(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR99/00453 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR99/00453 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO99/44633 PCT Gazette nr 36/99 (51) Int.Cl. A61K 39/39 ( ) A61K 48/00 ( ) C12N 15/44 ( ) (54) Rekombinowana żywa szczepionka, zastosowanie związków wybranych z polimerów kwasu akrylowego i metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych oraz zestaw do szczepień (30) Pierwszeństwo: ,FR,98/02800 (73) Uprawniony z patentu: MERIAL,Lyon,FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 14/01 (72) Twórca(y) wynalazku: Jean-Christophe Francis Audonnet,Lyon,FR Jules Maarten Minke,Corbas,FR (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/08 (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o. PL B1 (57) 1. Rekombinowana żywa szczepionka, znamienna tym, że obejmuje wektor wirusowy inkorporujący i wyrażający in vivo heterologiczną sekwencję nukleotydową, korzystnie genu czynnika patogennego oraz przynajmniej jeden adiuwant wybrany spośród polimerów kwasu akrylowego lub metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych. 2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje jako adiuwant polimer kwasu akrylowego lub metakrylowego usieciowany eterem polialkenylowym cukru lub polialkoholu. 19. Zastosowanie związków wybranych z polimerów kwasu akrylowego i metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych, jak określone w zastrz. 1 do 6, do wytwarzania rekombinowanych żywych szczepionek inkorporujących i wyrażających in vivo heterologiczną sekwencję nukleotydową. 20. Zestaw do szczepień do formułowania rekombinowanej żywej szczepionki o zwiększonej immunogenności, znamienny tym, że zawiera, zapakowane oddzielnie, (a) rekombinowaną żywą szczepionkę obejmującą wektor wirusowy, który zawiera i wyraża in vivo heterologiczną sekwencję nukleotydową patogennego czynnika w postaci liofilizowanej i (b) roztwór przynajmniej jednego adiuwanta wybranego z grupy polimerów kwasu akrylowego lub metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych, jak określone w zastrz. 1 do 6.

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest rekombinowana żywa szczepionka, zastosowanie związków wybranych z polimerów kwasu akrylowego i metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych oraz zestaw do szczepień. Zazwyczaj do szczepionek inaktywowanych lub podjednostkowych włącza się adiuwanty, które mają za zadanie wzmacniać odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw antygenom zawartym w szczepionce. Adiuwanty są również zwykle dodawane do atenuowanych żywych szczepionek, gdy atenuacja mikroorganizmów prowadzi do redukcji odpowiedzi immunologicznej. W ostatnim okresie zaproponowano wykonywanie złożonych szczepień przeciwko kilku patogenom przy użyciu inaktywowanej szczepionki dla jednej wartościowości i atenuowanej żywej szczepionki dla innych wartościowości. Zaproponowano także rekonstytuowanie atenuowanej żywej szczepionki przechowywanej w formie liofilizowanej, w kompozycji inaktywowanej szczepionki zawierającej adiuwant. Taka kompozycja działa jako nośnik do rekonstytucji żywej szczepionki i nie posiada aktywności adiuwanta. W publikacji EP-A opisano szczepionkę przeciw końskiemu zapaleniu płuc i nieżytowi nosa, chorobie wywoływanej przez końskiego wirusa opryszczki (EHV od ang. equine herpesvirus). Szczepionka jest inaktywowana i należy do grupy obejmującej inaktywowany wirus EHV-4 i wirus EHV-1 i zawiera adiuwant Havlogen oparty na polimerze poliakrylowym. Tak jak w przypadku większości wirusów opryszczki, nie ma w chwili obecnej efektywnej szczepionki pozwalającej na szybkie wyeliminowanie wirusa po infekcji. Znane szczepionki starają się zabezpieczać przed pojawieniem się objawów klinicznych. W rzeczywistości ich wpływ na wydalanie wirusa jest ograniczony. Zgodnie z danymi przedstawionymi publikacji EP-A , opracowana szczepionka doprowadza do spadku wydalania wirusa w zakresie od 79 do 93% (patrz rozdział wyniki). Osiem na dziewięć zwierząt kontrolnych wydalało wirusa po teście prowokacji przez średnio 1,4 dnia, podczas gdy normalny okres wydalania wirusa po prowokacji jest większy lub równy 5 dni. Oznacza to prowokację na niskim poziomie, która sztucznie podwyższa ochronę szczepionych koni w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Redukcja wydalania wirusa nie jest więc znacząca w tym eksperymencie. Adiuwanty typu karbomerów były także wykorzystywane w inaktywowanych szczepionkach, zawierających wirusa grypy końskiej (IEV). Mumford et al. (Epidemiol. Infect. (1994), 112, ) przypominają, że konieczne są dwie dawki końskiej szczepionki IEV, aby wywołać przejściową odpowiedź humoralną i słabą ochronę przeciw wirusowi u koni. Autorzy porównują efekt adiuwantów, karbomeru i fosforanu glinu w szczepionkach inaktywowanych, w obecności lub braku anatoksyny tężca. We wszystkich przypadkach niskie miano przeciwciał mierzone za pomocą techniki SRH (pojedynczej radialnej hemolizy, ang. single radial haemolysis) z użyciem szczepu H7N7 i H3N8 otrzymywane jest po pierwszym i drugim szczepieniu i dopiero trzecie szczepienie powoduje silniejszą przejściową odpowiedź. W opisie patentowym US-A przedstawiono również próby szczepień przeciw wirusowi grypy końskiej, przy użyciu szczepionki inaktywowanej, w obecności karbomeru. Źródło zwierząt i ich stan medyczny nie są dokładnie opisane i wygląda na to, że są to zwierzęta gospodarcze (kolumna 11, paragraf 2). Wysokie miano przeciwciał zmierzone za pomocą techniki inhibicji hemaglutynacji, wskazuje na to, że zwierzęta prawdopodobnie były już zakażone grypą i że odpowiedź wywołana po szczepieniu wynikała z pobudzenia odpowiedzi pamięci, a nie ze szczepienia typu pierwotnego. Firma Fort Dodge Solvay sprzedaje inaktywowane szczepionki przeciw grypie końskiej (Duvaxyn IE i IE-T plus) oraz inaktywowaną szczepionkę przeciwko końskiemu zapaleniu płuc i nieżytowi nosa (Duvaxyn EHVi 1,4 ), wraz z adiuwantem karbomerowym. Dostępne są także w handlu inaktywowane szczepionki przeciwko grypie końskiej zawierające wodorotlenek glinu jako adiuwant (na przykład Tetagripiffa, Merial, Lion, Francja). W konwencjonalnych inaktywowanych lub podjednostkowych szczepionkach stosuje się także wiele innych adiuwantów. Wśród nich można wymienić na przykład wodorotlenek glinu, fosforan glinu, Avridine, DDA, monofosforylowany lipid A, Pluronic L121 i inne polimery, peptydy muramylowe, saponiny, dimikolat trehalozy (ang. trehalose dimycolate), kopolimery bezwodnika maleinowego i etylenu, kopolimery styrenu i kwasu akrylowego lub metakrylowego, polifosfazen, emulsje olejowe i podobne.

