(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR00/02051 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR00/02051 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO01/05934 PCT Gazette nr 04/01 (51) Int.Cl. C12N 15/86 ( ) C07K 14/08 ( ) C07K 14/535 ( ) (54) Geny kalciwirusów kotów i szczepionki, a zwłaszcza szczepionki zrekombinowane (30) Pierwszeństwo: ,FR,99/ ,FR,00/01761 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 17/03 (73) Uprawniony z patentu: MERIAL,Lyon,FR (72) Twórca(y) wynalazku: Jean-Christophe Francis Audonnet,Lyon,FR Philippe Guy Nicolas Baudu,Craponne,FR Sylvie Claudine Brunet,Lyon,FR (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/09 (74) Pełnomocnik: Agnieszka Żebrowska-Kucharzyk, Rzecznik Patentowy, Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Obecny wynalazek dotyczy genów konkretnych szczepów kalciwirusów kota, białek kodowanych przez te geny i ich zastosowania do przygotowania preparatów immunogennych i szczepionek zrekombinowanych lub z podjednostek, przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kotów. Te preparaty immunogenne i te szczepionki mogą być kombinowane z preparatami immunogennymi przygotowanymi na bazie innych patogennych czynników kota do uzyskania preparatów immunogennych i szczepionek multiwalencyjnych. Kalciwirusy kota (po angielsku Feline Calicivirus lub FCV) były opisane po raz pierwszy w 1957 r. (Fastier L.B. Am. J. Vet. Res ). Kalciwirusy kota są razem z wirusami opryszczki kota dwoma głównymi źródłami dolegliwości wirusowych górnych dróg oddechowych u kota. Wirusy FCV atakują dużą liczbę zwierząt, ze stopniem nosicielstwa FCV rzędu 15 do 25% i częstością występowania przeciwciał w surowicy przeciwko FCV od 70 do 100% (Coutts i wsp. Vet Rec ; Ellis T.M. Australian Vet. J ; Harbour i wsp. Vet. Rec ; Reubel i wsp. Feline Dendistry ). Po inicjalnej fazie hipertermii tym chorobom dróg oddechowych towarzyszą na ogół owrzodzenia w jamie ustnej (podniebienie, język, wargi, nos), katar, zapalenie spojówek, ewentualnie anoreksja i astenia. Wirusy FCV mogą też powodować zapalenia płuc, zapalenia otrzewnej i bóle w stawach (zespół kulenia). Przekaz wirusa FCV jest wyłącznie horyzontalny, nie ma transmisji pionowej od matki do jej potomka w czasie ciąży (Johnson R.P. Res. Vet. Sci ). Przekaz FCV zachodzi przez kontakt między zakażonymi zwierzętami i zwierzętami zdrowymi lub drogą powietrzną w czasie kichania (Wardley RC. Arch. Virol ). Kalciwirusy kota są nagimi wirusami z rodziny Calciviridae, posiadają jednoniciowy dodatni RNA o wielkości około 7,7 kilopar zasad (kbp) (Carter M. J. Arch. Virol ). Podobnie jak dla wielu wirusów RNA istnieje wielka heterogenność w populacji wirusów FCV. Warianty antygenowe, wykazane na początku lat 70-tych przez doświadczenia nad seroneutralizacją krzyżową pozwoliły na klasyfikację FCV na kilka szczepów wirusa lub quasi-gatunków (Radfoord i wsp. Proc. 1 st Symp. Caliciviruses ESVV ). Zidentyfikowano i zsekwencjonowano szereg szczepów FCV, w szczególności szczep F9 (Carter i wsp. Arch. Virol , sekwencja zdeponowana w bazie danych GenBank pod numerem dostępu M86379), CFI (Neill i wsp. J. Virol , numer dostępu GenBank U13992 i M32819), Urbana lub URB (Sosnovtsev i Green Virology , numer dostępu GenBank L40021), F4 (Tohya i wsp. Arch. Virol , numery dostępu GenBank D31836 i D90357), KCD (Fastier L.B. Am. J. Vet. Res , numer dostępu GenBank L09719), LLK (numer dostępu GenBank U07131), NADC (numer dostępu GenBank L09718), 2280 (numer dostępu GenBank X99445) i 255 (Kahn i Gillepsie. Cornell Vet. 1970, , numer dostępu GenBank U07130). Szczepienia przeciwko FCV zostały wprowadzone od końca lat 70-tych na podstawie atenuowanych szczepów FCV, przede wszystkim szczepu F9 izolowanego w USA w 1958 r. przez Bittle'a (Bittle i wsp., Am. J. Vet. Res ) lub szczepów wyprowadzonych z F9 przez pasaże in vitro lub in vivo ( podobne do F9"). Dostępne są też szczepionki inaktywowane. Stosują przede wszystkim szczep 255 i 2280, wyizolowany w 1970 z kota wykazującego zapalenie płuc (Kahn i Gillepsie. Cornell Vet ) i w 1983 z kota cierpiącego na kulenie (Pedersen i wsp. Fel. Prac ). Odpowiedź humoralna jest przede wszystkim nakierowana przeciwko białku kapsydu, także nazywanego p65 (Guiver i wsp. J. Gen. Virol ). Geny kodujące białka kapsydu wielu kalciwirusów kota były sklonowane i porównane bez wyróżniania bardziej szczegółowo jakichś sekwencji (Glenn i wsp. Proc. 1 st Int. Symp. Caliciviruses ESVV ; Geissler i wsp. Virus Res ; Neill i wsp. Proc. 1 st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997, ). Gen kodujący białko kapsydu był także sklonowany i wyrażany w różnych systemach ekspresyjnych, w szczególności gen kodujący białko kapsydu wirusa FCV KS20 w plazmidach (Geissler i wsp. J. Virol ), geny kodujące białka kapsydu wirusa FCV CFI-68, JOK63, JOK92, LS012 i F9 w bakulowirusach (DeSilver i wsp. Proc. 1 st Int. Symp. Caliciviruses ESVV ), gen kodujący białko kapsydu wirusa FCV F4 w wirusie opryszczki kota typu 1 (Yokoyama i wsp. J. Vet. Med. Sci ).

