(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR97/01316

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia (13) B1 (22) Data zgłoszenia (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR97/01316 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W O98/03199, PCT Gazette nr 04/98 (51) IntCl7 A61K 39/295 C12N 15/45 C12N 15/35 C12N 15/50 C12N 15/38 Kompozycja szczepionki przeciwko patogenom psów, zastosowanie jednego albo wielu (54) plazmidów, zestaw do szczepienia, szczepionki dla psów, zastosowanie plazmidu oraz sposób szczepienia (30) Pierwszeństwo: ,FR,96/09401 (73) Uprawniony z patentu: MERIAL, Lyon, FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 14/99 (72) Twórcy wynalazku: Jean-Christophe Audonnet, Lyon, FR Annabelle Boucharaon, Lyon, FR Michel Riviere, Ecully, FR (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/05 (74) Pełnomocnik: Kossowska Janina, PATPOL Sp z o o PL B1 (57) 1. Kompozycja szczepionki przeciwko patogenom psów, zn am ien n a tym, ze obejmuje przynajmniej dwie wartościowości szczepionek, z których każda obejmuje integrujący plazmid, obejmujący gen jednej z wartościowości patogenu psów, który wyraża go in vivo w komórkach psowatego gospodarza, a konkretnie wartościowości wirusa choroby Carre CDV i wartościowość wirusa psiej parwowirozy CPV, przy czym plazmidy obejmują dla każdej wartościowości jeden albo więcej genów wybranych z grupy obejmującej geny HA 1 F wirusa choroby Carre i gen VP2 wirusa psiej parwowirozy. 13. Zestaw do szczepienia, zn a m ie n n y tym, ze obejmujący kom pozycję szczepionki określonej w jednym z zastrz. 1-10, i pierwszą szczepionkę dla psów wybraną z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekombinowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez szczepionkę polinukleotydową albo antygen zapewniający odporność krzyżową, do podawania tej pierwszej szczepionki podczas pierwszego szczepienia 1 kompozycji szczepionki podczas szczepienia przypominającego. 18 Sposób szczepienia psów przeciwko wściekliźnie, zn am ien n y tym, ze psu podaje się szczepionkę obejmującą plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen G wścieklizny oraz odpowiedni nośnik.

2 Kompozycja szczepionki przeciwko patogenom psów, zastosowanie jednego albo wielu plazmidów, zestaw do szczepienia, szczepionki dla psów, zastosowanie plazmidu oraz sposób szczepienia Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja szczepionki przeciwko patogenom psów, znam ienna tym, ze obejmuje przynajmniej dwie wartościowości szczepionek, z których każda obejmuje integrujący plazmid, obejmujący gen jednej z wartościowości patogenu psów, który wyraża go in vivo w komórkach psowatego gospodarza, a konkretnie wartościowości wirusa choroby Carre CDV i wartościowość wirusa psiej parwowirozy CPV, przy czym plazmidy obejmują dla każdej wartościowości jeden albo więcej genów wybranych z grupy obejmującej geny HA i F wirusa choroby Carre i gen VP2 wirusa psiej parwowirozy. 2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znam ienna tym, że dla wartościowości wirusa choroby Carre, plazmid(y) obejmuje (ą) geny HA i F, w tym samym plazmidzie albo w różnych plazmidach. 3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, zn am ien n a tym, ze obejmuje wartościowość psiego koronawirusa CCV, z jednym albo kilkoma plazmidami zawierającymi jeden lub więcej genów wybranych z grupy genów S i M. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znam ienna tym, ze obejmuje gen S albo geny S i M. 5 Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, zn am ien n a tym, ze dodatkowo obejmuje wartościowość skuteczną w zapobieganiu zespołowi zaburzeń oddechowych, m ianowicie PI2 w jednym albo w w ielu plazmidach, które obejm ują przynajmniej jeden spośród genów HA i F. 6 Kompozycja szczepionki według zastrz. 5, znam ienna tym, ze obejmuje geny HA i F wartościowości dla zespołu zaburzeń oddechowych. 7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znam ienna tym, że obejmuje jedną albo wiele wartościowości wybranych z grupy obejmującej herpeswirozę CHV, chorobę z Lyme albo wściekliznę, przy czym plazmidy obejmują dla każdej wartościowości jeden albo wiele genów wybranych z grupy obejmującej geny gb i gd dla wirusa CHV, geny OspA, OspB i p 100 dla B. burgdorferi i gen G dla wścieklizny. 8 Kompozycja szczepionki według zastrz. 7, zn am ien n a tym, ze obejmuje herpeswirozę, przy czym dwa geny gb i gd są włączone do dwóch różnych plazmidów albo do jednego plazmidu. 9 Kompozycja szczepionki według zastrz. 8, znam ienna tym, ze dla choroby z Lyme obejmuje gen OspA. 10. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znam ienna tym, ze obejmuje od 10 ng do 1 mg, korzystnie od 100 ng do 500 µg, jeszcze korzystniej od 1 µg do 250 µg każdego z plazmidów. 11. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 zn am ien n a tym, ze ma dołączoną instrukcję obsługi wskazującą, ze tę kompozycję można zastosować jako szczepionkę przypominającą dla pierwszej szczepionki dla psów wybranej z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkow ą szczepionkę rekombinowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez szcze pionkę polinukleotydow ą albo antygen zapewniający odporność krzyżową. 12. Zastosowanie jednego albo wielu plazmidów, jak określone w jednym z zastrz od 1 do 10, do wytwarzania szczepionki dla psów, uprzednio szczepionych pierw szą szczepionką wybraną z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktyw ow aną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekom binowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen(y) kodowane(y) przez plazm id albo antygen(y) zapewniajacy(e) odporność krzyżową