3 PL B1 3 W publikacji WO-A sugeruje się suplementowanie rekombinowanych żywych szczepionek prowadzących do ekspresji heterologicznego genu otoczkowego wirusa kompozycją adiuwanta w formie emulsji typu woda w oleju, olej w wodzie lub woda w oleju w wodzie. Taki roztwór może jednak cechować się wieloma wadami. W praktyce, użytkownik końcowy powinien mieć dostępny z jednej strony liofolizowany składnik aktywny, a z drugiej przygotowaną emulsję, która powinna umożliwiać rekonstytucję liofilizowanego składnika aktywnego. Brak stabilności emulsji w czasie przechowywania może obniżyć skuteczność i bezpieczeństwo zrekonstytuowanej szczepionki. Aktywność atenuowanych żywych mikroorganizmów może być zmienna z powodu ich niestabilności w fazie olejowej. W szczególności, może się tak zdarzyć w przypadku wirusów, które mogą w ten sposób stracić swoją żywotność. Szczepionki w formie emulsji mogą także stwarzać problemy pod względem bezpieczeństwa w miejscu wstrzyknięcia. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych kompozycji szczepionek opartych na rekombinowanych żywych szczepionkach wyrażających co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową, korzystnie genu heterologicznego, zawierających odpowiedni dla tego typu szczepionki adiuwant, który zdolny jest do znaczącego podniesienia immunogenności w stosunku do tej samej szczepionki bez adiuwanta. Zgłaszający nieoczekiwanie stwierdził, że klasa substancji karbomerów zdolna jest do działania jako adiuwant w warunkach odpowiednich dla tego typu szczepionek i to w nieoczekiwanych proporcjach. Próby przeprowadzone na wirusach opryszczki zwierzęcej (EHV-1, opryszczka końska) wykazały, że dodanie karbomeru może zredukować wydalanie wirusa w czasie infekcji eksperymentalnej, w nieoczekiwanych proporcjach. Ponadto, inne próby przeprowadzone z wirusem końskiej grypy typu A umożliwiły otrzymanie u koni szybko pojawiającego się i bardzo wysokiego miana przeciwciał, wyższego od otrzymywanego za pomocą najlepszych, dostępnych w handlu szczepionek. Wynalazek dotyczy rekombinowanej żywej szczepionki obejmującej wektor wirusowy inkorporujący i wyrażający in vivo heterologiczną sekwencję nukleotydową, korzystnie genu czynnika patogennego oraz przynajmniej jeden adiuwant wybrany spośród polimerów kwasu akrylowego lub metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych. Szczepionka według wynalazku korzystnie obejmuje jako adiuwant polimer kwasu akrylowego lub metakrylowego usieciowany eterem polialkenylowym cukru lub polialkoholu, korzystniej usieciowany allilosacharozą lub allilopentaerytrytolem. Korzystna szczepionka według wynalazku obejmuje w charakterze adiuwanta kopolimer bezwodnika maleinowego i etylenu usieciowane, przykładowo, eterem diwinylowym. Korzystnie adiuwant jest obecny w szczepionce w ilości od 0,01% do 2% wag./obj., korzystnie stężenie adiuwanta wynosi od 0,06 do 1% wag./obj., korzystniej 0,1 do 0,6% wag./obj. Szczepionka według wynalazku korzystnie obejmuje wektor inkorporujący i wyrażający przynajmniej jeden gen zwierzęcego wirusa opryszczki, korzystnie wybranego z grupy składającej się z wirusa opryszczki końskiej EHV-1 i/lub EHV-4, wirusa opryszczki kociej FHV, wirusa opryszczki psiej CHV, wirusa opryszczki ptasiej ILTV lub Marek'a, wirusa opryszczki bydlęcej BHV i wirusa opryszczki świńskiej PRV. W korzystnym wykonaniu wynalazku szczepionka zawiera wektor inkorporujący i wyrażający przynajmniej jeden gen wirusa grypy, korzystnie wybranego z grupy składającej się z wirusa grypy końskiej, wirusa grypy ptasiej i wirusa grypy świńskiej. W kolejnym korzystnym wykonaniu szczepionki według wynalazku obejmuje wektor inkorporujący i wyrażający przynajmniej jeden gen zwierzęcego wirusa wybranego z grupy składającej się z wirusa białaczki kociej FeLV, wirusa nosówki psiej CDV lub toksyny tężcowej. W korzystnym wykonaniu szczepionki wektor wirusowy wybrany jest z grupy składającej się z wirusa ospy, adenowirusa, wirusa opryszczki, przy czym wirus ospy korzystnie wybrany jest z grupy składającej się z wirusa ospy krowiej, wirusa ospy ptaków, wirusa ospy kanarków, wirusa ospy gołębiej, wirusa ospy świńskiej. W innym korzystnym wykonaniu wynalazku szczepionka obejmuje wirus ospy kanarków inkorporujący i wyrażający geny gb, gc i gd końskiego wirusa opryszczki EHV-1 lub EHV-4.

4 4 PL B1 Korzystnie szczepionka według wynalazku obejmuje dwa lub trzy wektory wirusa ospy kanarków, przy czym każdy z nich obejmuje gen HA wirusa grypy końskiej, a każdy gen HA otrzymany jest z innego szczepu. Równie korzystnie szczepionka według wynalazku obejmuje wektor wirusa ospy kanarków, obejmujący dwa lub trzy geny HA wirusa grypy końskiej, przy czym każdy gen HA otrzymany jest z innego szczepu. Ponadto korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera wektor wirusa ospy kanarków, obejmujący i wyrażający geny gb, gc i gd kociego wirusa opryszczki FHV. W innym korzystnym wykonaniu wynalazku szczepionka obejmuje wektor wirusa ospy kanarków inkorporujący i wyrażający geny HA i F wirusa nosówki CDV. Wynalazek dotyczy też zastosowania związków wybranych z polimerów kwasu akrylowego i metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych, do wytwarzania rekombinowanych żywych szczepionek inkorporujących i wyrażających in vivo heterologiczną sekwencję nukleotydową. Wynalazek również dotyczy zestawu do szczepień do formułowania rekombinowanej żywej szczepionki o zwiększonej immunogenności zawierającego zapakowane oddzielnie: (a) rekombinowaną żywą szczepionkę obejmującą wektor wirusowy, który zawiera i wyraża in vivo heterologiczną sekwencję nukleotydową patogennego czynnika w postaci liofilizowanej i (b) roztwór przynajmniej jednego adiuwanta wybranego z grupy polimerów kwasu akrylowego lub metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych. Zalecanymi adiuwantami są polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego, usieciowane zwłaszcza eterami polialkenylowymi cukrów lub polialkoholi. Związki te znane są jako karbomery (Pharmeuropa, tom 8, nr 2, czerwiec 1996). W opisie US-A ujawniono takie polimery akrylowe usieciowane związkami polihydroksylowymi, posiadającymi przynajmniej trzy grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż osiem, w których atomy wodoru przynajmniej trzech grup hydroksylowych zostały zastąpione nienasyconymi rodnikami alifatycznymi, zawierającymi