3 PL B1 3 Ze względu na zmianę antygenów w czasie, antysurowice produkowane przeciwko szczepom szczepionkowym wyizolowanym w latach 60-70, takim jak szczepy F9, 255 lub 2280 neutralizują zaledwie niewiele izolatów z lat 90. Na przykład, surowica anty-f9 neutralizuje 43% izolatów amerykańskich okresu , w stosunku do 56% dla okresu i 86% dla okresu i tylko 10% izolatów angielskich okresu (Lauritzen i wsp. Vet. Microbiol ). Celem obecnego wynalazku jest wykazanie nowych szczepów FCV indukujących u kota przeciwciała mające szerokie spektrum krzyżowej neutralizacji. Innym celem wynalazku jest opracowanie preparatów immunogennych i szczepionek przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kotów na podstawie szczepów FCV. Szczególnym celem wynalazku jest na podstawie wybranych szczepów izolacja i charakterystyka genów kodujących białka immunogenne do stosowana w szczepieniu przeciw chorobom powodowanych przez kalciwirusy u kotów. Innym celem wynalazku jest zaproponowanie wektorów ekspresyjnych in vitro i in vivo zrekombinowanych i wyrażających przynajmniej jedną taką sekwencję nukleotydów. Innym celem wynalazku jest zaproponowanie preparatów immunogennych lub szczepionek multiwalencyjnych przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota. Jeszcze innym celem wynalazku jest zaproponowanie preparatów immunogennych lub szczepionek multiwalencyjnych przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota i przynajmniej jednemu innemu patogenowi kota. Wynalazek dotyczy zasadniczo dwóch szczepów FCV uzyskanych za pomocą wymazów z gardła przeprowadzonych we Francji i Królestwie Zjednoczonym na kotach prezentujących objawy zakażenia przez kalciwirusy kota. Chodzi odpowiednio o szczep G1 (zdeponowany w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (lub CNCM) Instytutu Pasteura, Paryż, Francja, pod numerem dostępu I-2167) i szczep 431 (zdeponowany w CNCM pod numerem dostępu I-2166), oba zdeponowane 12 marca Ten szczep FCV G1 wyizolowany we Francji nie odpowiada szczepowi FCV wyizolowanemu w Zjednoczonym Królestwie w 1978 roku przez Tohya (Tohya Y. i wsp., Jpn. J. Sci., , ) i także nazwany G1. Wybór szczepów FCV 431 i G1 został przeprowadzony poprzez testy seroneutralizacji krzyżowej w stosunku do izolatów FCV z panelu referencyjnego. Ten panel referencyjny jest złożony z 18 aktualnych izolatów FCV pobranych od kotów wykazujących objawy zakażenia przez kalciwirusy kota i pochodzących z trzech różnych obszarów geograficznych. 7 izolatów jest amerykańskich, te izolaty zostały zidentyfikowane jako RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 i RMI9. 7 izolatów jest francuskich, są określane jako A2, F1, G1, G3, E3031, H3-2 i H ostatnie izolaty są angielskie i są określane jako 431, 388b, 337 i J5. Szczepy panelu dostępne u deponującego na żądanie. Były one także publikowane w artykule w czasopiśmie Archives of Virology" (Poulet i wsp. Arch. Virol. luty (2) ), dostępny w Internecie w dacie zdeponowania u wydawcy. W czasie testów seroneutralizacji krzyżowej między 18 izolatami FCV panelu referencyjnego, okazało się w sposób zadziwiający, że surowica przeciw izolatowi 431 neutralizuje 14 z 17 heterologicznych izolatów panelu referencyjnego (miano homologiczne seroneutralizacji nie jest uwzględniane). Dla porównania anty-surowice szczepów szczepionkowych" 255 i F9 neutralizują każdy tylko 2 z 18 izolatów panelu. W sposób nieoczekiwany deponujący znalazł więc ze szczepem FCV 431 szczep dominujący, który może być stosowany do ochrony kotowatych i w szczególności kotów przeciwko większości szczepów FCV. Dzięki panelowi szczepów FCV tu ujawnionych jest możliwe dla specjalisty wybranie innych dominujących szczepów FCV. Przez równoważność wynalazek obejmuje także poprzez szczep FCV 431 szczepy FCV ekwiwalentne w stosunku do tego ostatniego, mające przeciwciała o szerokim spektrum neutralizacji krzyżowej. Istnieje równoważność gdy surowica przeciwko szczepowi FCV seroneutralizuje przynajmniej 13 z 18 izolatów heterologicznych panelu referencyjnego (to znaczy obejmując FCV 431) korzystnie gdy seroneutralizuje przynajmniej 14 z 18 izolatów heterologicznych panelu referencyjnego, a korzystniej gdy seroneutralizuje przynajmniej 15 z 18 izolatów heterologicznych panelu referencyjnego. Uważa się ogólnie, że szczep FCV seroneutralizuje inny szczep FCV, gdy miano heterologiczne seroneutralizacji jest większe lub równe 1,2 log 10 VN 50 (Povey C. i Ingersoll J., Infection and Immunity, 1975, 11, ). Deponujący uznał tę wartość jak próg dodatniości. Jednak wyniki seroneutralizacji

4 4 PL B1 krzyżowej uzyskane przez izolat FCV mający miano homologiczne seroneutralizacji poniżej lub równe 2 log 10 VN 50 nie mogą być interpretowane. Drugą metodą do ustalenia ekwiwalencji szczepu FCV w stosunku do szczepu FCV 431 jest stosowanie przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla szczepu FCV 431 i testowanie za pomocą pośredniej immunofluorescencji (IFI) szczepu FCV kandydata. Deponującemu udało się w ten sposób wyprodukowanie kilku przeciwciał monoklonalnych, które okazały się specyficzne dla szczepu 431. Jedno z nich nazwano 44. Istnieje równoważność jeśli jest reaktywność immunofluorescencji z przeciwciałami monklonalnymi specyficznymi dla 431, na przykład, z przeciwciałem monoklonalnym 44. To przeciwciało monoklonalne i odpowiednia hybrydoma są dostępne u deponującego na żądanie i są także ujawnione w artykule Poulet i wsp. Odpowiednia hybrydoma była także deponowana 11 sierpnia 1999 roku w CNCM pod numerem dostępu I Jest jednak ewidentne, że specjalista jest w stanie produkować przeciwciała monoklonalne za pomocą technik klasycznych i selekcjonować, w stosunku do panelu, te które są specyficzne względem szczepu 431. Drugi szczep FCV G1 wybrano ze względu na jego komplementarność w stosunku do szczepu FCV 431, jako że kombinacja anty-surowic przeciwko 431 i G1 seroneutralizuje 100% izolatów panelu referencyjnego, to znaczy, że te trzy szczepy FCV G1 mają oznaczone miano seroneutralizacji wyższe lub równe 2 log 10 VN 50 względem izolatów FCV panelu referencyjnego, przeciwko którym antysurowica 431 nie seroneutralizuje lub robi to słabo (wartość niższa od 1,2 log 10 VN 50 ). Wynalazek obejmuje także ekwiwalentne szczepy FCV mające tę samą komplementarność względem szczepu FCV 431. Można także wyprodukować i selekcjonować przeciwciała monoklonalne specyficzne względem tego szczepu, co pozwala następnie na określenie ekwiwalentów na tej innej podstawie. Deponującemu poza tym udało się wyizolować, scharakteryzować oraz zsekwencjonować gen kapsydu FCV 431 i FCV G1, białka kapsydu i określić sekwencje odpowiednich cdna (komplementarnych cdna). Celem wynalazku jest więc fragment kwasu nukleinowego zawierający całą lub część sekwencji kodującej białko kapsydu wirusa 431, którego sekwencja aminokwasów jest reprezentowana na SEQ ID N : 7 na fig. 2, lub fragment immunologicznie czynny tego białka, to znaczy epitop, peptyd lub polipeptyd zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kapsydu. Celem wynalazku jest w szczególności fragment DNA zawierający