Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF

Transkrypt

1 Agnieszka Gładysz Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Akademia Medyczna Prof. dr hab. Jan Pachecka Zakład Biologii Komórki Centrum Onkologii Instytutu im. M. Skłodowskiej-Curie Prof. dr hab. Przemysław Janik Doc. dr hab. Maciej Małecki

2 Rozwój nowotworu uzaleŝniony jest od wykształcenia sieci naczyń krwionośnych, dostarczających składniki odŝywcze i tlen do głębszych partii guza.! KaŜda dodatkowa komórka śródbłonka wzrastającego naczynia umoŝliwia przyrost guza o 100 nowych komórek. Na wzrost naczyń krwionośnych (angiogenezę) nie tylko w obrębie guza, ale teŝ w warunkach fizjologicznych wpływa wiele czynników.

3 Angiogeneza Papetti M, Herman I.M. Mechanisms of normal and tumor-derived angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol 2002; 282:

4

5 Cele Pracy Badanie mechanizmów indukcji ekspresji cytokin proangiogennych oraz receptorów: Angiopoetyny 1 Tie 1 Angiopoetyny 2 Tie 2 Czynnika SDF-1 Kinazy FAK CXCR4 Gli VEGFR-1 VEGFR-2 przez geny: Sonic Hedgehog (SHH) oraz naczyniowo śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF), w komórkach nowotworowych raka jajnika OVP 10 w warunkach in vitro.

6 Materiały Komórki raka jajnika linii OVP10 Komórki raka jajnika linii OVP10/SHH Komórki raka jajnika linii OVP10/VEGF Media (CM) znad komórek OVP oraz transfektantów (OVP 10/pSHH i OVP 10/pVEGF) Komórki transfekowane były plazmidem SHH i VEGF w systemie niewirusowym.

7 Metody Hodowla komórek Prowadzono hodowle komórek raka jajnika OVP10 oraz transfektantów OVP10/SHH i OVP10/VEGF Izolacja RNA Ocena jakościowa RNA (rozdział elektroforetyczny) Ocena ilościowa RNA (pomiar spektrofotometryczny)

8 Metody Reakcja RT-PCR Izolacja mrna Synteza cdna Reakcja PCR Reakcje PCR prowadzono z uŝyciem starterów rozpoznających sekwencje kodujące białka GAPDH, VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, Ang1, Ang2, Tie 1, Tie 2, SHH, Gli, FAK, SDF-1, CXCR4.

9 Metody Elektroforeza Rozdział elektroforetyczny prowadzono w 1,9% Ŝelu agarozowym z dodawanym bromkiem etydyny, z uŝyciem 1x stęŝonego buforu TEA Rozdzielony produkt reakcji obserwowano w świetle UV

10 Wyniki Ocena jakości wyizolowanego RNA

11 Wyniki Ocena syntezy cdna

12 Wyniki Rozdział elektroforetyczny produktów po reakcji RT-PCR

13 Wyniki Tabela I. Wpływ genu SHH na indukcję cytokin proangiogennych w komórkach OVP-10 OVP-10 OVP-10/SHH OVP-10_CM SHH SHH VEGF VEGFR VEGFR ANG ANG TIE TIE SDF CXCR GLI FAK (+) śladowa ekspresja genów; (++) umiarkowana ekspresja genów; (+++) silna ekspresja genów; (-) brak ekspresji genów

14 Wyniki Tabela II. Wpływ genu VEGF na indukcję cytokin proangiogennych w komórkach OVP-10 OVP-10 OVP-10/VEGF OVP-10_CM VEGF SHH VEGF VEGFR VEGFR ANG ANG TIE TIE SDF CXCR GLI FAK (+)śladowa ekspresja genów; (++) umiarkowana ekspresja genów; (+++) silna ekspresja genów; (-) brak ekspresji genów

15 Wnioski 1. Komórki raka jajnika OVP 10 z nadekspresją genu SHH cechuje zwiększona ekspresja izoformy VEGF VEGF 121, angiopoetyny 1 i 2 oraz genów SDF-1 i CXCR4.

16 Wnioski 2. Medium hodowlane bogate w białko SHH zwiększa ekspresję genu SHH w komórkach OVP 10 (mechanizm autokrynny).

17 Wnioski 3. Komórki raka jajnika z nadekspresją genu VEGF charakteryzują się zwiększoną ekspresją genu receptora VEGF VEGFR-2 oraz angiopoetyny 1 i 2, SDF-1 i CXCR4.

18 Wnioski 4. Medium hodowlane bogate w białko VEGF zwiększa ekspresję genu VEGF w komórkach OVP 10 (mechanizm autokrynny).

19 Wnioski 5. Nadekspresja genów SHH i VEGF nie prowadzi do zmian w ekspresji genu FAK.

20 Terapia antyangiogenna Czy czynniki proangiogenne mogą stać się potencjalnym celem terapeutycznym w leczeniu choroby nowotworowej?

21 Dziękuję