przynajmniej dwa atomy węgla. Korzystne są rodniki zawierające od dwóch do czterech atomów węgla, np. winyle, allile i inne etylenowo nienasycone grupy. Nienasycone rodniki mogą zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Szczególnie wskazane są produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA). Są one usieciowane allilosacharozą lub allilopentaerytrytolem. Wśród nich wymienić należy Carbopol 974P, 934P i 971P. Wśród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych korzystne są kopolimery EMA (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowymi albo usieciowanymi, przykładowo usieciowanymi eterem diwinylowym. Zostało to opisane w publikacji J. Fields et al., Nature, 186: , 4 czerwca 1960, włączonej niniejszym jako referencje. Z punktu widzenia struktury polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego kopolimery EMA są korzystnie utworzone z podstawowych jednostek o następującym wzorze: w którym: R 1 i R 2, które są identyczne lub różne, oznaczają H lub CH 3 ; x = 0 lub 1, korzystnie x = 1; y = 1 lub 2, gdzie x + y = 2; Dla kopolimerów EMA x = 0 i y = 2. Dla karbomerów x = y = 1. Rozpuszczenie tych polimerów w wodzie prowadzi do powstania roztworu kwaśnego, który należy zobojętnić, korzystnie do poziomu ph fizjologicznego, w celu otrzymania roztworu adiuwanta, do którego włączona będzie szczepionka. Grupy karboksylowe polimeru znajdują się wtedy częściowo w postaci COO -. Korzystnie roztwór adiuwanta, stosowany w rozwiązaniach według wynalazku, zwłaszcza karbomeru, wytwarza się w wodzie destylowanej, korzystnie w obecności chlorku sodu, przy czym otrzymany roztwór ma ph kwasowe. Roztwór podstawowy rozcieńcza się przez dodanie go do odpowied-

5 PL B1 5 niej ilości wody (dla otrzymania żądanego stężenia końcowego) zawierającej NaCl, korzystnie soli fizjologicznej (NaCl 9 g/l) jednorazowo lub w kilku porcjach, z jednoczesnych lub późniejszym zobojętnieniem (ph 7,3 do 7,4), korzystnie przy użyciu NaOH. Roztwór ten o ph fizjologicznym stosuje się do rekonstytuowania szczepionki, szczególnie przechowywanej w postaci liofilizowanej. Stężenie polimeru w ostatecznym roztworze szczepionki, wynosi 0,01% do 2% wag./obj., korzystniej 0,06% do 1% wag./obj., najkorzystniej 0,1% do 0,6% wag/obj. Szczepionka według wynalazku jest szczególnie przydatna do szczepień przeciwko zwierzęcym wirusom opryszczki, szczególnie przeciwko wirusowi opryszczki końskiej (szczególnie EHV-1 i EHV-4), wirusowi opryszczki kociej (FHV), wirusowi opryszczki psiej (CHV), wirusowi opryszczki ptasiej (MMILTV), wirusowi opryszczki bydlęcej (BHV) i wirusowi opryszczki świńskiej (PRV = wirus choroby Aujeszky'ego). W publikacji nr WO-A (włączonej jako referencje), opisano produkcję wektorów ekspresyjnych, opartych na wirusach ospy, zdolnych do wywołania ekspresji takich genów. Opisane są w powyższej publikacji wirus ospy kanarków, wywołujący ekspresję genów gb, gc i gd wirusa EHV-1 (vcp132), który można również stosować do EHV-4, do wirusa ospy krowiej, wywołującego ekspresję tych samych genów (vp 1043), wirusa ospy krowiej, wywołującego ekspresję genów gl (gb), giii(gc) i giv(gd) wirusa BHV-1, wirusa ospy kanarków, wywołującego ekspresję gd wirusa FHV-1 lub rekombinantów wywołujących ekspresję gii(gb), giii(gc) i gp50(gd) wirusa PRV. Natomiast w publikacji WO- -A-95/ (włączonej przez cytowanie), opisane są rekombinowane wirusy vcp320, vcp322 i vcp294, wywołujące ekspresję genów, odpowiednio gb, gc i gd wirusa CHV. Natomiast w FR-A oraz WO-A , włączonych przez cytowanie opisano rekombinanty wywołujące ekspresję genów wirusów FHV, PRV i BHV. Szczepionki według wynalazku są szczególnie przydatne do prowadzenia szczepień przeciwko wirusom grypy, jak to wykazano na przykładzie EIV (wirusa grypy końskiej). Szczepionki według wynalazku można również stosować do prowadzenia szczepień przeciwko grypie ptasiej (AIV) i grypie świńskiej (wirus grypy świńskiej). W publikacji WO-A , opisany został rekombinowany wirus ospy kanarków, wywołujący ekspresję genu HA wirusa EIV. Żywe szczepionki opisane w opisie wynalazku, zawierają przynajmniej jeden wektor wirusowy, inkorporujący i wywołujący ekspresję przynajmniej jednego wirusa grypy oraz przynajmniej jeden adiuwant opisany w opisie wynalazku. W niektórych przypadkach taka szczepionka zawierać może mieszaninę dwóch lub trzech wektorów, z których każdy inkorporuje i wywołuje ekspresję genu HA, otrzymanego z różnych szczepów, np. wirusa grypy końskiej szczepu Praga, Kentucky i Newmarket. Podobnie pojedynczy wektor może być stosowany do inkorporacji i ekspresji genów HA dwóch lub trzech szczepów. Szczepionki według wynalazku można również stosować do szczepień przeciwko innym patogenom zwierzęcym, szczególnie takim jak FeLV (patrz także np. rekombinanty wirusa ospy kanarków w WO-A , wywołujące ekspresję białek env i gag = vcp93 i vcp97), tężec (patrz także WO- -A i rekombinanty vcp161 i vp1075, wirus ospy kanarków i ospy krowiej, powodujące ekspresję toksyny tężca), wirus choroby Carre (wirus nosówki psiej, czyli CDV) (patrz rekombinant vcp 258 opisany w publikacji WO-A , włączonej przez cytowanie). Wynalazek można zrealizować wykorzystując dowolnego typu wektor dla ekspresji wirusowej, taki jak wirus ospy (wirus ospy krowiej, łącznie z NYVAC (patrz publikacja WO-A-92/15672), ospy drobiu, ospy kanarków, ospy gołębiej, ospy świńskiej i podobnych), adenowirusa i wirusa opryszczki. Wirus ospy kanarków, np. ALVAC (WO-A-95/27760 oraz WO-A-92/15672) jest szczególnie przydatny do zastosowania w niniejszym wynalazku. W gotowej do użycia, korzystnie rekonstytuowanej szczepionce, wektor wirusowy obecny jest w ilościach normalnie stosowanych i opisywanych w literaturze. Rekombinowane, żywe szczepionki zazwyczaj występują w formie liofilizowanej, umożliwiającej ich przechowywanie i rekonstytuowane są bezpośrednio przed użyciem w rozpuszczalniku lub rozczynniku, którym jest tutaj roztwór adiuwanta opisanego w wynalazku. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają szczepienie metodą polegającą na podawaniu szczepionki drogą pozajelitową, najlepiej podskórnie, domięśniowo, śródskórnie lub drogą dośluzówkową, tak jak to przedstawiono w opisie, w ilości jednej lub więcej dawek, ewentualnie ze wstępnym krokiem rekonstytucji liofilizowanej szczepionki (rekombinowanego wektora) w roztworze adiuwanta.