sekwencję cdna SEQ ID N : 6 lub fragment zachowujący istotne właściwości całej sekwencji, to znaczy kodujący peptyd, polipeptyd lub epitop zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kapsydu. Celem wynalazku jest szczególnie fragment DNA zawierający tę sekwencję cdna w szczególności połączoną z elementami regulacji transkrypcji. Jest ewidentne, że wynalazek obejmuje automatycznie fragmenty kwasu nukleinowego, fragmenty DNA i sekwencje ekwiwalentnych cdna, to znaczy fragmenty sekwencji nukleotydów specyficznych kapsydu FCV nie zmieniających specyficzności ani funkcjonalności szczepu o sekwencji opisanej lub polipeptydów kodowanych przez tę sekwencję. Oczywiście będą włączone sekwencje, które różnią się ze względu na degenerację kodu. Wynalazek obejmuje także automatycznie sekwencje nukleotydów (RNA, DNA, cdna) ekwiwalentne w tym znaczeniu, że kodują białko kapsydu FCV, lub peptyd, polipeptyd lub epitop specyficzny dla białka kapsydu FCV, zdolny do indukcji in vivo u gatunku kotowatych, w szczególności u kota, przeciwciał mających zasadniczo to samo spektrum krzyżowego zobojętnienia jak anty-surowica szczepu FCV 431. Chodzi w szczególności o sekwencji pochodzące od szczepów FCV ekwiwalentnych według definicji danej powyżej względem panelu lub przeciwciała monoklonalnego 44. Celem wynalazku jest też fragment kwasu nukleinowego zawierający całą lub część sekwencji nukleotydów kodujących białka kapsydu wirusa G1 taka jak przedstawiona jako SEQ ID N : 5 lub na fig. 1, lub immunologicznie czynny składnik tego białka, to znaczy epitop, peptyd lub polipeptyd zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kapsydu. Celem wynalazku jest mianowicie fragment DNA zawierający sekwencję cdna SEQ ID N : 4 lub fragment zachowujący niezbędne właściwości całej sekwencji, to znaczy kodujący peptyd, polipeptyd lub epitop zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kapsydu. Celem wynalazku jest w szczególności fragment DNA zawierający tę sekwencję cdna, w szczególności połączoną z elementami regulacji transkrypcji. Jest oczywiste, że wynalazek obejmuje automatycznie fragmenty kwasu nukleinowego, ekwiwalentne fragmenty DNA i sekwencje cdna, to znaczy fragmenty i sekwencje nukleotydów nie zmieniające funkcjonalności ani specyficzności szczepu o opisanej sekwen-

5 PL B1 5 cji lub polipeptydów kodowanych przez tę sekwencję. Oczywiście będą włączone sekwencje, które różnią się ze względu na degenerację kodu. Wynalazek obejmuje także automatycznie sekwencje nukleotydów (RNA, DNA, cdna) ekwiwalentne w tym znaczeniu, że kodują peptyd, polipeptyd lub epitop zdolny do indukcji in vivo u gatunku kotowatych, w szczególności u kota, przeciwciał mających zasadniczo to samo spektrum krzyżowego zobojętnienia jak anty-surowica szczepu FCV G1. Chodzi w szczególności o sekwencje nukleotydów pochodzące od szczepów FCV komplementarnych w znaczeniu podanym powyżej. Gen kodujący białko kapsydu wirusów FCV G1 i FCV 431 ma wielkość 2007 nukleotydów dla FCV 431 i 2010 nukleotydów dla FCV G1. Białko kapsydu ma wielkość 668 aminokwasów dla FCV 431 i 669 aminokwasów dla FCV G1 i masę kda (białko p65). Celem wynalazku jest też wektor ekspresyjny zawierający przynajmniej jeden fragment DNA według wynalazku, w szczególności cdna typu 431 lub cdna typu G1 w warunkach pozwalających na jego ekspresję in vivo. Według szczególnego wykonania, wektor ekspresyjny zawiera cdna typu 431 i cdna typu G1. Przez typ'" należy rozumieć, że cdna jest komplementarny do sekwencji RNA rozważanego szczepu. Te wektory ekspresyjne mogą być wirusami ospy, na przykład, wirusami krowianki, wirusami ptasimi (ospa kanarka, ospa ptasia), obejmując wirusy ospy specyficzne gatunkowo (ospa świni, ospa szopa i ospa wielbłąda), adenowirusy i wirusy opryszczki, takie jak wirusy opryszczki kota (np. FR-A ). Dla wirusów ospy, specjalista może odnieść się do WO-A , WO-A , WO-A i WO-A Można stosować szereg strategii wstawiania w celu uzyskania ekspresji kilku heterologicznych sekwencji nukleotydów wychodząc z tego samego wektora ekspresji in vivo. Te strategie wstawiania są to mianowicie stosowanie podwójnej kasety ekspresyjnej mającej przeciwną orientację, lub stosowanie podwójnej kasety ekspresyjnej mającej identyczną orientację, lub jeszcze wielokrotnej kasety ekspresyjnej z elementem "IRES" (wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu, po angielsku, Internal Ribosome Entry Site) umieszczonym między każdą wstawką (patent EP-A ). Sekwencje nukleotydów heterologicznych są wstawione pod kontrolą sygnałów regulacyjnych transkrypcji i w szczególności promotorów, korzystnie wniesionych w czasie insercji. Nie jest jednak wykluczone spowodowanie ekspresji tych sekwencji pod kontrolą własnych sygnałów stosowanego wektora ekspresyjnego. Wśród wektorów ekspresji ospy kanarka jednym z korzystnych promotorów jest promotor krowianki H6 (Taylor J. i wsp. Vaccine, 1988, 6, ; Guo P. i wsp. J. Virol., 63, ; Perkus M. i wsp. J. Virol., 1989, 63, ). Wektory do ekspresji in vivo mogą być także plazmidami. Określenie plazmid ma obejmować całą jednostkę transkrypcji DNA w formie sekwencji polinukleotydowej zawierającej sekwencją cdna według wynalazku i elementy niezbędne do jej ekspresji in vivo. Korzystna jest forma plazmidu kolistego, superzwinięta lub nie. Forma liniowa także wchodzi w zakres wynalazku. Każdy plazmid zawiera promotor zdolny do zapewnienia, w komórkach gospodarza, ekspresji cdna wstawionego pod jego kontrolę. Chodzi na ogół o silny promotor eukariotyczny i w szczególności promotor wczesny wirusa cytomegalii CMV-IE, pochodzący z myszy lub ludzki lub też o innym pochodzeniu takim jak szczur, świnka morska. W bardziej ogólny sposób promotor jest albo pochodzenia wirusowego albo pochodzenia komórkowego. Jako promotor wirusowy inny niż CMV-IE można podać wczesny lub późny promotor wirusa SV40 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Jako promotor komórkowy można podać promotor genu cytoszkieletu, taki jak na przykład promotor desminy lub jeszcze promotor aktyny. Podfragment tych promotorów, zachowujących tę samą aktywność promotora jest zawarty w tym wynalazku, np. obcięte promotory CMV-IE według WO-A-98/ Gdy szereg sekwencji heterologicznych (cdna i/lub geny FCV lub innych patogenów kota) jest obecnych w tym samym plazmidzie mogą one być prezentowane w tej samej jednostce transkrypcji lub w dwóch różnych jednostkach. Plazmidy mogą także zawierać inne elementy regulacji transkrypcji takie jak na przykład sekwencje stabilizujące typu intron, korzystnie intron II genu β-globiny królika (van Ooyen i wsp., Science, 1979, 206: ), sekwencji sygnałowej białka kodowanego przez gen tkankowego aktywatora plazminogenu (tpa; Montgomery i wsp. Cell. Mol. Biol. 1997, 43: ) i sygnał poliadenylacji (polia), w szczególności genu bydlęcego hormonu wzrostu (bgh) (US-A ) lub genu β-globiny królika. Celem wynalazku jest także stosowanie cdna według wynalazku do produkcji in vitro białek kapsydu lub ich fragmentów i epitopów czynnych immunologicznie i ich włączenie do preparatów immunogennych i szczepionek podjednostkowych.