3 Zestaw do szczepienia, zn am ien n y tym, ze obejmujący kompozycję szczepionki określonej w jednym z zastrz 1-10, i pierwszą szczepionkę dla psów wybraną z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową szczepionkę rekombinowaną przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez szczepionkę polinukleotydową albo antygen zapewniający odporność krzyżow ą do podawania tej pierwszej szczepionki podczas pierwszego szczepienia i kompozycji szczepionki podczas szczepienia przypominającego. 14. Szczepionka do szczepienia psów przeciwko wściekliźnie, zn am ien n a tym, ze obejmuje plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen G wścieklizny oraz odpowiedni nośnik 15. Szczepionka według zastrz. 14, znam ienna tym, ze gen jest pod kontrolą promotora wybranego z grupy składającej się z promotora CMY-IE, wczesnego promotora SV40, późnego promotora SV40, promotora LTR wirusa mięsaka Rousa, promotora genu cytoszkieletu 16. Szczepionka według zastrz. 14, znam ienna tym, że ekspresja genu jest pod kontrolą promotora CMY-IE. 17. Zastosowanie plazmidu, który zawiera i wyraża in vivo gen G wścieklizny oraz odpowiedniego nośnika do wytwarzania szczepionki do szczepienia psów przeciwko wściekliźnie. 18 Sposób szczepienia psów przeciwko wściekliźnie, znam ienny tym, ze psu podaje się szczepionkę obejmującą plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen G wścieklizny oraz odpowiedni nośnik. 19. Szczepionka dla psów, znam ienna tym, ze obejmuje plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen P12 HA lub gen P12 F oraz odpowiedni nośnik. 20 Szczepionka według zastrz. 19, znam ienna tym, ze plazmid zawiera i wyraża oba geny HA i F 21. Szczepionka według zastrz. 19, znam ienna tym, ze obejmuje pierwszy plazmid, który zawiera i wyraża gen HA oraz drugi plazmid, który zawiera i wyraża gen F. 22 Szczepionka dla psów, znam ienna tym, że obejmuje plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen CHV gb lub CHV gd oraz odpowiedni nośnik. 23 Szczepionka według zastrz. 22, znam ienna tym, że plazmid zawiera i wyraża oba geny gb i gd. 24. Szczepionka według zastrz. 22, znam ienna tym, ze obejmuje pierwszy plazmid, który zawiera i wyraża gen gb oraz drugi plazmid, który zawiera i wyraża gen gd. 25. Szczepionka dla psów, znam ienna tym, ze obejmuje plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen CCV S lub gen CCV M oraz odpowiedni nośnik. 26. Szczepionka według zastrz. 25, znam ienna tym, ze plazmid zawiera i wyraża oba geny S i M. 27. Szczepionka według zastrz. 25, znam ienna tym, ze obejmuje pierwszy plazmid, który zawiera i wyraża gen S oraz drugi plazmid, który zawiera i wyraża gen M. 28 Szczepionka dla psów, znam ienna tym, ze obejmuje plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen CPV VP2 oraz od powiedni nośnik. 29. Szczepionka dla psów, znam ienna tym, ze obejmuje plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen CDV HA lub gen CDV F oraz odpowiedni nośnik. 30. Szczepionka według zastrz. 27, znam ienna tym, ze plazmid zawiera i wyraża oba geny HA i F. 31. Szczepionka według zastrz 29, znam ienna tym, ze obejmuje pierwszy plazmid, który zawiera i wyraża gen HA i drugi plazmid, który zawiera i wyraża gen F. 32. Szczepionka do szczepienia psów przeciwko chorobie z Lyme, znam ienna tym, ze obejmuje plazmid, który zawiera i wyraża in vivo geny OspA, OspB lub p 100 oraz odpowiedni nośnik 33. Szczepionka według zastrz. 32, zn am ienna tym, że plazmid zawiera i wyraża gen OspA. 34. Szczepionka według dowolnego z zastrz. od 19 do 33, znam ienna tym, że gen jest pod kontrolą promotora wybranego z grupy składającej się z promotora CMY-IE, wczesnego promotora SV40, późnego promotora SV40, promotora LTR wirusa mięsaka Rousa, promotora genu cytoszkieletu.