6 6 PL B1 Stosowanie takiej metody szczepienia prowadzi do ochrony zwierząt z klinicznego punktu widzenia oraz zredukowania wydalania wirusów, w szczególności wirusów opryszczki. Uzyskuje się w ten sposób również zwiększenie odpowiedzi immunologicznej oraz jej przyspieszenie, szczególnie przez indukcję przeciwciał w momencie podania pierwszej dawki. Wykorzystanie adiuwantów opisanych w opisie wynalazku do produkcji rekombinowanych żywych szczepionek prowadzi do wywołanie silniejszej i wcześniejszej odpowiedzi immunologicznej i/lub zwiększonej redukcji wydalania wirusa. Wynalazek jest bardziej szczegółowo poniżej zilustrowany przy pomocy przykładów nie ograniczających jego zakresu i odnoszących się do rysunku, na którym: na figurze 1 przedstawiona jest sekwencja nukleotydowa genu EIV HA szczepu Newmarket 2/93; na figurze 2 przedstawiona jest sekwencja nukleotydowa genu FVH-1 gc; na figurze 3 przedstawiono zmianę wydalania wirusa po eksperymentalnym zakażeniu koni zaszczepionych za pomocą różnych szczepionek przeciw wirusowi opryszczki. Przykłady P r z y k ł a d 1. Wytworzenie plazmidów donorowych dla miejsc insercji C3, C5 i C6 do wirusa ospy kanarków ALVAC Plazmidy donorowe dla różnych miejsc insercji do wirusa ospy kanarków ALVAC (Tartaglia et al. Virology, 1992, 188, , włączona przez cytowanie) opisane są w publikacji WO-A-95/27780, przykład 20. Plazmidy te zostały oznaczone w niniejszej publikacji w następujący sposób: plazmid VQH6CP3LSA.2 dla miejsca C3 plazmid HC5LSP28 dla miejsca C5 ; plazmid pc6l dla miejsca C6. P r z y k ł a d 2. Wytworzenie rekombinowanego wirusa vcp258 (ALVAC/CDV HA+F) Szczep Onderstepoort wirusa CDV wykorzystano do izolacji genów HA i F (sekwencja genu HA opisana została przez Currana et al. Virology 1991, 72, , a sekwencja genu F opisana została przez Berretta et al. Virus Research 1987, 8, , obie prace włączone przez cytowanie). Konstrukcja plazmidu donorowego pmm103 do insercji kaset ekspresji H6 promotora wirusa ospy krowiej - genu CDV F oraz H6 promotora ospy krowiej - CDV HA w miejscu C6 wirusa ALVAC opisana została w przykładzie 19 publikacji WO-A-95/ Plazmid ten wykorzystano jako donor do rekombinacji in vitro (Piccini et al. Methods in Enzymology. 1987, 153, , włączona przez cytowanie), z wirusem ALVAC, co doprowadziło do uzyskania rekombinowanego wirusa oznaczonego vcp258 jak w przykładzie 19 powyżej wspomnianej publikacji. P r z y k ł a d 3. Wytworzenie rekombinowanego wirusa vcp1502 (ALVAC/EIV HA Praga) Sekwencja genu HA (szczep EIV Praga) przedstawiona jest na figurze 23 publikacji WO-A- -92/ RNA wirusowe genomu szczepu Praga 56 końskiego wirusa grypy, zostało wyizolowane ze 100 μl zawiesiny wirusa, przy pomocy zestawu do ekstrakcji Total RNA separator kit firmy Clontech (Palo Alto, CA) (nr kat. K1042-1). Pelet z RNA został rozpuszczony w 10 μl ultraczystej wody, a reakcja syntezy komplementarnego DNA oraz reakcja PGR (= reakcja RT-PCR ) przeprowadzone zostały przy użyciu 2 μl matrycy oczyszczonego RNA wirusowego i następujących oligonukleotydów: TAY51A (sekwencja identyfikacyjna nr 1) (70-merowa) 5'CGCGGCCATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAACACTCAAATTCTAATATTAG CCACTTCGG3' oraz TAY53A (sekwencja identyfikacyjna nr 2) (36-merowa) 5'CGCGCGGCGGTACCTTATATACAAATAGTGCACCGC3' w celu amplifikacji genu HA wirusa EIV Praga. Otrzymany metodą PGR fragment został połączony z wektorem pcrii (Invitrogen, San Diego, CA) dając plazmid pjt007. Plazmid pjt007 został strawiony za pomocą Nrul i Asp718 w celu izolacji fragmentu NruI-718 o wielkości ok par zasad, zawierającego końcówkę promotora H6 i cały gen HA wirusa Praga 56. Fragment ten został połączony z plazmidem donorowym C5 HC5LSP28, uprzednio strawionym Nrul i Asp718, dając plazmid pjt008. Plazmid ten zawiera kasetę ekspresji H6 genu HA wirusa Praga 56 w miejscu C5 wirusa ALVAC. Struktura tego plazmidu potwierdzona została za pomocą sekwencjonowania i całkowitej mapy restrykcyjnej. Plazmid ten jest plazmidem donorowym do insercji kasety ekspresji H6 genu HA wirusa Praga 56 w locus C5.

7 PL B1 7 Po linearyzacji za pomocą Notl, plazmid pjt008 wykorzystany był jako plazmid donorowy do rekombinacji in vitro (Piccini et al. Methods in Enzymology. 1987, 153, ) z wirusem ALVAC w celu wytworzenia wirusa rekombinowanego, oznaczonego vcp1502. P r z y k ł a d 4. Wytworzenie wirusa rekombinowanego vcp1502 (ALVAC/EIV HA Kentucky 1/94) RNA wirusowe genomu szczepu Kentucky 1/94 wirusa grypy końskiej (Dały et al. J. Gen. Virol. 1996, 77, , włączona przez cytowanie), wyizolowane zostało ze 100 μl zawiesiny wirusa przy pomocy zestawu do ekstrakcji Total RNA separator kit firmy Clontech (Palo Alto, CA) (nr kat. K1042-1). Pelet RNA został rozpuszczony w 10 μl ultraczystej wody, a reakcja syntezy komplementarnego DNA oraz reakcja PGR (= reakcja RT-PCR ) przeprowadzone zostały przy użyciu 2 μl matrycy oczyszczonego RNA wirusowego i następujących oligonukleotydów: TAY55A (sekwencja identyfikacyjna nr 3) (70-merowa) 5'CGCGGCCATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAGACAACCATTATT TTGATA- -CTACTGACCC3' oraz TAY57A (sekwencja identyfikacyjna nr 4) (42-merowa) 5'CGCGCGGCGGTACCTCAAATGCAAATGTTGCATCTGATGTTG3' w celu amplifikacji genu HA. Otrzymany w ten sposób fragment został połączony z wektorem pcrii (Invitrogen, San Diego, CA) dając plazmid pjt001. Sekwencja genu HA wirusa EIV szczepu Kentucky 1/94 wklonowana w plazmid pjt001 nie jest różna od sekwencji genu HA wirusa EIV szczepu Kentucky 1/94, dostępnej w bazie danych GenBank (nr L 39914, włączone przez cytowanie). Plazmid pjt001 zawierający gen HA (Kentucky 1/94) został strawiony za pomocą Nrul i Asp718 w celu izolacji fragmentu NruI-Asp718, o wielkości ok par zasad (zawierającego końcówkę promotora H6 i cały gen HA wirusa Kentucky 1/94). Fragment ten został połączony z plazmidem donorowym C5 HC5LSP28, uprzednio strawionym Nrul i Asp718, dając plazmid pjt005. Plazmid ten zawiera kasetę ekspresji H6 genu HA wirusa Kentucky 1/94 w miejscu C5 wirusa ALVAC. Struktura tego plazmidu potwierdzona została za pomocą sekwencjonowania i kompletnej mapy restrykcyjnej. Plazmid ten jest plazmidem donorowym do insercji kasety ekspresji H6 genu HA wirusa Kentucky 1/94 w miejscu C5. Po linearyzacji za pomocą Notl, plazmid pjt005 wykorzystany był jako plazmid donorowy do rekombinacji in vitro (Piccini et al. Methods in Enzymology. 