6 6 PL B1 Celem wynalazku jest także preparat immunogenny lub szczepionka przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota zawierająca przynajmniej jeden wektor do ekspresji in vivo zrekombinowany według wynalazku i nośnik lub zaróbkę dopuszczalne w weterynarii i ewentualnie adiuwant. Pojęcie preparatu immunogennego obejmuje każdy preparat mogący po podaniu kotu indukować przynajmniej odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko pożądanemu patogenowi kota. Przez szczepionkę rozumie się preparat zdolny do indukowania skutecznej ochrony. Korzystnie ten preparat immunogenny lub szczepionka zawiera wektor do ekspresji in vivo do którego jest wstawiony cdna typu FCV 431, co obejmuje jego ekwiwalenty lub cdna FCV G1, co obejmuje jego ekwiwalenty. Według pierwszego bardzo korzystnego wykonania ten preparat immunogenny lub szczepionka zawiera wektor ekspresyjny do którego jest wstawiony cdna typu FCV 431, co obejmuje jego ekwiwalenty lub cdna FCV G1, co obejmuje ekwiwalenty tego ostatniego. Według drugiego bardzo korzystnego wykonania ten preparat immunogenny lub szczepionka zawiera przynajmniej dwa wektory ekspresyjne; do pierwszego jest wstawiony cdna typu FCV 431, co obejmuje jego ekwiwalenty, a do drugiego cdna FCV G1, co obejmuje ekwiwalenty tego ostatniego. Aby dodawać adiuwanty do preparatów i szczepionek według wynalazku można stosować dowolny adiuwant znany specjaliście. Jednak korzystne jest formułowanie ich albo w postaci emulsji olej-w-wodzie albo dodać do nich polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego lub kopolimery bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej, lub lipid kationowy zawierający sól czwartorzędowego amonu. Wśród polimerów korzystne są polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego usieciowane za pomocą eterów polialkenylowych cukrów lub polialkoholi. Te związki są znane jako karbomer (Pharmeuropa tom 8, nr 2, czerwiec 1996). Specjalista może też odnieść się do US-A (podany dla odniesienia) opisującego takie polimery akrylowe usieciowane przez związek polihydroksylowy mający przynajmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż 8, atomy wodorów przynajmniej trzech hydroksyli są zastąpione przez nienasycone reszty alifatyczne mające przynajmniej 2 atomy węgla. Korzystne reszty są to te zawierające 2 do 4 atomów węgla, np. winyle, allile i inne nienasycone grupy etylenowe. Reszty nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA) są szczególnie odpowiednie, są one usieciowane przez allil sacharozy lub za pomocą allilopentaerytiritolu. Wśród nich można podać Carbopol 974P, 934P oraz 971P. Wśród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylu, korzystne są EMA (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowymi lub usieciowanymi, na przykład, usieciowanymi przez diwinyloeter. Można odnieść się do J. Fields i wsp. Nature 186: , 4 czerwca 1960 roku (podany dla odniesienia). Pod kątem ich budowy polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego i EMA są tworzone korzystnie z motywów podstawowych o następującym wzorze: gdzie - R 1 i R 2 takie same lub różne reprezentują H lub CH 3 - x = 0 lub 1, korzystnie x = 1 - y = 1 lub 2 i x + y = 2. Dla EMA x = 0 i y = 2. Dla karbomerów x = y = 1. Te polimery rozpuszcza się w wodzie lub w soli fizjologicznej (NaCl 20 g/l) i ph doprowadza się do 7,3-7,4 za pomocą wodorotlenku sodu, aby dać roztwór adiuwantu, do którego będzie włączony wektor ekspresyjny lub podjednostki. Stężenie polimeru w końcowej kompozycji szczepionki będzie od 0,01% do 1,5% masa/obj., bardziej korzystnie od 0,05 do 1% masa/obj., najbardziej korzystnie od 0,1 do 0,4% masa/obj.

7 PL B1 7 Lipidy kationowe zawierający czwartorzędowe sole amonu, które są szczególnie ale nie wyłącznie dostosowane do wektorów ekspresji plazmidowej odpowiadają wzorowi: w którym R 1 jest liniową resztą alifatyczną nasyconą lub nienasyconą, mającą 12 do 18 atomów węgla, R 2 jest inną resztą alifatyczną zawierającą 2 do 3 atomów węgla i X grupą hydroksylową lub aminową. Korzystnie chodzi o DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanamon; WO-A ), korzystnie zasocjowane z obojętnym lipidem, w szczególności DOPE (dioleilo-fosfatydylo-etanolamina), aby tworzyć DMRIE-DOPE. Korzystnie mieszaninę plazmidu z tym adiuwantem przyrządza się bezpośrednio przed użyciem i jest korzystne przed jego podaniem zwierzęciu danie czasu tak przygotowanej mieszaninie aby uległa skompleksowaniu, na przykład, w czasie od 10 do 60 minut, a zwłaszcza rzędu 30 minut. O ile DOPE jest obecny stosunek molarny DMRIE:DOPE jest korzystnie od 95:5 do 5:95, bardziej korzystnie 1:1. Stosunek wagowy plazmid:adiuwant DMRIE lub DMRIE-DOPE może mianowicie być od 50:1 do 1:10, szczególnie od 10:1 do 1:5, korzystnie od 1:1 do 1:2. Wektory do ekspresji in vivo kodujące cdna typu FCV według wynalazku mogą także kodować GM-CSF kota lub być połączone z drugim wektorem kodującym GM-CSF kota (np. plazmidy pjp089 i pjp090, odpowiednio fig. 5 i fig. 6). W przypadku plazmidów korzystna jest mieszanina dwóch plazmidów. W przypadku wektorów wirusowych korzystny jest pojedynczy wektor. Do tego wektora ekspresyjnego lub tej mieszaniny wektorów ekspresyjnych można także dodać adiuwant jak opisano uprzednio. Celem wynalazku jest także preparat immunogenny multiwalencyjny lub szczepionka multiwalencyjna przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota i przynajmniej jednemu innemu patogenowi kota, stosujący ten sam zrekombinowany wektor do ekspresji in vivo zawierający i wyrażający przynajmniej jeden cdna typu FCV według wynalazku i przynajmniej jedną sekwencję nukleotydów immunogenu innego patogenu kota lub fragmentu immunologicznie czynnego tego immunogenu. Celem wynalazku jest także preparat immunogenny multiwalencyjny lub szczepionka multiwalencyjna zawierający przynajmniej jeden wektor do ekspresji in vivo do którego jest wstawiony przynajmniej jeden cdna typu FCV według wynalazku i przynajmniej drugi wektor ekspresyjny, do którego jest wstawiona sekwencja kodująca immunogen lub fragment immunologicznie czynny innego patogenu kota, mogą to być, na przykład, te opisane w przykładach 7 do 15 i 17 do 19 zgłoszenia patentowego według publikacji WO-A (ppb179, ppb180, ppb181, pab009, pab053, pab052, pab056, pab058, pab029, pab030, pab083,pab041). Szczepionki zrekombinowane monowalencyjne lub multiwalencyjne takie jak opisano uprzednio mogą być także połączone z przynajmniej jedną szczepionką klasyczną (inaktywowaną, żywą atenuowaną, podjednostki) skierowaną przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi kota takiemu samemu lub innemu. Te inne patogeny kota są w szczególności wybrane z grupy złożonej z wirusa zapalenia nosa i tchawicy kota lub wirusa opryszczki kota (FHV), wirusa białaczki kota (FeLV), parwowirusów kota (FPV), wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kota (FIPV), wirusa niedoboru odporności kota (FIV), wirusa wścieklizny, Chlamydia. Celem wynalazku są też izolowane białka kapsydów oczyszczone lub syntetyczne szczepu FCV431 i szczepu FCV G1 mające sekwencję aminokwasów odpowiednio przedstawione w SEQ ID N : 7 i SEQ ID N : 5. Obejmuje to automatycznie ekwiwalentne białka, to znaczy pochodzące od szczepów ekwiwalentnych do szczepów FCV 431 i FCV G1 według definicji podanych powyżej (na podstawie panelu i/lub przeciwciała monoklonalnego w szczególności przeciwciała monoklonalnego 44). Korzystnie te białka kapsydu mogą być zmontowane w postaci pustych kapsydów.

