Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

Transkrypt

1 Nr kat. PK25N Wersja zestawu: Zestaw do wykrywania spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych dwie oddzielne reakcje PCR 2x50 reakcji PCR (50 µl), włączając w to kontrole Zestaw diagnostyczny PCR umożliwia detekcję pasożytniczych pierwotniaków z rodzaju oraz Theileria (piroplazmy) przenoszonych przez kleszcze. Detekcja oparta jest na amplifikacji genu kodującego podjednostkę 18S rybosomalnego RNA (18S rrna). Nested PCR polega na przeprowadzeniu dwóch kolejnych reakcji PCR. W pierwszej reakcji wykorzystywana jest jedna para primerów. Powstały produkt PCR o wielkości ok pz może, ale nie musi być wykryty w żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Ten produkt PCR stanowi matrycę w następnej reakcji, gdzie stosowana jest druga para primerów, komplementarnych do miejsc wewnątrz produktu 1700 pz. Tak powstaje produkt 559 pz, który dla próbki pozytywnej powinien być widoczny w żelu agarozowym. ZESTAW O PRZEDŁUŻONEJ TRWAŁOŚCI W tym zestawie deoksynukleotydy (dntps) dostarczane są osobno. Gwarancja na ZESTAW O PRZEDŁUŻONEJ TRWAŁOŚCI wynosi 12 miesięcy. ZALECANA POLIMERAZA Zalecane jest użycie dołączonej polimerazy termostabilnej TaqNova (DNA-Gdańsk). BLIRT S.A., ul. Trzy Lipy 3/1.38, Gdańsk, T: F: E: info@dnagdansk.com

2 1. SKŁAD ZESTAWU 5 probówek Master Mix PCR-OUT do wstępnej amplifikacji (na 10 reakcji PCR każda) 5 probówek Master Mix PCR-IN do reamplifikacji (na 10 reakcji PCR każda) 10 probówek mieszaniny dntps 8 mm (na 10 reakcji PCR każda) Termostabilna polimeraza DNA TaqNova (DNA-Gdańsk) Kontrola pozytywna DNA (na 10 amplifikacji; pakowana oddzielnie) Marker DNA M (DNA-Gdańsk) o wielkościach fragmentów: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 pz (na 20 ścieżek elektroforetycznych) 2. PRZECHOWYWANIE ZESTAWU PCR Master Mix należy przechowywać w temp. -20C przez dłuższy okres czasu. Po rozmrożeniu mieszaninę można przechowywać w lodówce (+4C). Należy unikać częstego zamrażania i rozmrażania próbek. Deoksynukleotydy (dntps) należy przechowywać w temp. -20C i rozmrażać tylko bezpośrednio przed użyciem. Transport w suchym lodzie. Termostabilną polimerazę DNA należy przechowywać w temp. -20C. Matrycowe DNA (kontrole pozytywne) należy przechowywać w temp. - 20C przez dłuższy okres czasu. Po rozmrożeniu preparat można przechowywać w lodówce (+4C). Należy unikać częstego zamrażania i rozmrażania próbki. Marker DNA można przechowywać w temp. pokojowej lub w lodówce (+4C). W wypadku przechowywania przez dłuższy okres zalecane jest przechowywanie w temp. -20C, ale należy unikać częstego zamrażania i rozmrażania preparatu. 3. IZOLACJA DNA

3 Nr kat. PK25N Izolacja genomowego DNA z kleszcza. Jeśli kleszcz przechowywany był w jakimkolwiek preparacie utrwalającym należy dokładnie przemyć go w roztworze TE (10 mm Tris ph 8.0, 1 mm EDTA). Następnie należy kleszcza rozerwać lub poddać obróbce wg protokołu polecanego przez nas zestawu do izolacji DNA z tkanek: EXTRACTME DNA TISSUE Kit (EM03-050, EM03-150, EM03-250) lub EXTRACTME DNA TISSUE PLUS Kit (EM04-050, EM04-150, EM04-250). Izolacja genomowego DNA z krwii świeżej lub mrożonej wg protokołu dołączonego do polecanego przez nas zestawu: EXTRACTME DNA BLOOD (EM05-050, EM05-150, EM05-250). Izolacja DNA z hodowli komórkowej. Postępować dokładnie wg protokołu dołączonego do polecanego przez nas zestawu: EXTRACTME DNA BACTERIA Kit (EM11-050, EM11-150, EM11-250). 4. PRZYGOTOWANIE WSTĘPNEJ REAKCJI PCR (PCR-OUT) Należy pamiętać o zwirowaniu probówek z odczynnikami po rozmrożeniu, tak aby całość mieszaniny znalazła się na dnie probówki!!! Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla 1 próbki badanej: 43 µl Master Mix 1 µl DNA (otrzymanego wg protokołu pkt. 3) 1 µl polimerazy DNA TaqNova Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej kontroli pozytywnej: 43 µl Master Mix 1 µl DNA kontroli pozytywnej 1 µl polimerazy DNA TaqNova Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej kontroli negatywnej: 43 µl Master Mix 1 µl jałowej wody 1 µl polimerazy DNA TaqNova Warunki amplifikacji