1987, 153, ) z wirusem ALVAC w celu wytworzenia wirusa rekombinowanego, oznaczonego vcp1529. P r z y k ł a d 5. Wytworzenie wirusa rekombinowanego vcp1533 (ALVAC/EIV HA Newmarket 2/93) RNA wirusowe genomu szczepu Newmarket 2/93 wirusa grypy końskiej (Daly et al. J. Gen. Virol. 1996, 77, ), wyizolowane zostało ze 100 μl zawiesiny wirusa, przy pomocy zestawu do ekstrakcji Total RNA separator kit firmy Clontech (Palo Alto, CA) (nr kat. K1042-1). Pelet RNA został rozpuszczony w 10 μl ultraczystej wody, a reakcja syntezy komplementarnego DNA oraz reakcja PGR (= reakcja RT-PCR ) przeprowadzone zostały przy użyciu 2 μl matrycy oczyszczonego RNA wirusowego i następujących oligonukleotydów: CCL007 (sekwencja identyfikacyjna nr 5) (40-merowa) 5'TTGTCGACTCAATCATGAAGACAACCATTATTTTGATACT3' oraz CCL0018 (sekwencja identyfikacyjna nr 6) (34-merowa) 5'TTGGATCCTTACTCAAATGCAAATGTTGCAYCTG3' w celu amplifikacji genu HA. Otrzymany w ten sposób fragment został połączony z wektorem pcrii (Invitrogen, San Diego, CA) dając plazmid pccl026. Sekwencja genu HA (wirusa EIV szczepu Newmarket 2/93)przedstawiona jest na figurze nr 1 (sekwencja identyfikacyjna nr 7). Plazmid pccl026 zawierający gen HA (szczepu Newmarket 2/93) został strawiony za pomocą Spel i AccI. Następujące oligonukleotydy: TAY99N (sekwencja identyfikacyjna nr 8) (74-merowa) 5'CTAGTTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAGACAACCATTATTTTG ATACTA- -CTGACCCATTGGGT3' oraz TAY100N (sekwencja identyfikacyjna nr 9) (72-merowa) 5'AGACCCAATGGGTCAGTAGTATCAAAATAATGGTTGTCTTCATTACGATACAAA CTTAAC- -GGATATCGCGAA3'

8 8 PL B1 zostały połączone z plazmidem pccl026 strawionym za pomocą Spel+AccI dając plazmid pjt003. Dwuniciowy nukleotyd TAY99N/TAY100N zawiera region 3' promotora H6 do miejsca Nrul i pierwszych 40 kodujących zasad genu HA. Plazmid JT003 został strawiony za pomocą Nrul i Xhol w celu izolacji fragmentu NruI-XhoI, o wielkości ok par zasad, zawierającego końcówkę promotora H6 i cały gen HA. Fragment ten został połączony z plazmidem donorowym C5 HC5LSP28, uprzednio strawionym Nrul i Xhol, dając plazmid pjt004. Plazmid ten zawiera kasetę ekspresji H6 genu HA wirusa Newmarket 2/93 w miejscu C5 wirusa ALVAC. Struktura tego plazmidu potwierdzona została za pomocą sekwencjonowania i kompletnej mapy restrykcyjnej. Plazmid ten jest plazmidem donorowym do insercji kasety ekspresji H6 genu HA wirusa Newmarket 2/93 w miejscu C5. Po linearyzacji za pomocą Pvul, plazmid pjt004 wykorzystany był jako plazmid donorowy do rekombinacji in vitro (Piccini et al. Methods in Enzymology. 1987, 153, ) z wirusem ALVAC w celu wytworzenia wirusa rekombinowanego, oznaczonego vcp1533. P r z y k ł a d 6. Wytworzenie wirusa rekombinowanego vcp132 (ALVAC/EHV-1 gb+gc+gd) Konstrukcja tego rekombinowanego wirusa opisana została w przykładach 25 i 26 publikacji WO-A-92/ Wirus ten został wytworzony przez rekombinację in vitro pomiędzy wirusem ALVAC i plazmidem donorowym pjca049. Plazmid ten zawiera następujące 3 kasety ekspresji wklonowane w miejscu insercji C3: I3L promotor wirusa ospy krowiej - gen gb wirusa EHV-1; H6 promotor wirusa ospy krowiej - gen gc wirusa EHV-1; 42K promotor entomowirusa ospy - gen gd wirusa EHV-1. Sekwencje genów gb, gc i gd wirusa EHV-1 opisane są w publikacji WO-A-92/15672, na figurze nr 2 (sekwencja genu gp13 EHV-1 = gc), nr 6 (sekwencja genu gp14 EHV-1 = gb) i nr 12 (sekwencja genów gd, gp63 i ge EHV-1). P r z y k ł a d 7. Wytworzenie wirusa rekombinowanego vcp243 (ALVAC/FHV-1 gb+gc+gd) Sekwencja genu gb FHV-1 (szczep CO) przedstawiona jest na figurze nr 34 publikacji WO-A- -90/ Gen gc FHV-1 (szczep CO) (sekwencja przedstawiona na figurze nr 2) (sekwencja identyfikacyjna nr 10) został sklonowany z fragmentu F EcoRI (7,6 tysięcy par zasad). Posiada on wielkość 1599 par zasad i koduje białko składające się z 533 aminokwasów. Gen gd FHV-1 (szczep CO) (sekwencja przedstawiona na figurze nr 28 publikacji WO-A- -92/15672) został sklonowany z fragmentu M EcoRI (4,4 tysięcy par zasad) (plazmid pfhveco-rim). Konstrukcja kasety ekspresji I3L-FHV-1 genu gb zmutowała na poziomie sygnałów wczesnej terminacji transkrypcji (TTTTTNT). Następujące oligonukleotydy: MP287 (sekwencja identyfikacyjna nr 11) (20-merowa) 5'GATTAAACCTAAATAATTGT3' oraz JCA158 (sekwencja identyfikacyjna nr 12) (21-merowa) 5'TTTTTCTAGACTGCAGCCCGGGACATCATGCAGTGGTTAAAC3' wykorzystane były do amplifikacji PGR na matrycy plazmidu zawierającego promotor wirusa ospy krowiej I3L (Riviere et al. J. Virol. 1992, 66, , włączona przez cytowanie) w celu wytworzenia fragmentu Xbal o wielkości 120 tysięcy par zasad (zawierającego promotor I3L wirusa ospy krowiej) = fragment A. Następujące oligonukleotydy: JCA213 (sekwencja identyfikacyjna nr 13) (18-merowa) 5'GGGTTTCAGAGGCAGTTC3' oraz JCA238 (sekwencja identyfikacyjna nr 14) (21-merowa) 5'ATGTCCACTCGTGGCGATCTT3' wykorzystane zostały do wytworzenia za pomocą reakcji PGR na matrycy plazmidu pjca001, fragmentu BamHI o tępych końcach o wielkości 720 par zasad (zawierającego część 5' genu gb FHV-1) = fragment B. Fragment A został strawiony za pomocą Xbal, a następnie ufosforylowany. Fragment B został strawiony za pomocą BamHI, a następnie ufosforylowany. Fragmenty A i B zostały następnie połączone za pomocą wektora pbluescript SK+, uprzednio strawionego za pomocą Xbal i BamHI, dając plazmid pjca075.