8 8 PL B1 Celem wynalazku są także fragmenty i epitopy (przynajmniej około 8 do 10 aminokwasów) tych białek, które zachowują specyficzność i immungenność całego białka. Białka kapsydu, ewentualnie zmontowane w postaci pustych kapsydów i ich fragmenty i epitopy mogą być produkowane za pomocą ekspresji in vitro. Odpowiednia sekwencja nukleotydów jest wstawiona do systemu ekspresji in vitro i wyrażana przez ten system i zebrany produkt ekspresji się w końcu oczyszcza znanymi sposobami. System ekspresji może być pochodzenia wirusowego, w szczególności z bakulowirusa (US- -A ). Integruje się sekwencję kodującą lub fragment (w przypadku epitopu lub fragmentu) do genomu bakulowirusa (np. bakulowirus Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV - wirus polihedrozy jądrowej) i ten ostatni następnie namnaża się, w szczególności na komórkach owadów, np. Spodoptera frugiperda S19 (depozyt ATCC CRL 1711). System ekspresji in vitro może być pochodzenia prokariotycznego np. Escherichia coli lub eukariotycznego, w szczególności z drożdży, np. Saccharomyces cerevisiae lub komórek eukariotycznych ssaków, w szczególności linii komórkowych takich jak CHO (komórki jajnika chomika), HeLa, BHK lub komórki owadów np. Spodoptera frugiperda (powyżej) lub też komórki kota. Jako promotory do stosowania w tych komórkowych konstruktach można podać silne promotory wirusowe, takie jak wirusa SV40 (Fiers i wsp., Nature, (1978) 273: 113) i promotor wczesny (CMV-IE) wirusa CMV lub cytomegalowirusa ludzkiego (McGregor i Caskey, Nucleic Acids Res. 17: 2365, 1989), mysiego lub innego pochodzenia, lub jeszcze genu polihedryny bakulowirusa AcNPV (Hooft van Iddekinge i wsp., 1983, Virology 131: ). Specjalista wie jak oczyszczać i/lub izolować białka, zmontowane lub nie w postaci pustych kapsydów, ich fragmenty i epitopy wychodząc z produktu i technik opisanych powyżej. Jako przykład można przypomnieć, że specjalista dysponuje różnymi metodami, które obejmują w szczególności precypitację opartą na rozpuszczalności interesujących białek, fragmentów i epitopów w zależności od soli obecnych w środowisku, strącanie rozpuszczalnikami organicznymi, polimerami i innymi związkami, strącanie powinowactwa i wybiórcza denaturacja, chromatografię kolumnowe, w tym chromatografię cieczową wysokowydajną (HPLC), chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, chromatografię immunopowinowactwa, chromatografię stosującą ligandy, immunoprecyypitację, sączenie na żelu, elektroforezę, sposoby sączenia w szczególności ultrasączenie i ultrawirowanie w gradiencie. Specjalista może się odnieść przykładowo do K.Y. Green i wsp. J. Clin. Microb., lipiec 1997, tom 35, 7: dla produkcji kapsydów w bakulowirusie namnażanym na komórkach Sf9 i zebranych za pomocą ultrawirowania na gradientach sacharozy (10 do 50%). Białka kapsydu, ich fragmenty i epitopy mogą także być produkowane za pomocą syntezy chemicznej sposobami, którymi dysponuje specjalista. Celem wynalazku są też preparaty immunogenne lub szczepionki zawierające przynajmniej jeden antygen podjednostkowy złożony z białka kapsydu, korzystnie montowanego w postaci kapsydów pustych FCV 431 i/lub FCV G1 lub odpowiedni fragment epitopu, w nośniku lub zaróbce akceptowalnych w weterynarii, i korzystnie adiuwant. Korzystnie preparat i szczepionki według wynalazku zawierają antygeny podjednostkowe pochodzące z dwóch szczepów FCV 431 i FCV G1. Także preparaty i szczepionki mogą zawierać białka kapsydu nie montowane i białka zmontowane w postaci pustych kapsydów. Aby dodać adiuwanty do preparatów immunogennych i szczepionek według wynalazku, można jako adiuwant stosować (1) wodorotlenek glinu, (2) polimer kwasu akrylowego lub metakrylowego, polimer bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenyiowej, lub (3) formułować preparat immunogenny lub szczepionkę w formie emulsji olej-w-wodzie i w szczególności emulsji SPT opisanej str. 147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" red. M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, i emulsji MF59 opisanej na str. 183 tej samej publikacji. Emulsja olej-w-wodzie może być mianowicie na bazie płynnego lekkiego oleju parafinowego (typ Farmakopeia europejska); oleju izoprenoidowego takiego jak skwalan, skwalen; oleju będącego wynikiem oligomeryzacji alkenów, w szczególności izobutenu lub decenu; estrów kwasów lub alkoholi z liniowym ugrupowaniem alkoholowym, bardziej szczególnie olei roślinnych, oleinianu etylu, di(kaprylanu/kapranu) glikolu propylenowego, tri(kaprylanu/kapranu) glicerolu, dioleinianu glikolu propylenowego; estrów kwasów lub alkoholi tłuszczowych rozgałęzionych, w szczególności estrów kwasu izostearowego. Olej jest stosowany w połączeniu z emulgatorami aby wytworzyć emulsję. Emulgatory są korzystnie środkami powierzchniowo czynnymi niejonowymi w szczególności estrami sorbitanu,

9 PL B1 9 mannidu, glicerolu, poliglicerolu, glikolu polipropylenowego i kwasu olejowego, izostearynowego, rycynoolejowego, hydroksystearynowego, ewentualnie etoksylowane, bloki kopolimerów polioksypropylen-polioksyetylen w szczególności Pluronic, w szczególności L121. Celem wynalazku są także preparaty immunogenne i szczepionki multiwalencyjne, w których walencja FCV jest walencją podjednostkową jak opisano powyżej. Celem tego wynalazku jest też sposób immunizacji kotów przeciwko chorobom powodowanych przez kalciwirusy. Sposób ten obejmuje podanie preparatu immunologicznego lub szczepionki według wynalazku kotom. To podanie może być zrobione w szczególności na drodze pozajelitowej, przez podanie podskórne, doskórne, domięśniowe, dootrzewnowe. Korzystnie podanie odbywa się na drodze podskórnej lub domięśniowej. Różne sposoby podania mogą być stosowane dla preparatów immunogennych i szczepionek plazmidowych w szczególności cząsteczki złota otoczone DNA i wystrzeliwane tak by wnikały do komórek skóry immunizowanego osobnika (Tang i wsp. Nature ) i iniektory z strumieniem cieczy pozwalające na transfekcję naraz komórek skóry i komórek znajdujących się pod nimi (Furth i wsp. Analytical Bioch ). Specjalista posiada kompetencje potrzebne do definiowania precyzyjnie liczby zastrzyków i dawek każdej szczepionki do stosowania dla każdego protokołu szczepienia. Wynalazek będzie obecnie opisany bardziej szczegółowo za pomocą sposobów wykonania użytych