4 Szczepionka według dowolnego z zastrz od 19 do 33, znam ienna tym, ze ekspresja genu jest pod kontrolą promotora CMY-IE. * * Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki przeciwko patogenom psów, zastosowanie jednego albo wielu plazmidów, zestaw do szczepienia, szczepionki dla psów, zastosowanie plazmidu oraz sposób szczepienia psów. Choroby zakaźne psów są niezwykle różnorodne i często trudne do opanowania ze względu na warunki spotykane w środowisku naturalnym. Istnieje obecnie wiele szczepionek, zwłaszcza przeciwko chorobie Carre' (wirus CDV), parwowirozie (wirus CCV), koronawirozie, kaszlowi kennelowemu lub zespołowi zaburzeń oddechowych (wirus P 12) i wściekliźnie (rabdowirus). Szczepionki te generalnie są szczepionkami żywymi obejmującymi szczepy atenuowane. Dotyczy to zwłaszcza szczepionki przeciwko chorobie Carre', szczepionki przeciwko zakażeniom adenowirusami, szczepionki przeciwko parwowirozie i szczepionki przeciwko psiemu koronawirusowi. W niektórych przypadkach proponowano również szczepionki inaktywowane, podobnie jak dla wścieklizny i koronawirozy Te różnorodne szczepionki są sprzedawane zarówno osobno, to znaczy w postaci szczepionek monowalentnych, jak i w postaci złożonej, jako szczepionki poliwalentne. Wytwarzane do tej pory skojarzone poliwalentne szczepionki stwarzają problemy związane ze zgodnością i stabilnością. Istnieje rzeczywista potrzeba zapewnienia zgodności między różnymi wartościowościami szczepionki, z powodu zastosowania różnych antygenów, bądź z powodu samych kompozycji, szczególnie w przypadku gdzie połączone są szczepionki inaktywowane i szczepionki żywe. Istnieje również problem konserwacji takiej kombinacji szczepionek i ich bezpieczeństwa, szczególnie w obecności adiuwantu. Takie szczepionki są na ogół dosyć drogie. Dodatkowo stopień ochrony i czas jej trwania może być bardzo zmienny i wrażliwy na warunki środowiska naturalnego. Ma to szczególnie znaczenie w przypadku szczepienia szczeniąt, u których przeciwciała pochodzenia matczynego zapobiegają immunizacji przez szczepionki inaktywowane, a nawet żywe. Tak więc jest wskazane udoskonalenie szczepienia psowatych, a zwłaszcza psów, z uwzględnieniem ograniczeń ekonomicznych, które wykluczają stosowanie szczepionek drogich lub skomplikowanych w użyciu. Badania dotyczące szczepień przeciwko chorobie Carre wykorzystujące oczyszczone preparaty antygenów fuzyjnych F i równoważników hemaglutyniny H w kompletnym adiuwancie Freunda sugerują, ze antygen F mógłby być interesującym immunogenem ze względu na zapewnienie ochrony przeciwko wirusowi CDV (E. Norrby i in., J. Virol. Maj 1986' ) jako szczepionka podjednostkową. Inny artykuł (P. de Vries i in., J. Gen, Virol. 1988, 69: ) sugeruje z drugiej strony, ze białka F i HA CDV mogą być korzystne w szczepieniu według techniki kompleksów immunostymulujących (ISCOMS). Myszy immunizowane rekombinowaną szczepionką wyrażającą gen dla białka F CDV były zabezpieczone przez prowokacją tym wirusem. Wyniki te jednakże są jedynie doświadczalne, stąd są trudne do oceny zwłaszcza w środowisku naturalnym W odniesieniu do za k a ż e n ia p arw ow irozą b a d a n ia n a d p o d j ednostkow ą s z c z e p i o n k ą obejmującą główne białko kapsydowe VP2 wirusa CPV uzyskane przez rekombinację genetyczną w bakulowirusach wykazały możliwą ochronę szczepionych psów przed prowokacją wirusem CPV. W odniesieniu do psiego herpeswirusa, przeprowadzono badania nad wykorzystaniem glikoprotein jako składników szczepionek podjednostkowych. Badania te wykazały wzbudzenie

5 krzyżowej odporności z innymi wirusami herpes takimi jak FHV, ale nie przedstawiono żadnych wniosków, co do możliwości wytworzenia szczepionki ochronnej. Dla choroby z Lyme, kompozycja OspA i OspB wywołuje ochronę u myszy i psów, a sam OspA u myszy, chomików i psów. W zgłoszeniach patentowych WO-A , WO-A , WO-A i WO- -A doniesiono o stosowaniu ostatnio rozwijanych technik szczepionek polinukleotydowych Wiadomo, ze szczepionki te wykorzystują plazmid zdolny do wyrażania w komórkach gospodarza antygenu włączonego do plazmidu. Proponowano wszystkie drogi podawania (dootrzewnową, dożylną, domięśniową, przezskórną, śródskórną, śluzów kow ą i podobne) Do szczepień stosowane są różne środki, takie jak DNA osadzone na powierzchni cząstek złota, które są wystrzeliwane tak, ze penetrują przez skórę zwierzęcia (Tang i in., Nature 356, , 1992) i wtryskiwacze do wstrzyknięć strumienia płynu, które powodują, ze jest możliwa jednoczesna transfekcja skóry, tkanek mięśniowych, tkanek tłuszczowych i tkanek gruczołu sutkowego (Furth i in., Analytical Biochemistry, 205, , 1992). W szczepionkach polinukleotydowych mogą również być stosowane zarówno nagie DNA jak i kompozycje DNA, na przykład wewnątrz kationowych lipidów albo liposomów. Wcześniejszy stan techniki nie podaje żadnych wyników mówiących o ochronie psów z wykorzystaniem sposobu szczepień polinukleotydowych przeciwko tym chorobom. Znacznie mniej wiadomo do tej pory o psich koronawirusach CCV i o czynnikach odpowiedzialnych za zespół zaburzeń oddechowych. W odniesieniu do wścieklizny, ochronę myszy przeciwko prowokacji czynnikiem zjadliwym wykazano po leczeniu szczepionką polinukleotydową wyrażającą gen dla białka G pod kontrolą wczesnego wirusowego promotora SV40 (Xiang i in., Virology 199, 1994, ), podobne wyniki osiągnięto stosując promotor CMV IE. Celem wynalazku jest dostarczenie kompozycji multiwalentnej szczepionki, która zapewni skuteczne szczepienie psów przeciwko wielu czynnikom chorobotwórczym, która zawiera różne wartościowości, oraz spełnia wszystkie wymagane kryteria wzajemnej zgodności i stabilności wartościowości Taka kompozycja szczepionki, która umożliwi połączenie różnych wartościowości w tym samym nośniku, jest łatwa w użyciu i niedroga Dodatkowo celem wynalazku jest dostarczenie takiego sposobu szczepień psów, który umożliwi zwiększenie skuteczności szczepionki według wynalazku albo znaczące zmniejszenie ilości szczepień i uzyskanie zadowalającego bezpieczeństwa. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki przeciwko patogenom psów, obejmująca przynajmniej dwie wartościowości szczepionek, z których każda obejmuje integrujący plazmid, obejmujący gen jednej z wartościowości patogenu psów, który wyraża go in vivo w komórkach psowatego gospodarza, a konkretnie wartościowości wirusa choroby Carre CDV i wartościowość wirusa psiej parwowirozy CPV, przy czym plazmidy obejm ują dla każdej wartościowości jeden albo więcej genów wybranych z grupy obejmującej geny HA i F wirusa choroby Carre i gen VP2 wirusa psiej parwowirozy. Korzystnie dla wartościowości dla wirusa choroby Carre, plazmid(y) obejmuje geny HA i F zarówno włączone do jednego plazmidu jak i włączone do różnych plazmidów Kompozycja szczepionki według wynalazku może również obejmować wartościowość dla psiego koronawirusa CCV, z jednym lub więcej genami wybranymi z grupy genów S i M, korzystnie gen S albo geny S i M. Geny te mogą być włączone do różnych plazmidów lub połączone razem w tym samym plazmidzie w sposób pozwalający na ich wyrażanie W korzystnym wykonaniu powyżej wymienione kompozycje szczepionki b1- i triwalentne według wynalazku mogą również obejmować, dodatkowo, wartościowości skuteczne w zapobieganiu zespołowi zaburzeń oddychania, mianowicie wartościowość PI2, które obejmują przynajmniej jedne z genów HA i F, korzystniej oba geny HA i F. Kompozycja szczepionki według wynalazku korzystnie obejmuje również jedną albo wiele wartościowości wybranych z grupy obejmującej herpeswirozę CHV, chorobę z Lyme albo wściekliznę, plazmidy obejmujące dla każdej wartościowości, jeden albo wiele genów wybranych z grupy obejmującej geny gb i gd dla wirusa CHV, geny OspA, OspB i p 100 dla B burgdorferi (choroba z Lyme) i gen G dla wścieklizny.