9 PL B1 9 Następujące oligonukleotydy: JCA158 (sekwencja identyfikacyjna nr 15) oraz JCA211 (sekwencja identyfikacyjna nr 16) (21-merowa) 5'GTGGACACATATAGAAAGTCG3' wykorzystane były do wytworzenia za pomocą techniki PGR, na matrycy plazmidu pjca075, tępo zakończonego fragmentu Xbal o wielkości 510 par zasad (zawierającego promotor I3L połączony z końcem 5' genu gb FHV-1 zmutowanego na poziomie sygnału TTTTTNT) = fragment C. Następujące oligonukleotydy: JCA212 (sekwencja identyfikacyjna nr 17) (21-merowa) 5'CACCTTCAGGATCTACTGTCG3' oraz JCA213 (sekwencja identyfikacyjna nr 13) (18-merowa) wykorzystane zostały do wytworzenia za pomocą matrycy plazmidu pjca001, fragmentu BamHI o wielkości 330 par zasad (zawierającego środkową część genu gb FHV-1) = fragment D. Fragment C został strawiony za pomocą Xbal, a następnie ufosforylowany. Fragment D został strawiony za pomocą BamHI, a następnie ufosforylowany. Fragmenty C i D zostały następnie połączone za pomocą wektora pbluescript SK+, uprzednio strawionego za pomocą Xbal i BamHI, dając plazmid pjca076. Następujące oligonukleotydy: JCA239 (sekwencja identyfikacyjna nr 18) (24-merowa) 5'ACGCATGATGACAAGATTATTATC3' oraz JCA249 (sekwencja identyfikacyjna nr 19) (18-merowa): 5'CTGTGGAATTCGCAATGC3' wykorzystane były do wytworzenia za pomocą techniki PGR, na matrycy plazmidu pjca001 tępo zakończonego fragmentu EcoRI o wielkości 695 par zasad (zawierającego pierwszą część 3' genu gb FHV-1) = fragment E. Następujące oligonukleotydy: JCA221 (sekwencja identyfikacyjna nr 20) (48-merowa) 5'AAAACTGCAGCCCGGGAAGCTTACAAAAATTAGATTTGTTTCAGTATC3' oraz JCA247 (sekwencja identyfikacyjna nr 21) (36-merowa) 5'GGTATGGCAAATTTCTTTCAGGGACTCGGGGATGTG3' wykorzystane zostały do wytworzenia za pomocą matrycy plazmidu pjca001 fragmentu Pstl o wielkości 560 par zasad (zawierającego drugą część 3' genu gb FHV-1 zmutowanego na poziomie sygnału TTTTTNT) = fragment F. Fragment E został strawiony za pomocą EcoRI, a następnie ufosforylowany. Fragment F został strawiony za pomocą Pstl, a następnie ufosforylowany. Fragmenty C i D zostały następnie połączone za pomocą wektora pibi24 (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT), uprzednio strawionego za pomocą EcoRI i Pstl, dając plazmid pjca077 (zawierający kasetę I3L promotora wirusa ospy krowiej genu B FHV-1). Konstrukcja kasety ekspresji 42K-FHV-1 gd. Następujące oligonukleotydy: RG286 (sekwencja identyfikacyjna nr 22) (17-merowa) 5'TTTATATTGTAATTATA3' oraz M13F (sekwencja identyfikacyjna nr 23) (17-merowa) 5'GTAAAACGACGGCCAGT3' wykorzystane były do wytworzenia za pomocą techniki PGR, na matrycy plazmidu zawierającego promotor AmEPV entomowirusa ospy 42 K (opisanego w przykładzie 21 patentu US-A ), fragmentu EcoRI o wielkości 130 par zasad (zawierającego promotor entomowirusa 42 K) = fragment A. Następujące oligonukleotydy: JCA234 (sekwencja identyfikacyjna nr 24) (21-merowa) 5'ATGATGACACGTCTACATTTT3' oraz JCA235 (sekwencja identyfikacyjna nr 25) (21-merowa) 5'TGTTACATAACGTACTTCAGC3' wykorzystane zostały do wytworzenia za pomocą techniki PGR, na matrycy plazmidu pfhvecorim, fragmentu BamHI o wielkości 185 par zasad (zawierającego część 5' genu gd FHV-1) = fragment B. Fragment A został strawiony za pomocą EcoRI, a następnie ufosforylowany. Fragment B został strawiony za pomocą BamHI, a następnie ufosforylowany. Fragmenty A i B zostały następnie połączone

10 10 PL B1 za pomocą wektora pbluescript SK+, uprzednio strawionego za pomocą EcoRI i BamHI, dając plazmid pjca078. Plazmid pfhvecorim (patrz wyżej) został strawiony za pomocą BamHI i Xhol w celu izolacji fragmentu BamHI-XhoI o wielkości 1270 par zasad (zawierającego koniec 3' genu gd FHV-1). Fragment ten został następnie połączony z wektorem pibi24, uprzednio strawionym za pomocą BamHI i Xhol, dając plazmid pjca072. Następujące oligonukleotydy: JCA242 (sekwencja identyfikacyjna nr 26) (18-merowa) 5'GAGGATTCGAAACGGTCC3' oraz JCA237 (sekwencja identyfikacyjna nr 27) (53-merowa): 5'AATTTTCTCGAGAAGCTTGTTAACAAAAATCATTAAGGATGGTAGATTGCATG3 wykorzystane były do wytworzenia za pomocą techniki PCR, na matrycy plazmidu pfhvecorim, fragmentu XbaI-XhoI o wielkości 290 par zasad. Fragment ten został strawiony Xbal i Xhol i uzyskano fragment C (zawierający koniec genu gd FHV-1). Plazmid pjca072 został strawiony za pomocą Xbal i Xhol w celu izolacji fragmentu XbaI-XhoI o wielkości 3575 par zasad (wektor pibi24 + początek części 3' genu gd FHV-1) = fragment D. Fragmenty C i D zostały następnie połączone, dając plazmid pjca073.plazmid pjca073 został strawiony za pomocą BamHI i Xhol w celu izolacji fragmentu BamHI-XhoI o wielkości 960 par zasad (zawierającego koniec 3' genu gd FHV-1) = fragment A. Plazmid pjca078 został strawiony Hpal i BamHI w celu izolacji fragmentu Hpal-BamHI o wielkości 310 par zasad (zawierającego promotor 42 K połączony z końcem 5' genu gd FHV-1) = fragment B. Fragmenty A i B zostały połączone za pomocą wektora pblu-escropt SK+, uprzednio strawionego za pomocą EcoRV i Xhol, dając plazmid pjca080 (zawierający kasetę promotora 42K-gen gd FHV-1). Wytworzenie kasety H6-FHV-1 gc. Genomowe DNA wirusa FHY-1 (szczep CO) zostało strawione za pomocą EcoRI, a fragment F EcoRI o wielkości około 7500 par zasad został wklonowany do pbluescript SK+, dając plazmid pfhvecorif. Następujące oligonukleotydy: JCA274 (sekwencja identyfikacyjna nr 28) (55-merowa) 5'CATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGACGATATAGGATGGGA 3' oraz JCA275 (sekwencja identyfikacyjna nr 29) (18-merowa) 5'ACTATTTTCAATACTGAC3' wykorzystane były do wytworzenia za pomocą techniki PGR, na matrycy plazmidu pfhvecorif, fragmentu, który został strawiony za pomocą Nrul i Sali, dając fragment NruI-Sall o wielkości 107 par zasad (zawierający część 3' promotora wirusa ospy krowiej H6 połączony z końcem 5' genu gc FHV-1) = fragment A. Następujące oligonukleotydy: JCA276 (sekwencja identyfikacyjna nr 30) (18-merowa) 5'AAATGTGTACCACGGGAC3' oraz JCA277 (sekwencja identyfikacyjna nr 31) (54-merowa) 5'AAGAAGCTTCTGCAGAATTCGTTAACAAAAATCATTATAATCGCCGGGGATGAG 3' wykorzystane zostały do wytworzenia za pomocą techniki PGR, na matrycy plazmidu pfhvecorif, fragmentu, który został strawiony za pomocą EcoRV i Hindlll, dając fragment EcoRV-Hindlll o wielkości 370 par zasad (zawierający część 3' genu gc FHV-1 i miejsca Hpal-EcoRI-Pstl-Hindlll) = fragment B. Plazmid pjca020 (patrz wyżej) został strawiony za pomocą Nrul i Hindlll w celu izolacji fragmentu Hindlll-NruI (zawierającego część 5' promotora wirusa ospy krowiej H6) = fragment C. Plazmid pfhvecorif został strawiony za pomocą BamHI i EcoRV w celu izolacji fragmentu BamHI-EcoRV o wielkości 580 par zasad (zawierającego środkową część genu gc FHV-1) fragment D. Fragmenty A i C zostały połączone za pomocą wektora pbluescript SK+, uprzednio strawionego za pomocą Hindlll i Sali, dając plazmid pjca097. Fragmenty B i D zostały połączone z wektorem pbluescript SK+ uprzednio strawionym za pomocą BamHI i Hindlll, dając plazmid pjca099. Plazmid pjc097 został strawiony za pomocą Pstl i Sali w celu izolacji fragmentu Pstl-Sall o wielkości 200 par zasad (zawierającego kasetę H6 - część 5' gc) = fragment E. Plazmid pfhv1ecorif został strawiony za pomocą BamHI i Sali w celu izolacji fragmentu Sall-BamHI o wielkości 600 par zasad (druga środkowa część gc FHV-1) = fragment F. Fragmenty E i F zostały połączone za pomocą wektora Bluescript SK+ uprzednio strawionego za pomocą BamHI i Pstl, dając plazmid pjca098.