4 2 min 95C (wstępna denaturacja) 45 s 95C (denaturacja) 45 s 58C (dołączanie primerów) 90 s 72C (elongacja) 5 min 72C (wydłużanie końcowe) 40 cykli Uwagi: Układ jest bardzo czuły, ale przez to niezmiernie wrażliwy na kontaminacje (patrz sekcja 8.). Aby ograniczyć liczbę błędów, należy w każdym badaniu uwzględnić zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne prawidłowości przebiegu reakcji amplifikacji DNA. Kontrola negatywna (ujemna) reakcji PCR jest to próbka poddana PCR, która nie zawiera w swoim składzie DNA matrycowego. Kontrola pozytywna (dodatnia) reakcji PCR jest to próbka zawierająca w swoim składzie DNA kontrolne właściwej matrycy, dająca po amplifikacji specyficzny produkt reakcji. W przypadku większej ilości oznaczeń należy pomnożyć ilości µl składników PCR Master Mix, deoksynukleotydów i polimerazy DNA przez liczbę wykonywanych prób plus jedna. Np.: dla 9 próbek (7 próbek klinicznych, 1x kontrola pozytywna DNA oraz 1x kontrola negatywna) należy przygotować mieszaninę reakcyjną w następujący sposób: do probówki typu Eppendorf dodać: 43 µl 10 (9+1) = 430 µl Master Mix 5 µl 10 (9+1) = 50 µl mieszaniny 8mM dntps 1 µl 10 (9+1) = 10 µl polimerazy DNA TaqNova Wymieszać tipsem, rozporcjować po 49 µl do 9 wcześniej przygotowanych probówek reakcyjnych. Można zastosować każdy rodzaj komercyjnie dostępnej termostabilnej polimerazy DNA, jednakże rekomendowana jest polimeraza DNA TaqNova produkowana przez firmę DNA-Gdańsk. 5. DETEKCJA PRODUKTÓW AMPLIFIKACJI PCR-OUT

5 Nr kat. PK25N Próbki poddawane elektroforezie agarozowej (1,5% żel, standardowe warunki elektroforezy): 1. 2 µl barwnika (polecamy 6xGreen - AG18, 6xOrange - AG17, 6xBlue AG16, 6xViolet AG15) i 10 µl markera DNA M µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR badanej próbki 3. 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej 4. 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli negatywnej Interpretacja wyników: W wypadku obecności w żelu produktu PCR o wielkości ok pz wynik testu jest pozytywny. W celu potwierdzenia specyficzności produktu można przeprowadzić reamplifikację PCR-IN (uwaga: wskutek dużego stężenia produktu PCR reamplifikacja może się nie powieść). W tym przypadku produkt PCR (stanowiący matrycę do następnej reakcji) należy rozcieńczyć, co najmniej 100 razy. Jeżeli sygnał po pierwszej reakcji jest bardzo słaby należy przeprowadzić reakcję reamplifikacji dla potwierdzenia wyniku. Jeśli po reakcji PCR-OUT produkt 1700 pz jest niewidoczny w żelu agarozowym, należy przeprowadzić reakcję PCR-IN bez rozcieńczania mieszaniny po reakcji PCR-OUT. Produkt PCR kontroli pozytywnej należy rozcieńczyć również co najmniej 100 razy, a następnie wykorzystać do przygotowania kontroli pozytywnej w przeprowadzanej reakcji reamplifikacji (PCR-IN). 6. PRZYGOTOWANIE REAKCJI REAMPLIFIKACJI PCR (PCR-IN) Należy pamiętać o zwirowaniu probówek z odczynnikami po rozmrożeniu, tak aby całość mieszaniny znalazła się na dnie probówki!!! Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla 1 próbki badanej: 42,5 µl Master Mix 2 µl produktu PCR-OUT 0,5 µl polimerazy DNA TaqNova Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej kontroli pozytywnej: 42,5 µl Master Mix 2 µl DNA rozcieńczonego produktu PCR-OUT kontroli pozytywnej