6 Korzystnie dla zakażenia wirusem herpes dwa geny gb i gd są połączone zarówno w dwóch plazmidach, jak i w jednym Dla choroby z Lyme, korzystny jest gen OspA. W korzystnym wykonaniu wynalazku kompozycja szczepionki według wynalazku ma dołączoną instrukcję obsługi wskazującą, ze tę kompozycję można zastosować jako szczepionkę przypominającą dla pierwszej szczepionki dla psów wybranej z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekombinowaną przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez szczepionkę polinukleotydową albo antygen zapewniający odporność krzyżową. Wartościowość według mniejszego wynalazku należy rozumieć jako przynajmniej jeden antygen zapewniający ochronę przeciwko wirusowi jako rozważanemu patogenowi, i jest możliwe, ze wartościowość zawiera, jako podwartościowości, jeden lub więcej zmodyfikowanych lub naturalnych genów z jednego lub więcej szczepów rozważanego patogenu Gen czynnika patogennego należy rozumieć nie tylko jako gen kompletny, lecz również jako różnorodne sekwencje nukleotydowe, w tym fragmenty zachowujące zdolność do wywołania odpowiedzi odpornościowej. Wyrażenie, że geny obejmują sekwencje nukleotydowe równoważne z tymi opisanymi szczegółowo w przykładach, dotyczy sekwencji różniących się, lecz kodujących to samo białko. Oznacza to również sekwencje nukleotydowe innych szczepów rozważanego patogenu, które zapewniają ochronę krzyżow ą albo ochronę charakterystyczną dla danego szczepu albo grupy szczepu. Oznacza również sekwencje nukleotydowe, które zostały zmodyfikowane w celu ułatwienia ekspresji in vivo w zwierzęciu będącym gospodarzem, lecz ciągle kodują to samo białko. Kompozycja szczepionki według wynalazku zawiera różne wartościowości w terapeutycznie skutecznych ilościach. Korzystnie kompozycja szczepionki według wynalazku obejmuje od 10 ng do 1 mg, korzystnie od 100 ng do 500 µg, jeszcze korzystniej od 1 µg do 250 µg każdego z plazmidów Nośnik stosowany do podawania szczepionki, na przykład drogą domięśniową będzie w objętości dawki między 0,1 a 5 ml, korzystniej między 0, 5 a 2 ml. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie jednego albo wielu plazmidów według wynalazku do wytwarzania szczepionki dla psów, uprzednio szczepionych pierwszą szczepionką wybraną z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekombinowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen(y) kodowane(y) przez plazmid albo antygen(y) zapewniający(e) odporność krzyżową. Wskazane jest stosowanie nagich plazmidów po prostu w nośniku do szczepionki, którym zazwyczaj będzie sól fizjologiczna (0,9% NaCl), woda destylowana, bufor TE i tym podobne M ogą w ten sposób oczywiście być wykorzystane wszystkie formy szczepionki polinukleotydowej wcześniej opisane w stanie techniki. Każdy plazmid zawiera promotor zdolny do zapewnienia ekspresji włączonego genu, pod jego kontrolą w komórkach gospodarza Zazwyczaj będzie to silny promotor eukariotyczny, a zwłaszcza wczesny promotor CMV-IE wirusa cytomegaln pochodzenia ludzkiego lub mysiego, albo ewentualnie o innym pochodzeniu np. od szczurów, świń albo od świnek morskich. Bardziej ogólnie, promotor może być zarówno pochodzenia wirusowego jak i komórkowego Jako promotor wirusowy inny niż CMY-IE można wymienić wczesny i późny promotor wirusa SV40 albo promotor LTR wirusa mięsaka Rous'a. Możliwy jest również promotor wirusa, z którego pochodzi gen, na przykład własny promotor genu. Jako promotor komórkowy może być wymieniony promotor genu cytoszkieletu, taki jak na przykład promotor desminy (Bolmont i in., Journal of Submicroscopic Cytology and pathology, ; i Zhenlin i in.. Gene, 1989, 78, ). albo alternatywnie promotor aktyny Gdy kilka genów jest prezentowanych w tym samym plazmidzie, m ogą one być prezentowane w tej samej jednostce transkrypcyjnej lub w dwóch różnych jednostkach. Kombinacja różnych wartościowości szczepionki według wynalazku może być korzystnie uzyskana przez zmieszanie plazmidów polinukleotydowych wyrażających antygen(y) każdej wartościowości, lecz antygeny kilku wartościowości mogą być również wyrażane w tym samym plazmidzie.