11 PL B1 11 Plazmid pjca098 został następnie strawiony za pomocą EcoRI i BamHI w celu izolacji fragmentu EcoRI-BamHI o wielkości 820 par zasad (zawierającego kasetę H6 - część 5' gc FHV-1) = fragment G. Plazmid pjca099 (patrz powyżej) został strawiony za pomocą BamHI i Hindlll w celu izolacji fragmentu BamHI-Hindlll o wielkości 960 par zasad (zawierającego część 3' genu gc FHV-1) = fragment H. Fragmenty G i H zostały następnie połączone za pomocą wektora pbluescript SK+ uprzednio strawionego za pomocą EcoRV i Hindlll, dając plazmid pjca100 (zawierający kasetę ekspresji H6 promotora wirusa ospy krowiej - gen gc FHV-1). Plazmid pjca100 został strawiony Nrul i EcoRI w celu izolacji fragmentu NruI-EcoRI o wielkości 1650 par zasad, zawierającego część 3' promotora H6 połączoną z genem gc FHV-1. Fragment ten został połączony z plazmidem pjca053 (kaseta VQH6-IBV M w wektorze pbluescript SK+), uprzednio strawionym za pomocą Nrul i EcoRI, dając plazmid pjca108 (zawierający kasetę VQH6-gC w pbluescript SK+). Plazmid pjca079 (patrz wyżej) został strawiony Smal i BatnHI w celu izolacji fragmentu BatnHI-Smal o wielkości 840 par zasad (zawierającego kasetę I3L-część 5' genu gb FHV-1) = fragment A. Plazmid pjca079 został również strawiony za pomocą BamHI i Hindlll w celu izolacji fragmentu BamHI-Hindlll o wielkoci 2155 par zasad (zawierającego część 3' genu gb FHV-1) = fragment B. Plazmid pj-ca108 (patrz wyżej) został strawiony za pomocą Hindlll i Eco-RI w celu izolacji fragmentu Hindlll-EcoRI o wielkości 1830 par zasad (zawierającego kasetę VQH6-gC FHV-1) = fragment C. Plazmid pjca080 (patrz wyżej) został strawiony za pomocą Eco-RI i Xhol w celu izolacji fragmentu Eco- -RI-XhoI o wielkości 1275 par zasad (zawierającego kasetę 42K- gen gd FHV-1) = fragment D. Fragmenty A, B, C i D zostały następnie połączone za pomocą plazmidu donorowego pc6l, dając plazmid pjca109. Plazmid ten zawiera kasety ekspresji H6-FHV-1 gen gc, I3L-FHV-1 gen gb i 42K--FHV-1 gen gd w miejscu C6 wirusa ALVAC. Struktura tego plazmidu potwierdzona została za pomocą sekwencjonowania i kompletnej mapy restrykcyjnej. Plazmid ten jest plazmidem donorowym do insercji kasety ekspresji H6-FHV-1 genu gc, I3L- -FHV-1 genu gb i 42K-FHV-1 genu gd w miejsce C6 wirusa ALVAC. Po linearyzacji za pomocą Notl, plazmid pjca109 wykorzystany był jako plazmid donorowy do rekombinacji in vitro (Piccini et al. Methods in Enzymology. 1987, 153, ) z wirusem ALVAC w celu wytworzenia wirusa rekombinowanego, oznaczonego vcp243. P r z y k ł a d 8. Adiuwant Karbomer wykorzystywany w szczepionkach opisanych w niniejszym wynalazku to Carbopol 974P produkowany przez firmę BF Goodrich (masa atomowa około 3 miliony). Roztwór podstawowy zawierający 1,5% wag/obj. Carbopol 974P został najpierw przygotowany przy użyciu wody destylowanej zawierającej chlorek sodu w ilości 1 g/l. Roztwór podstawowy był następnie wykorzystywany do wytwarzania roztworu Carbopol w soli fizjologicznej w ilości 4 mg/ml. Roztwór podstawowy wlewany był do całej ilości soli fizjologicznej (lub do jej większej części) jednorazowo lub w porcjach. Za każdym razem dokonywano wyrównania ph do wartości 7,3-7,4 za pomocą roztworu NaOH (na przykład 1N lub bardziej stężonego). W ten sposób otrzymywany jest gotowy do użycia Carbopol, który może być następnie stosowany przez użytkownika końcowego do rekonstytucji liofilizowanej szczepionki. P r z y k ł a d 9. Szczepienie koni za pomocą zrekombinowanego wektora vcp132 wirusa ospy kanarków (patrz przykład 6) wyrażającego glikoproteiny gb, gc i gd wirusa opryszczki końskiej typu 1 (EHV-1) 1. Protokół immunizacji i prowokacji 20 kucyków (rasy walijskiej, górskiej) nie wykazujących oznak serologicznych wskazujących na niedawny kontakt z wirusem EHV-1 lub EHV-4 zostało podzielonych losowo na 4 grupy (A do D) po 5 kucyków. Grupy A i B zostały zaszczepione z pomocą zrekombinowanego wektora vcp132 wirusa ospy kanarków wyrażającego glikoproteiny gb, gc i gd wirusa opryszczki końskiej typu 1 (EHV-1) szczepu Kentucky D. Szczepionka została zrekonstytuowana w sterylnej wodzie (grupa A) lub w roztworze karbomeru 4 mg/ml (grupa B), przygotowanego zgodnie z przykładem 8. Grupa C została zaszczepiona dostępną w handlu inaktywowaną pełną szczepionką EHV zawierającego w ilości 1,5 ml inaktywowane patogeny EHV-1 i EHV-4 i 6 mg karbomeru. Grupa D jest grupą kontrolną, w której zwierzęta zostały zaszczepione za pomocą zrekombinowanego wektora vcp1502 wirusa ospy kanarków powodującego ekspresję glikoproteiny HA wirusa grypy A/equi-1/Praga 56 (patrz przykład 3) zrekonstytuowanego w karbomerze w takich samych warunkach jak grupa B. Szczepionki zostały szczegółowo opisane w tabeli nr 1.

