. Kompozycja szczepionki grupy 2 (Twinrix Junior) zawierała: 360 EU HAV / 10 μg HBsAg 0,225 mg soli glinu 40 μg formolu w 0,5 ml dawce w schemacie 0, 1, 6 miesięcy. Tabela 10: Badania HAB. 084 grupa PI (m 1) PI (m2) PI (m6) PII (m7) N = 142 N = 142 N = 142 N = 142 (0,6) Anti-HAV S+% 99, GMT Anti-HBs S+% 80, SP% ,9 GMT

10 cd. tabeli PI (m 1) PII (m3) PII (m6) PIII (m7) (0, 1,6) N = 148 N = 146 N = 147 N = 147 Anti-HAV S+% 93,2 99,3 99,3 100 GMT Anti-HBs S + % 58,1 95,9 99,3 100 SP% 29,1 85, GMT Przykład 5: badania HAB 076 ' HAB 2-dawkowy program dla dzieci w wieku 1-11 lat Kompozycja szczepionki zawierała: 720 EU HAV / 20 μg HBsAg 0,45 mg soli glinu w 1 ml dawce w schemacie 0, 1 miesiąc. Wyniki przedstawiono w tabeli 11. Tabela 11: Badania HAB 076 PI (m 1) PI (m2) PI (m6) PII (m7) N = 194 N = 201 N = 197 N = 199 Anti-HAV S + % 99,5 98, GMT Anti - HBs S +% 72,7 89,1 93,9 100 SP% 30,3 47,3 78,2 98,5 GMT Podsumowanie Wyniki kliniczne przedstawione w powyższych przykładach wyraźnie pokazują że otrzymuje się satysfakcjonująca odpowiedź immunologiczną zarówno dla hepatitis A jak i hepatitis B po pełnym schemacie, tj. w miesiącu 7 u dzieci, młodzieży i dorosłych. Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.