jako przykłady nie ograniczające odnoszące się do rysunków, w których: fig. 1 - Sekwencja cdna i białka "kapsydu" szczepu FCV G1; fig. 2 - Sekwencja cdna i białka "kapsydu" szczepu FCV 431; fig. 3 - Mapa restrykcyjna plazmidu pjca151; fig. 4 - Sekwencja regionu C6L wirusa ospy kanarka (szczep ALVAC); fig. 5 - Mapa restrykcyjna plazmidu pjp089; fig. 6 - Sekwencja genu GM-CSF kota 3R3; fig. 7 - Mapa restrykcyjna plazmidu pjp090; fig. 8 - Sekwencja genu GM-CSF kota 3R4; a fig. 9 - Tablica mian krzyżowej seroneutralizacji. Lista sekwencji do konstruktów tego wynalazku SEQ ID N : 1: Oligonukleotyd PB331 SEQ ID N : 2: Oligonukleotyd PB333 SEQ ID N : 3: Oligonukleotyd PB332 SEQ ID N : 4: Sekwencja cdna kapsydu FCV G1 SEQ ID N : 5: Sekwencja białka kapsydu FCV G1 SEQ ID N : 6: Sekwencja cdna kapsydu FCV 431 SEQ ID N : 7: Sekwencja białka kapsydu FCV 431 SEQ ID N : 8: Oligonukleotyd JCA289 SEQ ID N : 9: Oligonukleotyd JCA290 SEQ ID N : 10: Sekwencja regionu C6L wirusa ospy kanarka (szczep ALVAC) SEQ ID N : 11: Oligonukleotyd C6A1 SEQ ID N : 12: Oligonukleotyd C6B1 SEQ ID N : 13: Oligonukleotyd C6C1 SEQ ID N : 14: Oligonukleotyd C6D1 SEQ ID N : 15: Oligonukleotyd JCA291 SEQ ID N : 16: Oligonukleotyd JCA292 SEQ ID N : 17: Oligonukleotyd JCA293 SEQ ID N : 18: Oligonukleotyd JCA294 SEQ ID N : 19: Oligonukleotyd JCA295 SEQ ID N : 20: Oligonukleotyd JP578 SEQ ID N : 21: Oligonukleotyd JP579 SEQ ID N : 22: Sekwencja genu GM-CSF kota 3R3 SEQ ID N : 23: Sekwencja genu GM-CSF kota 3R4 P r z y k ł a d y: Wszystkie konstrukty plazmidów przeprowadzono stosując standardowe techniki biologii molekularnej (klonowanie, trawienie enzymami restrykcyjnymi, synteza komplementarnego DNA jednoniciowego, amplifikacja łańcuchowa z polimerazą, wydłużanie oligonukleotydu przez polimerazę DNA...) opisane przez Sambrook J. i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989). Wszystkie fragmenty restrykcyjne stosowane

10 10 PL B1 do tego wynalazku jak i różne fragmenty amplifikowane za pomocą amplifikacji łańcuchowej polimerazy (=ACP lub PCR) wyizolowano za pomocą zestawu "Geneclean7" (BIO101 Inc., La Jolla, CA). P r z y k ł a d 1: Izolaty i hodowla kalciwirusów kota G1 i 431 Źródła kalciwirusa kota określonego jako G1 uzyskano z pobrania we Francji od kota prezentującego objawy zakażenia przez kalciwirusy kota. Ten szczep FCV G1 zdeponowano 12 marca 1999 roku w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (czyli CNCM) Instytutu Pasteura, Paryż, Francja pod numerem dostępu I Szczep kalciwirusa kota określony jako 431 uzyskano z pobrania w Anglii od kota prezentującego objawy zakażenia przez kalciwirusy kota. Ten szczep FCV 431 zdeponowano 12 marca 1999 roku w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (czyli CNCM) Instytutu Pasteura, Paryż, Francja pod numerem dostępu I Dla ich amplifikacji szczepy kalciwirusa kota hodowano na komórkach linii nerki kota (Crandell- Reese Feline Kidney lub CRFK Nr ATCC CCL-94, Crandell i wsp. In vitro 1973, 9, ). Komórki CRFK umieszczono w hodowli w płytce z 96 studzienkami lub w Falconach 25 cm z podłożem DMEM uzupełnionym 5% płodową surowicą cielęcą zawierającym około komórek na ml. Komórki hodowano w 37 C w atmosferze zawierającej 5% CO 2. Po 3 dniach warstwa komórek dochodzi do konfluencji. Podłoże hodowlane jest następnie zastępowane przez podłoże DMEM bez surowicy ale z dodatkiem 50 mg/ml gentamycyny i dodaje się rozmrożone próbki izolatów wirusowych FCV w objętości po 100 μl rozcieńczeń seryjnych czterokrotnych do studzienek do klonowania w ograniczonych rozcieńczeniach wirusa FCV albo 1 ml na Falcon. Gdy efekt cytopatyczny (ECP) jest kompletny (24-48 godzin od początku umieszczenia w hodowli) zbiera się zawiesiny wirusów i zamraża w -70 C. Konieczne sana ogół 3-4 kolejne pasaże do produkcji partii wirusa. Partię wirusa przechowuje się w -70 C. P r z y k ł a d 2: Ekstrakcja RNA wirusowego szczepów G1 i 431 kalciwirusa kota Komórki CRFK hodowano w 37 C w rolowanych butelkach 2 litrowych (850 cm 2 ) w modyfikowanym podłożu Eagle (MEM, Gibco BRL) uzupełniony 2,5% hydrolizatem laktalbuminy (Gibco BRL) i 5% surowica płodowa cielęca (Gibco BRL). Do rolowanej butelki dodawano po 300 ml zawiesiny komórek w podłożu MEM przy około komórek/ml. Po 3 dniach warstwa komórek jest konfluentna. Następnie podłożu hodowli komórek zastąpiono podłożem MEM bez surowicy i dodano wirus FCV do wielokrotności zakażenia (moi) 0,5 DICC 50 /komórkę. Hodowlę wirusową utrzymywano w 37 C podczas 24 lub 48 godzin aż do uzyskania efektu cytopatycznego dla całości warstwy komórek. Zawiesinę wirusa zbierano a następnie klarowano za pomocą wirowania. RNA wirusowy zawarły w 100 ml zawiesiny szczepu FCV G1, który był preparowany ekstrahowano roztworami zestawu "High Pure Viral RNA Kit" Nr Kat , Roche Molecular Biochemicals) według zaleceń dostawcy dla etapów ekstrakcji. Uzyskany osad RNA uzyskany na koniec ekstrakcji zawieszono w 10 ml sterylnej wody destylowanej bez RNAzy. RNA wirusowy szczepu FCV 431 ekstrahowano w tych samych warunkach wychodząc ze 100 ml zawiesiny wirusa odpowiedniego szczepu. Osad RNA uzyskany na koniec ekstrakcji zawieszono w 10 ml sterylnej wody destylowanej bez RNAzy. P r z y k ł a d 3: Synteza DNA komplementarnych genów kapsydów szczepów G1 i 431 kalciwirusów kota DNA komplementarne odpowiadające genom kapsydów szczepów G1 i 431 kalciwirusów kota syntetyzowano z zestawem "Gene Amp RNA PCR Kit" (Nr Kat N Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki zalecane przez producenta. Dla szczepu FCV G1 reakcja odwrotnej transkrypcji po której przeprowadzono reakcją łańcuchową polimerazy (reakcja TI-ACP" lub RT-PCR") była przeprowadzona z 1 ml zawiesiny wirusowego RNA FCV G1 (przykład 2) z następującymi oligonukleotydami: PB331 (33 mer) (SEQ ID N 1) 5' TTGCGGCCGCTGTGATGTGTTCGAAGTTTGAGC 3' i PB333 (36 mer) (SEQ ID N 2) 5' TTGGCGCCGYTGACCMAGTGCAGCYTTRTCCAATTC 3'. Warunki syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA to temperatura 42 C przez 15 min., następnie 99 C przez 5 min. i w końcu 4 C przez 5 min.. Warunki reakcji PCR to temperatura 95 C przez 2 min., następnie 35 cykli (95 C przez 1 min., a następnie 62 C przez 1 min. i 72 C przez 2 min.) i w końcu 72 C przez 7 min., aby wyprodukować fragment RT-PCR o wielkości około 2000 par zasad (bp), który określono jako G1-4".