12 12 PL B1 T a b e l a 1 Grupa Szczepionka Antygeny Rozpuszczalnik/adiuwant Dawka (1 ml) A vcp132 EHV-1 sterylna woda TCI D 50 B vcp132 EHV-1 Carbopol 974P TCI D 50 C szczepionka komercyjna EHV-1, EHV-4 Carbopol TCI D 50 przed inaktywacją EHV-1; TCI D 50 przed inaktywacją EHV-4 D vcp1502 HA- Praga 56 Carbopol 974P 10 8 ' TCI D 50 Każde zwierzę otrzymało 1 dawkę szczepionki odpowiednio dla dnia 0 i dnia 35, przez głęboki zastrzyk domięśniowy w kark. W dniu 56 kucyki poddane zostały prowokacji przez donosowe podanie 10 5 TCID 50 wirusa EHV-1 szczepu Ab4/8. 2. Badania serologiczne Testy neutralizacji SN zostały przeprowadzone zgodnie z techniką opisaną przez Thompson et al., Equine Vet. J., 8, 58-65, Jako antygenu użyto wirusa EHV-1 (RACH). Miana SN zostały wyrażone jako odwrotność rozcieńczenia serum dającego 50% neutralizację (log 10 ). 3. Kontrola wirologiczna Ekspresja wirusa monitorowana była codziennie przez 10 dni przy użyciu wacików nosowo- -gardłowych, które wkładane były do podłoża do transportowania wirusów. Ekstrakty z wacików były miareczkowane na komórkach nerki królika RK13 w płytkach testowych. Miana obliczane były przy użyciu wzoru Karber wyrażonego w log 10 TCID 50 na 1 ml. 4. Wyniki Po szczepieniach nie zaobserwowano większej lokalnej ani systemowej reakcji. Średnia odpowiedź przeciwciał w neutralizowanym serum wynosiła (log 10 z rozcieńczenia powodującego 50% neutralizację): Grupa Miano w dniu 0 Miano w dniu 56 (przed prowokacją) A 1,69 ± 0,49 1,93 ± 0,15 B 1,69 ± 0,47 2,61 ± 0,42 C 1,19 ± 0,30 2,47 ± 0,32 D 1,57 ± 0,45 1,55 ± 0,37 Znaczne podwyższenie miana przeciwciał obserwowane jest w przypadku szczepionki vcp132 w karbomerze. Wszystkie kucyki kontrolne wydalają wirusa przez nos i gardło. Wydalanie wirusa u tych nie szczepionych kucyków trwało średnio 5 dni, a maksymalne wydalanie pojawiało się 4 dni po infekcji. Wszystkie kucyki w grupach A, C i D wydalały wirusa po prowokacji. Jednak tylko dwa kucyki spośród 5 z grupy B zaszczepionych zgodnie z wynalazkiem, wydalały wirusa. Poza tym, ilość wirusa wydalanego w grupie B jest znamiennie niższa niż ilość wydalana przez inne grupy, łącznie z grupą C. Podobnie, czas trwania wydalania u zwierząt w grupie B jest o wiele krótszy niż w innych grupach. Wyniki zobrazowane na figurze 1 i obszar pod krzywą wartości przedstawioną poniżej pokazują bardzo wyraźnie brak wydalania wirusa u kucyków zaszczepionych za pomocą vcp132 w obecności karbomeru. Wynik jest bardzo istotny, jeśli porówna się go w szczególności ze szczepionką dostępną w handlu. Znamienne obniżenie wydalania wirusa obserwowane jest u zwierząt w grupie B w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, podczas gdy pomiędzy zwierzętami w grupie C i zwierzętami kontrolnymi nie obserwuje się różnicy znamiennej statystycznie. Obniżenie wydalania wirusa o tak nieoczekiwany procent jest szczególnie przydatne, ponieważ pozwala ono ograniczyć rozprzestrzenianie się choroby z konia na konia. Całkowita ilość wirusa na kucyka (powierzchnia pod krzywą): A: 17,1 B: 3,0 C: 9,7 D: 16,3

13 PL B1 13 P r z y k ł a d 10. Szczepienie koni za pomocą zrekombinowanego wektora vcp1533 wirusa ospy kanarków (patrz przykład 5) powodującego ekspresję glikoproteiny HA wirusa grypy A/equi-2/- -/Newmarket/2/93 w obecności karbomeru 1. Protokół immunizacji i prowokacji Do testu wykorzystano 20 kucyków (rasy walijskiej, górskiej), w wieku 7-8 miesięcy, nie wykazujących obecności przeciwciał przeciw wirusom H3N8 i H7N7, sprawdzanej za pomocą pojedynczej radialnej hemolizy (SRH). Negatywny wynik badania SRH pozwala przestudiować w najlepszych warunkach wydajność różnych szczepionek pod względem odpowiedzi humoralnej. Kucyki zostały podzielone losowo na 4 grupy (A do D) składające się z 5-6 kucyków. Kucyki w grupie A były szczepione za pomocą rekombinowanego wirusa ospy kanarków (vcp1533) wywołującego ekspresję glikoproteiny HA wirusa grypy A/equi-2/Newmarket/2/93. Szczepionka ta została rozpuszczona w roztworze zawierającym 4 mg/ml karbomeru Carbopol 974P. Grupa B została zaszczepiona za pomocą dostępnej komercyjnie szczepionki zawierającej w dawce o objętości 1,5 ml, mieszaninę 3 inaktywowanych szczepów grypy, tj. Praga/56, Suffolk/89 i Miami/63, anatoksynę tężca oraz karbomer (4 mg) oraz wodorotlenek glinu (2,2 mg) jako adiuwanty. Grupa C została zaszczepiona za pomocą szczepionki C zawierającej 2 inaktywowane patogeny grypy tj. Praga/56, Newmarket/2/93 oraz anatoksynę tężca i wodorotlenku glinu. Grupa D została zaszczepiona za pomocą rekombinowanego wektora wirusa ospy kanarków vcp132 zrekonstytuowanego w roztworze zawierającym 4 mg/ml karbomeru 974P. Ostatnia grupa służyła jako kontrola dla prowokacji. Szczepionki opisano dokładnie w tabeli 2. T a b e l a 2 Grupa Szczepionka Antygeny Rozpuszczalnik/adiuwant Dawka (1 ml) A vcp1533 Carbopol 974P TCI D 50 B szczepionka komercyjna Praga/ 56; Suffolk/89; Miami/63; anatoksyna tężca C szczepionka C Praga/ 56; HA-Newmarket/2/93; anatoksyna tężca Carbopol Al(OH) 3 Al(OH) 3 15 μg HA każdego szczepu 15 μg HA każdego szczepu D vcp132 gb, gc, gd EHV-1 Carbopol 974P TCI D 50 2 dawki 1 ml każdej szczepionki zostały podane każdemu zwierzęciu w odstępie 5 tygodni przez głęboki zastrzyk domięśniowy w kark. 2 tygodnie po drugim szczepieniu każdy kucyk został zainfekowany przez kontakt z aerozolem otrzymanym z około 20 ml płynu omoczniowego i EID 50 wirusa grypy A-equi-2-/Sussex/89, przy użyciu urządzenia rozpryskującego ULTRA 2000 (De Villbiss, Somerset PA), jak to opisał Mumford et al., Equine Vet, J., 22: 93-98, Testy serologiczne Próbki pełnej krwi pobierane były w następujące dni: 0 (w dniu pierwszego szczepienia, przed szczepieniem), 7, 14, 35 (w dniu drugiego szczepienia, przed szczepieniem), 49 (w dniu prowokacji, przed prowokacją), 56 i 63. Serum przygotowane zostało i przechowywane było do momentu użycia w zamrożeniu w temp. -20 stopni C. Wszystkie surowice przetestowane zostały pod względem przeciwciał SRH przeciw grypie A/equi-l/Praga/56 i A/equi-2/Newmarket/2/93, jak to opisał Wood et al. (J. Hyg., 90: , 1983). Średnice obszarów hemolizy zostały zmierzone w dwóch kierunkach pod kątem prostym, przy użyciu miernika automatycznego. Pole powierzchni obszarów zostało obliczone, a różnica 50% uważana była za znamienną. Miana wyrażone zostały w mm 2 hemolizy. 3. Kontrola wirologiczna Wydalanie wirusa monitorowane było codziennie przez 10 dni przy użyciu wacików nosowo- -gardłowych, które wkładane były do podłoża do transportowania wirusów. Wysięk z każdego wacika rozcieńczany był przez 10-krotne seryjne rozcieńczenia w PBS przy ph 7,2 i 0,1 ml każdego roztworu nakładane było na obszar omoczni 10-dniowych jaj. Miano wirusa ((EID 50 /ml) w ekstraktach z wacików obliczone zostało z aktywności hemaglutynizacyjnej w płynie omoczniowym zebranym po inkubacji jaj w temperaturze 34 stopnie C przez 72 godziny.