7 Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do szczepienia obejmujący kompozycję szczepionki według wynalazku i pierwszą szczepionkę dla psów wybraną z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekombinowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez szczepionkę polinukleotydową albo antygen zapewniający odporność krzyżową, do podawania tej pierwszej szczepionki podczas pierwszego szczepienia i kompozycji szczepionki podczas szczepienia przypominającego. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka do szczepienia psów przeciwko wściekliźnie obejmująca plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen G wścieklizny oraz odpowiedni nośnik. W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie plazmidu, który zawiera i wyraża in vivo gen G wścieklizny oraz odpowiedniego nośnika do wytwarzania szczepionki do szczepienia psów przeciwko wściekliźnie Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również sposób szczepienia psów przeciwko wściekliźnie, według którego psu podaje się szczepionkę obejmującą plazmid zawierający i wyrażający in vivo gen G wścieklizny oraz odpowiedni nośnik. Kompozycje szczepionki według wynalazku mogą być podawane różnymi sposobami podawania opisanymi we wcześniejszym stanie techniki dla szczepionek polinukleotydowych albo znanymi technikami podawania, przy czym korzystną drogą podawania jest droga domięśniowa. Wydajność prezentowania antygenów układowi odpornościowemu różni się zależnie od tkanki Błony śluzowe układu oddechowego służą jako bariera przeciwko wnikaniu patogenów i są związane z tkankami limfatycznymi wspomagającymi miejscową odporność. Podawanie szczepionki przez kontakt z błonami śluzowymi, zwłaszcza błoną śluzową policzka i błoną śluzową gardła i błoną śluzową okolicy oskrzeli jest szczególnie wskazane dla szczepień przeciwko chorobom układu oddechowego i pokarmowego. Możliwe jest podawanie szczepionki przez błony śluzowe, szczególnie z zastosowaniem nebulizacji albo rozpylacza albo wody pitnej. W związku z tym możliwe jest podawanie tą drogą kompozycji szczepionki według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka dla psów obejmująca plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen P12 HA lub gen P12 F oraz odpowiedni nośnik, korzystnie plazmid zawiera i wyraża oba geny HA i F, korzystniej szczepionka obejmuje pierwszy plazmid, który zawiera i wyraża gen HA oraz drugi plazmid, który zawiera i wyraża gen F. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka dla psów obejmująca plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen CHV gb lub CHV gd oraz odpowiedni nośnik, korzystnie plazmid zawiera i wyraża oba geny gb i gd, korzystniej szczepionka obejmuje pierwszy plazmid, który zawiera i wyraża gen gb oraz drugi plazmid, który zawiera i wyraża gen gd. W zakres wynalazku wchodzi również szczepionka dla psów obejmująca plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen CCV S lub gen CCV M oraz odpowiedni nośnik, korzystnie plazmid zawiera i wyraża oba geny S i M, korzystniej szczepionka obejmuje pierwszy plazmid, który zawiera i wyraża gen S oraz drugi plazmid, który zawiera i wyraża gen M Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka dla psów obejmująca plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen CPV VP2 oraz odpowiedni nośnik. Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka dla psów obejmująca plazmid, który zawiera i wyraża in vivo gen CDV HA lub gen CDV F oraz odpowiedni nośnik, korzystnie plazmid zawiera i wyraża oba geny HA i F, korzystniej szczepionka obejmuje pierwszy plazmid, który zawiera i wyraża gen HA i drugi plazmid, który zawiera i wyraża gen F W zakres wynalazku wchodzi również szczepionka do szczepienia psów przeciwko chorobie z Lyme obejmująca plazmid, który zawiera i wyraża in vivo geny OspA, OspB lub p 100 oraz odpowiednimnośnik, korzystniej plazmid zawiera i wyraża gen OspA. W korzystnym wykonaniu szczepionki według wynalazku gen jest pod kontrolą promotoia wybranego z grupy składającej się z promotora CMY-IE, wczesnego promotora SV40, późnego promotora SV40, promotora LTR wirusa mięsaka Rousa, promotora genu cytoszkieletu, korzystniej ekspresja genu jest pod kontrolą promotora CMY-IE.

