Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA

Transkrypt

1 Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA 1. Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gilberta 1977) 2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA - klasyczna metoda Sangera (Sanger i wsp. 1977) Obydwie metody sprowadzają się do uzyskania puli (zbioru) cząsteczek DNA zakończonych określonym nukleotydem A, C, G lub T, różniących się długością o 1 nt 3. Metody sekwencjonowania odmienne od tradycyjnych (tj. klasycznej metody Sangera) Metody określane jako NGS next generation sequencing: np. takie w których nie używa się ddntp np. pirosekwencjonowanie

2 2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA metoda Sangera (metoda dideoksy) do uzyskania cząsteczek DNA zakończonych określonym nukleotydem A, C, G lub T stosuje się syntezę cząsteczek DNA in vitro Opiera się na wykorzystaniu ddntp (3 dideoksynukleotydów, pozbawionych grupy hydroksylowej na końcu 3 ), które polimeraza DNA może wbudowywać w syntetyzowaną nić DNA Wbudowanie ddntp sprawia, że łańcuch DNA nie może być dalej wydłużany, czyli ddntp działa jak terminator syntezy DNA. Materiałem wyjściowym (w oryginalnej metodzie) było jednoniciowe - ssdna fragment DNA do sekwencjonowania trzeba było sklonować do wektora, który umożliwia otrzymanie ssdna np. fagowego M13 lub fagemidu)

3 Jak długi fragment (czyli ile nukleotydów) można było przeczytać w pojedynczej reakcji? Na standardowym 6% żelu poliakrylamidowym można odczytać kolejność kilkuset nukleotydów (ok. 650 nt)

4 Modyfikacje metody Sangera umożliwiające automatyzację procesu sekwencjonowania DNA wybór optymalnej polimerazy DNA zamiana 33 P na 35 S do znakowania dntp (ostrzejsze prążki, lepsze odczyty sekwencji wczesne lata 80-te) wprowadzenie do znakowania dntp barwników fluorescencyjnych zastosowanie ddntp znakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi automatyczny sekwenator DNA LI-COR (koniec lat 80-tych)

5 Polimeraza do sekwencjonowania musi spełniać trzy warunki: 1. Wysoka procesywność zdolność syntezy odpowiednio długiego odcinka DNA i oddysocjowanie dopiero po włączeniu ddntp 2. Brak aktywności egzonukleazy 5-3 (lub nieznaczna taka aktywność) zdolność zastępowania istniejącego łańcucha DNA zjawisko niekorzystne w sekwencjonowaniu, ponieważ usuwanie nukleotydów z końca 5 nowosyntetyzowanego łańcucha skraca go uniemożliwiając odczytanie prawidłowej sekwencji z wzoru prążków po autoradiografii 3. Brak aktywności egzonukleazy 3-5 (lub nieznaczna taka aktywność) aktywności korektorskej polimeraza pozbawiona tej aktywności nie usuwa wbudowanych ddntp kończących łańcuch po ich włączeniu Fragment Klonowa pochodna pol DNA I E. coli, pozbawiona aktywność exo 5-3 WADA: ma niską procesywność Sekwenaza: zmodyfikowana polimeraza faga T7 (1987) wysoka procesywność, brak aktywności egzonukleolitycznej, dodatkowy atut to duża szybkość przeprowadzonej reakcji.

6 Modyfikacje metody Sangera umożliwiające automatyzację procesu sekwencjonowania DNA wybór optymalnej polimerazy DNA zamiana 33 P na 35 S do znakowania dntp (ostrzejsze prążki, lepsze odczyty sekwencji wczesne lata 80-te) wprowadzenie do znakowania dntp barwników fluorescencyjnych zastosowanie ddntp znakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi+ reakcja PCR do syntezy cząsteczek DNA automatyczny sekwenator DNA LI-COR (koniec lat 80-tych)

7 Sekwencjonowanie automatyczne (cykliczne ) Zasada reakcji pozostaje bez zmian opiera się na syntezie DNA z użyciem ddntp Zmiana dotyczy sposobu przeprowadzenia syntezy DNA: wykorzystuje się reakcję PCR i termostabilną polimerazę Taq (a właściwie jej zmodyfikowaną wersję, w której Phe z centrum aktywnego zastąpiono Tyr, co znacznie zmniejszyło dyskryminację ddntp przez polimerazę Otrzymaną pulę cząsteczek zakończonych określonym nukleotydnem analizuje się albo przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym albo elektroforezę kapilarną Zalety w stosunku do metody oryginalnej metody Sangera: Możliwość stosowania dsdna jako matrycy, np. plazmidowego, genomowego DNA łatwość przygotowania matrycy (nie trzeba klonować odcinka DNA przed sekwencjonowaniem do jakiegokolwiek wektora) Dzięki zastosowaniu reakcji PCR sekwencjononowania wystarcza bardzo mała ilość matrycowego DNA

8 Reakcja cyklicznego sekwencjonowania przebiega podobnie do reakcji PCR, ale wykorzystuje się w niej tylko jeden starter syntetyzowana jest tylko jedna nić analizowanej cząsteczki matrycowego dsdna - asymetryczny PCR (często jest on dodatkowo dwustopniowy dla podniesienia wierności amplifikacji) Cztery różne kolory fluoroforów, którymi wyznakowane są ddntp, oznacza układ: 1 matryca=1 reakcja a to daje możliwość analizy większej ilości próbek na jednym żelu Każdy z ddntp wyznakowany jest innym fluoroforem, co umożliwia prowadzenie reakcji w jednej próbówce 1 matryca = 1 reakcja

9 Do sekwencjonowania genomów potrzebna jest wysoka przepustowość użytych technik Problem: czy można odczytać sekwencje odcinka DNA długości kilkuset kpz w jednej reakcji enzymatycznej? 1. Sekwencjonowanie klonów biblioteki genomowej z dużymi wstawkami poprzez podklowanie fragmentów restrykcyjnych do zwykłych wektorów np. plazmidowych

10 2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem wędrówki starterów (primer walking) fragment genomowego DNA

11 2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem wędrówki starterów (primer walking)

12 3. Metody określane jako NGS next generation sequencing: Co je wyróżnia? nie używa się ddntp ogromna przepustowość (ang. highthroughput) w większości oparte na syntezie cząsteczek DNA

13 Pirosekwencjonowanie sekwencjonowanie przez syntezę DNA Nie używa się ddntp, w czasie reakcji rejestruje się kolejność wbudowywania nukleotydów w trakcie syntezy nowej nici Wbudowanie nukleotydu rejestruje się jako błysk chemiluminescencji indukowany przez pirofosforan, który uwalnia się z dntp.

14 Pirosekwencjonowanie schemat reakcji

15 Efekt pirosekwencjonowania odczyt sekwencji - flowgram