11 PL B1 11 Dla szczepu FCV 431 reakcja odwrotnej transkrypcji po której przeprowadzono reakcją łańcuchową polimerazy (reakcja TI-ACP" lub RT-PCR") była przeprowadzona z 1 ml zawiesiny wirusowego RNA FCV G1 (przykład 2) z następującymi oligonukleotydami: PB331 (33 mer) (SEQ ID N 1) i PB332 (38 mer) (SEQ ID N 3) 5' TTGGCGCCAAYWGTRTTWGHTACAGTRTCAATYARRCC 3'. Warunki syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA to temperatura 42 C przez 15 min., następnie 99 C przez 5 min. i w końcu 4 C przez 5 min.. Warunki reakcji PCR to temperatura 95 C przez 2 min., następnie 35 cykli (95 C przez 1 min., a następnie 62 C przez 1 min. i 72 C przez 2 min.) i w końcu 72 C przez 7 min., aby wyprodukować fragment RT-PCR o wielkości około 2000 par zasad (bp), który określono jako 431-2". P r z y k ł a d 4: Klonowanie genu kodującego białko kapsydu szczepu G1 kalciwirusa kota Fragment RT-PCR G1-4" strawiono Narl, a następnie Notl, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragmentu Narl-Notl o wielkości około 2000 bp. Fragment ten zligowano z wektorem pbluescript II KS+ (Nr Kat Stratagene Inc., La Jolla, CA 92037, USA), uprzednio strawionego Notl i ClaI, następnie defosforylowanego, aby uzyskać plazmid pg1-4-5 (5033 bp). Fragment Notl-Narl sklonowany w tym plazmidzie zsekwencjonowano w całości na obu niciach, aby określić sekwencję genu kapsydu. Sekwencja genu kapsydu szczepu FCV G1 (2010 bp) (SEQ ID N 4) jak i sekwencja białka kapsydu (p65) (668 aminokwasów) (SEQ ID N 5) kodowana przez ten gen są przedstawione na fig. 1. P r z y k ł a d 5: Klonowanie genu kodującego białko kapsydu szczepu 431 kalciwirusa kota Fragment RT-PCR 431-2" strawiono Narl, a następnie Notl, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment Narl-Notl o wielkości około 2000 bp. Fragment ten zligowano z wektorem pbluescript II KS+ (Nr Kat Stratagene Inc., La Jolla, CA 92037, USA), uprzednio strawionego Notl i ClaI, następnie defosforylowanego, aby uzyskać plazmid p (4985 bp). Fragment Narl-Notl sklonowany w tym plazmidzie zsekwencjonowano w całości na obu niciach aby określić sekwencję genu kapsydu. Sekwencja genu kapsydu szczepu FCV 431 (2007 bp) (SEQ ID N 6) jak i sekwencja białka kapsydu (p65) (668 aminokwasów) (SEQ ID N 7) kodowana przez ten gen są przedstawione na fig. 2. P r z y k ł a d 6. Konstrukcja plazmidu pjca151 Reakcja PCR była przeprowadzona stosując plazmid p (przykład 5) i jako matryce następujące oligonukleotydy: JCA289 SEQ ID N 8 (36 mer): 5' AAACGCGTCGACATGTGCTCAACCTGCGCTAACGTG 3' i JCA290 SEQ ID N 9 (33 mer): 5' TTTTGATATCTCATATTTTAACCATTCCACTCC 3', aby zamplifikować fragment PCR około 2030 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi Sall i EcoRV, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment SalI-EcoRV 2014 bp. Ten fragment restrykcyjny następnie zligowano z plazmidem pvr1012 (Hartikka J. i wsp. Human Gene Therapy ) uprzednio strawionym Sall i EcoRV, aby uzyskać plazmid pjca151 (6908 bp) (fig. 3). P r z y k ł a d 7. Konstrukcja plazmidu dawcy dla insercji w miejscu C6L wirusa ospy kanarka Fig. 4 (SEQ ID N 10) przedstawia sekwencję fragmentu 3700 bp genomowego DNA wirusa ospy kanarka. Analiza tej sekwencji wykazała otwartą ramkę odczytu (ORF), którą nazwano C6L, która rozpoczyna się w pozycji 377 i kończy się w pozycji Konstrukcja plazmidu insercyjnego powodująca delecję ORF C6L i jego zastąpienie przez miejsce wielokrotnego klonowania otoczone przez sygnał zakończenia transkrypcji i translacji była przeprowadzona jak opisano poniżej. Przeprowadzono reakcję PCR wychodząc z matrycy złożonej z DNA genomowego wirusa ospy kanarka i z następującymi oligonukleotydami: C6A1 (SEQ ID N 11) (42 mer) 5' ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT 3' i C6B1 (SEQ ID N 12) (73 mer) 5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTT TTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA 3', aby wyizolować fragment PCR 432 bp (fragment A).