8 Szczepionki monowalentne zawierające jeden lub więcej plazmidów kodujących jeden lub więcej wcześniej opisanych genów z jednego z powyższych wirusów, mogą różnić się odnośnie, co do wyboru genów, ich kombinacji, kompozycji plazmidów, objętości dawki, dawek i innych cech Kompozycje monowalentnej szczepionki mogą być również stosowanie (i) do przygotowania kompozycji opisanej powyżej szczepionki poliwalentnej, (ii) pojedynczo w przypadku aktualniej patologii, (iii) do połączenia ze szczepionką innego typu (żywą lub w całości inaktywowaną, rekombinowaną, podjednostkową) przeciwko innej patologii, albo (iv) jako dawka przypominająca dla szczepionki opisanej powyżej. Warte odnotowania jest, ze szczepionka polinukleotydowa posiada potencjalne działanie dawki przypominającej, co powoduje spotęgowanie odpowiedzi immunologicznej i nabycie długotrwałej odporności. Ogólnie, szczepionka służąca do pierwszego szczepienia może być wybrana ze szczepionek różnych producentów szczepionek weterynaryjnych dostępnych na rynku. Możliwe jest również szczepienie obejmujące pierwsze szczepienia, tak jak to opisano powyżej i dawkę przypominającą kompozycją szczepionki według wynalazku. Wskazane jest podawanie w pierwszej kolejności zwierzęciu skutecznej dawki szczepionki tradycyjnej, szczególnie inaktywowanej, żywej, atenuowanej albo rekombinowanej albo alternatywnie szczepionki podjednostkowej, zapewniającej pierwsze szczepienie i podawanie po czasie korzystnie od 2 do 6 tygodni poliwalentnej albo monowalentnej szczepionki według wynalazku Sposób przygotowania kompozycji szczepionek, to znaczy przygotowania wartościowości i ich mieszanin, wynika jasno z opisu wynalazku. Wynalazek teraz zostanie opisany bardziej szczegółowo przez wykonania wynalazku podane w odniesieniu do towarzyszących rysunków. Lista Figur Figura nr 1: Plazmid pvr1012 Figura nr 2: Plazmid pab044 Figura nr 3. Plazmid pab036 Figura nr 4: Plazmid pab024 Figura nr 5' Plazmid pab021 Figura nr 6 Plazmid pab022 Figura nr 7 Plazmid pab037 Figura nr 8' Plazmid pab038 Figura nr 9. Plazmid pab017 Figura nr 10 Plazmid pab041 Lista sekwencji Id. Sekw. nr : Id Sekw. nr 1. oligonukleotyd AB0 17 Id. Sekw. nr 2' oligonukleotyd AB0 18 Id Sekw. nr 3 oligonukleotyd AB085 Id. Sekw. nr 4 oligonukleotyd AB086 Id Sekw. nr 5 oligonukleotyd AB053 Id. Sekw. nr 6. oligonukleotyd AB054 Id. Sekw. nr 7: oligonukleotyd AB045 Id. Sekw. nr 8: oligonukleotyd AB048 Id. Sekw. nr 9. o ligonukleotyd AB049 Id Sekw nr 10: oligonukleotyd AB050 Id Sekw. nr 11: oligonukleotyd AB087 Id Sekw. nr 12 oligonukleotyd AB088 Id Sekw. nr 13 oligonukleotyd AB089 Id Sekw nr 14: oligonukleotyd AB090 Id Sekw. nr 15 oligonukleotyd AB038

9 Id Sekw nr 16 oligonukleotyd AB039 Id Sekw. nr 17: oligonukleotyd AB011 Id Sekw. nr 18. oligonukleotyd AB012 Przykłady Przykład 1: Hodowla wirusa Wirusy hoduje się w odpowiednim układzie komórkowym, do uzyskania efektu cytopatycznego. Układy komórkowe do zastosowania dla każdego z wirusów są znane specjalistom Pokrótce, komórki wrażliwe na wirusa, które hoduje się w minimalnej niezbędnej pożywce Eagle'a (MEM) albo w innej odpowiedniej pożywce, zakaża się badanym szczepem wirusa stosując wielokrotność zakażenia równą 1. Zakażone komórki inkubuje się w 37 C przez czas niezbędny do wystąpienia całkowitego efektu cytopatycznego (średnio 36 godzin). Przykład 2: Hodowla bakterii Szczepy Borrelia burgdorferi hodowano w odpowiedniej pożywce i w warunkach dobrze znanym specjalistom. Warunki te i pożywkę opisał szczegółowo A. Barbour (J. Biol. Med 1984, 57, 71-75). Ekstrakcję bakteryjnego DNA przeprowadzono w warunkach opisanych przez W. Simpson i in., (Infect. Immunol. 1990, 58, ). Również można było wykorzystać klasyczne techniki opisane przez J. Sambrook i in., (Molecular clomng. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) Przykład 3: Ekstrakcja wirusowych genomowych DNA Po hodowli, nadsącz i rozłożone komórki zbiera się i całą zawiesinę wirusa wiruje się przy 1000 g przez 10 minut w 4 C w celu usunięcia resztek komórkowych. Cząstki wirusa zbiera się przez ultrawirowanie przy g przez godzinę w 4 C. Osad pobiera się w minimalnej objętości buforu (10 mm Tris, 1 mm EDTA). Tę zatężoną zawiesinę wirusa traktuje się proteinazą K (100 µg/ml objętości końcowej) w obecności soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS) (0,5%) przez 2 godziny w 37 C Wirusowy DNA ekstrahuje się mieszaniną fenol/chloroform i precypituje 2 objętościami absolutnego etanolu. Po pozostawieniu przez noc w -20 C, DNA wiruje się przy g przez 15 minut w 4 C. Osad DNA suszy się i pobiera w minimalnej objętości sterylnej, ultraczystej wody. Następnie można go trawić enzymami restrykcyjnymi. Przykład 4: Izolacja wirusowych genomowych RNA Wirusy RNA oczyszczono według technik znanych specjalistom. Następnie, genomowy wirusowy RNA każdego z wirusów izolowano stosując technikę ekstrakcji rodankiem guanidyny/fenol-chloroform opisaną przez Chomczynski i Sacchi (Anal. Biochem., 1987, ) Przykład 5 Techniki biologii molekularnej Wszystkie konstrukcje plazmidów przeprowadzono stosując standardowe techniki biologii molekularnej, opisane przez Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Wszystkie fragmenty restrykcyjne zastosowane w wynalazku wyizolowano stosując zestaw Geneclean (BIO 101 Inc., La Jolla, CA). Przykład 6: Technika RT-PCR Swoiste oligonukleotydy (obejmujące miejsca restrykcyjne na końcach 5' w celu ułatwienia klonowania amplifikowanych fragmentów) syntetyzowano w taki sposób, ze pokrywały w całości regiony kodujące genów, które miały być amplifikowane (patrz, konkretne przykłady) Reakcję odwrotnej transkrypcji (RT) i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przeprowadzono technikami standardowymi (Sambrook i in., 1989). Każdą z reakcji RT-PCR przeprowadzono z parą swoistych starterów amplifikacji z ekstrahowanym genomowym wirusowym RNA jako matrycą. Amplifikowany komplementarny DNA ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1), po czym trawiono enzymami restrykcyjnymi. Przykład 7: plazmid pvr1012 Plazmid pvr1012 (figura 1) otrzymano z Vical In c, San Diego, CA, USA. Jego konstrukcję opisano w Hartikka i in. (Human Gene Therapy, 1996, 7: ). Przykład 8: Konstruowanie plazmidu pab044 (gen HA CDV)