6 0,5 µl polimerazy DNA TaqNova Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej kontroli negatywnej: 42,5 µl Master Mix 2 µl produktu PCR-OUT kontroli negatywnej 0,5 µl polimerazy DNA TaqNova Warunki amplifikacji 2 min 94C (wstępna denaturacja) 30 s 94C (denaturacja) 30 s 48C (dołączanie primerów) 45 s 72C (elongacja) 5 min 72C (wydłużanie końcowe) 40 cykli Uwagi: Układ jest bardzo czuły, ale przez to niezmiernie wrażliwy na kontaminacje (patrz sekcja 8.). Aby ograniczyć liczbę błędów, należy w każdym badaniu uwzględnić zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne prawidłowości przebiegu reakcji amplifikacji DNA. Kontrola negatywna (ujemna) reakcji PCR jest to próbka poddana PCR, która nie zawiera w swoim składzie DNA matrycowego. Kontrola pozytywna (dodatnia) reakcji PCR jest to próbka zawierająca w swoim składzie DNA kontrolne właściwej matrycy, dająca po amplifikacji specyficzny produkt reakcji. W przypadku większej ilości oznaczeń należy pomnożyć ilości µl składników PCR Master Mix, deoksynukleotydów i polimerazy DNA przez liczbę wykonywanych prób plus jedna. Np.: dla 9 próbek (7 próbek klinicznych, 1x kontrola pozytywna DNA oraz 1x kontrola negatywna) należy przygotować mieszaninę reakcyjną w następujący sposób: do probówki typu Eppendorf dodać: 42,5 µl 10 (9+1) = 425 µl Master Mix 5 µl 10 (9+1) = 50 µl mieszaniny 8mM dntps 0,5 µl 10 (9+1) = 5 µl polimerazy DNA TaqNova Wymieszać tipsem, rozporcjować po 48 µl do 9 wcześniej przygotowanych probówek reakcyjnych.

7 Nr kat. PK25N Można zastosować każdy rodzaj komercyjnie dostępnej termostabilnej polimerazy DNA, jednakże rekomendowana jest polimeraza DNA TaqNova produkowana przez firmę DNA-Gdańsk. 7. DETEKCJA PRODUKTÓW AMPLIFIKACJI PCR-IN Próbki poddawane elektroforezie agarozowej (2% żel, standardowe warunki elektroforezy): 5. 2 µl barwnika (polecamy 6xGreen - AG18, 6xOrange - AG17, 6xBlue AG16, 6xViolet AG15) i 10 µl markera DNA M µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR badanej próbki 7. 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej 8. 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli negatywnej Wynik pozytywny testu: obecność w żelu produktu reakcji PCR o wielkości par zasad. Wynik negatywny testu: brak w żelu produktu reakcji PCR o wielkości par zasad. 8. ZAPOBIEGANIE KONTAMINACJOM Niewątpliwym zabezpieczeniem przed kontaminacją jest specjalna organizacja pracy. Zaleca się każdy z trzech etapów oznaczenia: izolację matryc (pre-pcr),

8 przygotowanie reakcji PCR oraz amplifikację wraz z elektroforezą produktów PCR (post-pcr) prowadzić w oddzielnych pomieszczeniach (ewentualnie w różnych oddzielonych częściach pomieszczenia). Szczególnie należy zwrócić uwagę na produkty PCR z poprzednich oznaczeń - one stanowią najbardziej niebezpieczne źródło kontaminacji. Nigdy nie należy przechowywać lub pracować z próbkami pozytywnymi kontrolnego DNA w pomieszczeniu pre-pcr. Należy zawsze pracować w fartuchach i używać jednorazowych rękawiczek. Do przygotowania reakcji PCR najlepiej używać pipet, które są autoklawowalne (co pewien czas należy je autoklawować). Zaleca się także używanie tipsów z filtrami. Najlepiej stosować oddzielne pipety do każdego etapu oznaczenia (izolacja, przygotowanie mieszaniny reakcyjnej, dodawanie matryc, nanoszenie na żel agarozowy). Zalecane jest nastawianie reakcji PCR pod wyciągiem laminarnym. Wskazana jest 30-minutowa sterylizacja pustych probówek reakcyjnych, statywów, pipet i tipsów pod lampą UV przed dodaniem mieszanin reakcyjnych. Należy pamiętać, aby nie naświetlać roztworów zawierających DNA, Master Mix, dntps i polimerazy. Należy przestrzegać zasady, że tylko jedna probówka może być otwarta w danym momencie. Dzięki temu zmniejsza się ryzyko przenoszenia kontaminacji przez powietrze. Ponadto należy unikać dotykania krawędzi probówek. Kontrolę negatywną najlepiej dodawać jako pierwszą, kontrolę pozytywną jako ostatnią. Poważnym źródłem zanieczyszczeń może być autoklaw, szczególnie gdy jest on stosowany do sterylizacji komórkowego materiału hodowlanego. Stąd, zalecane jest stosowanie osobnego autoklawu przeznaczonego tylko do sterylizacji wyposażenia i roztworów potrzebnych do czynności pre-pcr. Należy wykonać próbę, gdzie w miejsce matrycy dodajemy jałową wodę (PCRgrade) kontrola negatywna. Wynik negatywny wskazuje, że zestaw nie został skontaminowany. Po rozdziale elektroforetycznym, w kontroli negatywnej nie mogą nigdy pojawić się prążki o wielkości ok. 1700pz lub 559 pz. Jeśli się pojawią zalecane jest powtórzenie oznaczeń. Należy starannie nanosić próbki na żel, aby produkt PCR z próby pozytywnej nie przepłynął do ścieżki kontroli negatywnej.