12 12 PL B1 Reakcja PCR była przeprowadzona wychodząc z matrycy złożonej z DNA genomowego wirusa ospy kanarka i z następującymi oligonukleotydami: C6C1 (SEQ ID N 13) (72 mer) 5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAAT GAGTATATATAATTGAAAAAGTAA 3' i C6D1 (SEQ ID N 14) (45 mer) 5' GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3, aby wyizolować fragment PCR 1210 bp (fragment B). Fragmenty A i B zhybrydyzowano razem, aby służyły jako matryca dla reakcji PCR przeprowadzonej z oligonukleotydami C6A1 (SEQ ID N 11) i C6D1 (SEQ ID N 14), aby wygenerować fragment PCR 1630 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi SacI i KpnI, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment SacI-KpnI 1613 bp. Ten fragment następnie zligowano z wektorem pbluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA Nr kat ) uprzednio strawionym enzymami SacI i KpnI, aby uzyskać plazmid pc6l. Sekwencję tego plazmidu sprawdzono za pomocą sekwencjonowania. Ten plazmid zawiera 370 bp sekwencji zlokalizowanych powyżej ORF C6L ( lewe ramię flankujące C6"), przedwczesny sygnał zatrzymania transkrypcji krowianki, kodony stop w 6 ramkach odczytu, miejsce wielokrotnego klonowania zawierające miejsca restrykcyjne Smal, Pstl, XhoI i EcoRI i w końcu 1156 bp sekwencji zlokalizowanych poniżej ORF C6L ( prawe ramię flankujące C6"). Plazmid pmp528hrh (Perkus M i wsp. J. Virol ) stosowano jako matrycę do amplifikacji całkowitej sekwencji promotora krowianki H6 (numer dostępu GenBank M28351) z następującymi oligonukleotydami: JCA291 (SEQ ID N 15) (34 mer) 5' AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3' i JCA292 (SEQ ID N 16) (43 mer) 5' AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG 3', aby uzyskać fragment PCR 149 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi Smal i EcoRI aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Smal-EcoRI 138 bp. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pc6l uprzednio strawionym Smal i EcoRI aby uzyskać plazmid pjca150. P r z y k ł a d 8. Konstrukcja wirusa zrekombinowanego vcp1710 (zrekombinowany wirus ospy kanarka wyrażający gen kapsydu szczepu FCV 431). Przeprowadzono reakcję PCR stosując plazmid p (przykład 5) jako matrycę i następujące oligonukleotydy: JCA293 (SEQ ID N 17) (55 mer): 5AAATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTGCTCAACCTGCGCTAACGTG 3' et JCA294 (SEQ ID N 18) (33 mer): 5' TTTTGTCGACTCATATTTTAACCATTCCACTCC 3', aby zamplifikować fragment PCR 2050 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi Nrul i Sall, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Nrul-Sall 2035 bp (fragment A). Plazmid pjca150 (przykład 7) strawiono enzymami restrykcyjnym Nrul i Sall, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Nrul-Sall około 4500 bp (fragment B). Fragmenty A i B wówczas zligowano razem, aby uzyskać plazmid pjca152. Plazmid pjca152 linearyzowano Notl, a następnie transfekowano do komórek pierwotnych zarodków kurcząt zakażonych wirusem ospy kanarka (szczep ALVAC) według techniki precypitacji fosforanem wapnia opisanej uprzednio (Panicalli i Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci ; Piccini i wsp. w Methods in Enzymology red. Wu R. i Grossman L. Academic Press). Pozytywne płytki wybrano na podstawie hybrydyzacji ze znakowaną radioaktywną sondą specyficzną dla genu kapsydu szczepu FCV 431. Te fagi przeszły 4 kolejne cykle selekcji/oczyszczania łysinek, aż wyizolowano czystą populację. Łysinkę reprezentatywną dla rekombinacji in vitro miedzy plazmidem dawcą pjca 152 i genomem wirusa ospy kanarka ALVAC następnie zamplifikowano i partię uzyskanego wirusa zrekombinowanego nazwano vcp1710. P r z y k ł a d 9. Konstrukcja wirusa zrekombinowanego vcp1711 (zrekombinowany wirus ospy kanarka wyrażający gen kapsydu szczepu FCV G1). Przeprowadzono reakcję PCR stosując plazmid pg (przykład 4) jako matrycę i następujące oligonukleotydy: JCA293(SEQ ID N 17)

13 PL B1 13 i JCA295 (SEQ ID N 19) (33 mer): 5' TTTTGTCGACTCATAGTTTTGTCATAGTACTCC 3', aby zamplifikować fragment PCR 2050 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi Nrul i Sall, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Nrul-Sall 2035 bp (fragment A). Plazmid pjca150 (przykład 7) strawiono enzymami restrykcyjnym Nrul i Sall, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Nrul-Sall około 4500 bp (fragment B). Fragmenty A i B wówczas zligowano razem aby uzyskać plazmid pjca153. Plazmid pjca153 linearyzowano Notl, a następnie transfekowano do komórek pierwotnych zarodków kurcząt zakażonych wirusem ospy kanarka (szczep ALVAC) według techniki precypitacji fosforanem wapnia opisanej uprzednio (Panicali i Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci ; Piccini i wsp. w Methods in Enzymology red. Wu R. i Grossman L. Academic Press). Pozytywne płytki wybrano na podstawie hybrydyzacji ze znakowaną radioaktywną specyficzną genu kapsydu szczepu FCV G1. Te fagi przeszły 4 kolejne cykle selekcji/oczyszczania łysinek, aż wyizolowano czystą populację. Łysinkę reprezentatywna rekombinacji in vitro miedzy plazmidem dawcą pjca152 i genomem wirusa ospy kanarka ALVAC a następnie zamplifikowaną i zapas uzyskanego wirusa zrekombinowanego nazwano vcp1711. P r z y k ł a d 10: Plazmid kodujący GM-CSF kota Krew kota zebrano w probówce zawierającej EDTA za pomocą pobrania krwi. Komórki jednojądrowe zebrano za pomocą wirowania na gradiencie Ficollu, a następnie umieszczono je w hodowli na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Komórki jednojądrowe kota następnie stymulowano konkanawaliną A (ConA) (stężenie końcowe około 4 μg/ml) i fitohemaglutyniną A (stężenie końcowe około 10 μg/ml). Po stymulacji limfocyty ConA'' i PHA" zebrano przez zdrapanie szalek hodowlanych i całkowity RNA tych komórek ekstrahowano stosując zestaw "mrna isolation kit for White Blood Cells" (Boehringer Mannheim/Roche Nr Kat ). Całkowity RNA wyekstrahowany z limfoblastów kota stymulowanych ConA i PHA posłużył jako matryca do syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA. Tę pierwszą nić komplementarnego DNA zsyntetyzowano przez elongację oligonukleotydu p(dt)15 (Boehringer Mannheim Nr Kat ). DNA komplementarny jednoniciowy następnie stosowano jako matrycę do reakcji PCR z następującymi oligonukleotydami: JP578 (SEQ ID N 20) (33 mer) 5' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3' i JP579 (SEQ ID N 21) (36 mer) 5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3', aby zamplifikować fragment PCR około 450 par zasad (bp). Ten fragment strawiono Notl aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment Notl-Notl 450 bp. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pvr1012 (Hartikka J. i wsp. Human Gene Therapy ). Zidentyfikowano dwa klony zawierające sekwencję GM-CSF kota (SEQ ID N 22 i SEQ ID N 23) w dobrej orientacji pod względem promotora hcmwie odpowiednio pjp089 i pjp090. Te dwa plazmidy maja wielkość 5364 bp (fig. 5 i 7). Sekwencja genu GM-CSF kota sklonowana w plazmidzie pjp089 zawiera 13 różnic na poziomie nukleotydów od sekwencji GM-CSF kota dostępnej w GenBank (numer dostępu AF053007). Najważniejszą zmianą jest zmiana C T, która pociąga za sobą zmianę leucyna fenyloalanina dla aminokwasu (pierwsza zasada kodonu dla aminokwasu # 107; fig. 6). Sekwencja genu GM-CSF kota sklonowana w plazmidzie pjp090 jest ekwiwalentna do tej zawartej w plazmidzie pjp089 poza tym, że zmiana leucyna fenyloalanina nie jest obecna dla aminokwasu # 107 (fig. 8). Sprawdzenie sekwencji 3' genu GM-CSF kota za pomocą zestawu 3' RACE wykazało, że w tej pozycji 107 może być obecny u tego samego kota aminokwas leucyna lub aminokwas fenyloalanina. P r z y k ł a d 11: Wytwarzanie połączonych szczepionek plazmidowych Mieszano różne plazmidy konieczne do wytwarzania szczepionki asocjowanej. Te plazmidy mogą być w szczególności tymi, które są opisane w przykładach 6 i 10 (pjca151, pjp089 i pjp090) i przykładach 7 do 15 i 17 do 19 zgłoszenia patentowego wg publikacji WO-A (ppb179, ppb180, ppb181, pab009, pab053, pab052, pab056, pab058, pab029, pab030, pab083, pab041). Mieszaniny są przeprowadzone w ten sposób, że stężenie końcowe każdego plazmidu odpowiada skutecznej dawce każdego plazmidu. Roztwory stosowane do dopasowania stężenia końcowego szczepionki mogą być albo roztworem NaCl 0,9% lub buforu PBS.