10 Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa choroby Carre (CDV) (szczep Onderstepoort) (M. Sidhu i in., Virology, 1993, 193, 66-72) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami: AB0 17 (35-mer) (Id Sekw. nr 1) 5'AAAACTGCAGAATGCTCCCCTACCAAGACAAGGTG3' AB018 (37-mer) (Id. Sekw nr 2) 5' CGCGGATCCTTAACGGTTACATGAGAATCTTATACGG3' w taki sposób, ze izolowano gen kodujący glikoproteinę HA CDV w postaci fragmentu PstI-BamHI o wielkości 1835 bp. Po oczyszczeniu, fragment PCR o wielkości 1835 bp trawiono PstI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu Pstl-BamHI o wielkości 1817 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pvr1012 (przykład 7), trawionym uprzednio PstI i BamHI, otrzymując plazmid pab044 (6676 bp) (figura 2). Przykład 9: Konstruowanie plazmidu AB036 (gen F CDV) Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa choroby Carre (CDV) (szczep Onderstepoort) (R. Driellen, Genbank nr dostępu X65509) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydarni: AB085 (40-mer) (Id Sekw. nr 3) 5 ATAAGAAGCGGCCGCACATGCACAAGGGAATCCCCAAAAG3 AB086 (32-mer) (Id. Sekw. nr 4) 5'CGCGGATCCACTTCAGTGTGATCTCACATAGG3 w taki sposób, ze izolowano gen kodujący glikoproteinę f CDV w postaci fragmentu NotI-BamHI Po oczyszczeniu, produkt PCR-RT o wielkości 2018 bp trawiono NotI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu NotI-BamHI o wielkości 2000 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pvr1012 (przykład 7), trawiony uprzednio PstI i BamHI, otrzymując plazmid pab036 (6893 bp) (figura 3). Przykład 10' Konstrukcja plazmidu pab024 (gen VP2 psiego parwowirusa) Reakcję PCR przeprowadzono z genomowym DNA psiego parwowirusa (CPV) (szczep CPV-B) (C. Pam sh i in., GenBank nr dostępu M 19296) wytworzonym techniką według przykładu 3 z następującymi oligonukleotydam i: AB053 (33-mer) (Id. Sekw. nr 5) 5' ACGCGTCGACATGAGTGATGGAGCAGTTCAACC3' AB054 (33-mer) (Id. Sekw. nr 6) 5 'CGCGGATCCTTAATATAATTTTCTAGGTGCTAG3' (5634 bp) (figura 6). w taki sposób, ze izolowano gen kodujący białko kapsydowe VP2 (CPV VP2) w postaci fragmentu SalI-BamHI. Po oczyszczeniu, produkt PCR trawiono SalI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu SalI-BamHI o wielkości 1760 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pvr1012 (przykład 7), trawionym uprzednio SalI i BamHI, otrzymując plazmid pab024 (6629 bp) (figura 4). Przykład 11: Konstrukcja plazmidu pab021 (gen S CCV) Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA psiego koronawirusa (CCV) (B. Horsburgh i in.. J. Gen. Virol., 1992, ) z następującymi oligonukleotydami: AB045 (32-mer) (Id. Sekw. nr 7) 5 ACGCGTCGACATGATTGTGCTTACATTGTGCC 3' AB048 (35-mer) (Id Sekw nr 8) 5' CGCGGATCCTCAGTGAACATGAACTTTTTCAATAG3'

11 w taki sposób, ze amplifikowano fragment obejmujący gen kodujący glikoproteinę S CCV w postaci fragmentu SalI-BamHI. Po oczyszczeniu, produkt RT-PCR trawiono SalI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu SalI-BamHI o wielkości 4361 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pvr1012 (przykład 7), trawionym uprzednio SalI i BamHI, otrzymując plazmid pab021 (9030 bp) (figura 5). Przykład 12: Konstrukcja plazmidu pab022 (gen M CCV) Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA psiego koronawirusa (CCV) (B. Horsburgh i m., J. Gen. Virol., 1992, 73, ) przeprowadzono według techniki z przykładu 4, z następującymi oligonukleotydam i: AB049 (34-mer) (Id. Sekw. nr 9) 5' AAAACTGCAGAAATGAAGAAAATTTTGTTTTTAC3' AB050 (33-mer) (Id. Sekw. nr 10) 5'CGCGGATCCTTATACCATATGTAATAATTTTTC3' w taki sposób, ze izolowano sekwencję kodującą gliko-proteinę M w postaci fragmentu PstI-BamHI. Po oczyszczemu, produkt PCR-RT trawiono PstI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu Pstl-BamHI o wielkości 792 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pvr1012 (przykład 7), trawionym uprzednio PstI i BamHI, otrzymując plazmid pab022 (5651 bp) (figura 6) Przykład 13 - Konstrukcja plazmidu pab037 (gen gb CHV) Reakcję PCR przeprowadzono z genomowym DNA psiego wirusa herpes (CHV) (szczep Carmichael) (K Limbach in., J. Gen. Virol., 1994, 75, ), według techniki z przykładu 3, z następującymi oligonukleotydami: AB087 (34-mer) (Id. Sekw. nr 11) 5' AAAACTGCAGAAGTATGTTTTCATTGTATCTATA3' AB088 (34-mer) (Id Sekw. nr 12) 5 CTAGTCTAGATTATTAAACTTTACTTTCATTTTC3' w taki sposób, ze izolowano gen kodujący glikoproteinę gb wirusa CHV w postaci fragmentu. Po oczyszczeniu, produkt PCR o wielkości 2667 bp trawiono PstI i XbaI w celu uwolnienia fragmentu PstI-XbaI o wielkości 2648 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pvr1012 (przykład 7), trawiony uprzednio PstI-XbaI, otrzymując plazmid pab- 037(6107 bp) (figura 7) Przykład 14: Konstrukcja plazmidu pab038 (gen gd CHV) Reakcję PCR przeprowadzono z genomowym DNA psiego wirusa herpes (CHV) (szczep Carmichael) (K. Limbach i in., J. Gen. Virol., 1994, 75, ), według techniki z przykładu 3, z następującymi oligonukleotydami: AB089 (34-mer) (Id Sekw nr 13) 5 'AAAACTGCAGAAAATGATTAAACTTCTATTTATC3' AB090 (35-mer) (Id Sekw nr 14) 5'ATAAGAATGCGGCCGCAAAGGCTAAACATTTGTTG3' w taki sposób, ze izolowano gen kodujący glikoproteinę gd wirusa CHV w postaci fragmentu PstI-NotI Po oczyszczeniu, produkt PCR o wielkości 1072 bp trawiono PstI i NotI w celu uwolnienia fragmentu PstI-NotI o wielkości 1049 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pvr1012 (przykład 7), trawiony uprzednio PstI i NotI, otrzymując plazmid pab038 (5930 bp) (figura 8) Przykład 15. Konstrukcja plazmidu pab017 (gen osp A Borrelia burgdorferi) Reakcję PCR przeprowadzono z genomowym DNA Borrelia burgdorferi (szczep B31) (S Bergstrom i in., Mol Microbiol 1989, 3, ), według techniki z przykładu 2, z następującymi oligonukleotydami:

12 AB038 (37-mer) (Id. Sekw. nr 15) 5'ACGCGTCGACTATGAAAAAATATTTATTGGGAATAGG3' AB039 (34-mer) (Id. Sekw. nr 16) 5'CGCGGATCCCTTATTTTAAAGCGTTTTTAATTTC3' w taki sposób, ze izolowano gen białko błonowe OspA w postaci fragmentu SalI- BamHI. Po oczyszczeniu, produkt PCR o wielkości 842 bp trawiono SalI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu SalI-BamHI o wielkości 829 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pvr1012 (przykład 7), trawiony uprzednio SalI i BamHI, otrzymując plazmid pab017 (5698 bp) (figura 9). Przykład 16 Konstrukcja plazmidu pab041 (gen G) Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA bydlęcego wirusa wścieklizny (szczep ERA) (A. Anilionis i in., Naturę, 1981, 294, ), przygotowano techniką według przykładu 4, z następującymi oligonukleotydam i- AB011 (33-mer) (Id. Sekw. nr 17) 5' AAAACTGCAGAGATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG3' AB012 (34-mer) (Id. Sekw. nr 18) 5 CGCGGATCCTCACAGTCTGGTCTCACCCCCACTC3' w taki sposób, ze amplifikowano fragment 1589 bp zawierający gen kodujący glikoproteinę G wirusa wścieklizny. Po oczyszczeniu, produkt RT-PCR trawiono PstI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu PstI-BamHI o wielkości 1578 bp Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pvr1012 (przykład 7), trawiony uprzednio PstI i BamHI, otrzymując plazmid pab041 (6437 bp) (figura 10) Przykład 17: Wytwarzanie i oczyszczanie plazmidów Do wytwarzania plazmidów przeznaczonych do szczepienia zwierząt, można zastosować dowolną technikę, która umożliwia otrzymanie zawiesiny oczyszczonych plazmidów, głównie w postaci super-skręconej. Techniki te znane są specjalistom. W szczególności można wymienić technikę lizy alkalicznej, a następnie dwa kolejne ultrawirowania na gradiencie chlorku cezu, w obecności bromku etydyny, jak to opisano w Sambrook i in., (Molecular Clomng A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Można również powołać zgłoszenie patentowe PCT WO 95/21250 i PCT WO 96/02658 opisujące metodę wytwarzania, na skalę przemysłową, plazmidów, które można zastosować do szczepienia. W celu wytwarzania szczepionek (patrz, przykład 17), oczyszczone plazmidy zawiesza się w celu otrzymania zawiesin o wysokim stężeniu (> 2 mg/ml), które są możliwe do przechowywania. W tym celu, plazmidy zawiesza się w ultraczystej wodzie albo w buforze TE (10 mm Tris; 1 mm EDTA, ph 8,0). Przykład 18 Wytwarzanie szczepionek skojarzonych Różne plazmidy konieczne do wytwarzania szczepionek skojarzonych miesza się wychodząc z ich stężonych roztworów (przykład 16). Mieszaniny wytwarza się w taki sposób, ze stężenie końcowe każdego z plazmidów odpowiada skutecznej dawce każdego z nich. Roztwory, które można zastosować do ustalenia stężenia końcowego szczepionki m ogą być roztworami 0,9% NaCl albo buforem PBS. Szczególnie formulacje takie jak liposomy lub kationowe lipidy można również wykorzystać w przygotowaniu szczepionek Przykład 19: Szczepienie psów. Psy szczepi się dawkami 10 µg, 50 µg albo 250 µg na plazmid Wstrzykiwanie można przeprowadzić igłą, drogą domięśniową. W tym przypadku objętość podawanej dawki szczepionki wynosi 1 albo 2 mi. Wstrzykiwanie można przeprowadzić igłą, drogą śródskórną. W tym przypadku dawki podawane są w całkowitej objętości 1 ml w dziesięciu punktach po 0,1 ml albo w 20 punktach po 0,05 ml. Wstrzyknięcia śródskórne przeprowadza się po ogoleniu skóry (bok klatki piersiowej) albo w okolicach nieowłosionych, na przykład na wewnętrznej stronie ud. Wtryskiwacz do wstrzyknięć płynu może być również wykorzystany do wstrzyknięć śródskórnych

13

14

15

16 Figura N 6 FiguraN 7

17 FiguraN 8 FiguraN 9

18 F ig u r a N 1 0 Figura N 1 Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz Cena 4,00 zł