II. OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI I BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY METODĄ PŁYTKOWĄ W ŻYWNOŚCI I INNYCH PRODUKTACH wg PN-ISO 4832: 2007

Transkrypt

1 Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Mikrobiologia ogólna Biotechnologia medyczna II rok / I o Temat: Żywność jako środowisko życia mikroorganizmów. Analiza mikrobiologiczna Cz.1/Cz.2/Cz.3 CZEŚĆ TEORETYCZNA 1. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne surowców. 2. Techniki pobierania próbek żywności do badań mikrobiologicznych, ich transport i przechowywanie. CZEŚĆ PRAKTYCZNA I. OZNACZANIE LICZBY MIKROORGANIZMÓW METODĄ PŁYTKOWĄ W TEMPERATURZE 30 o C wg PN-EN ISO 4833: 2004 Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby mikroorganizmów w większości produktów żywnościowych i paszach oraz innych matrycach pod warunkiem wykazania jej przydatności. wyjściowej przy użyciu Przenieść do sterylnych płytek Petriego po 1 ml próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej w przypadku produktów stałych. Następnie wlać po ok. 15 ml pożywki (Agar M), schłodzonej do temp o C i delikatnie wymieszać materiał z pożywką. Na każde przygotowane rozcieńczenie użyć co najmniej po dwie płytki. Uwaga! W przypadku przewidywania, że produkt zawiera drobnoustroje tworzące na powierzchni pożywki rozlane kolonie, zalać posiana pożywkę 4 ml agaru wodnego i pozostawić do zestalenia. płytki odwrócone denkiem do góry 30 ± 1 o C / 72 ± 3h Odczyt policzyć wszystkie kolonie, a w przypadku uzyskania wzrostu zlewnego traktować go jako pojedyncze kolonie Wynik końcowy podać jako liczbę mikroorganizmów w 1 ml lub 1 g badanej próbki zgodnie z normą PN-EN ISO 4833: II. OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI I BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY METODĄ PŁYTKOWĄ W ŻYWNOŚCI I INNYCH PRODUKTACH wg PN-ISO 4832: 2007 Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby bakterii z grupy coli w większości produktów spożywczych i paszach oraz innych matrycach pod warunkiem wykazania jej przydatności.

2 wyjściowej przy użyciu Przenieść po 1 ml z każdego rozcieńczenia do dwóch płytek Petriego i zalać 15 ml podłoża VRBL. Po zestaleniu wlać po ok. 4 ml pożywki VRBL 30, 37 o C (bakterie z grupy coli) lub 44 o C (bakterie z grupy coli typ fekalny) / 24 ± 2 h Odczyt policzyć wszystkie kolonie barwy ciemnopurpurowej na każdej płytce zawierającej mniej niż 150 charakterystycznych kolonii. W przypadku wystąpienia kolonii nietypowych należy dokonać potwierdzenia. W tym celu należy wybrać po pięć kolonii i posiać na pożywkę z laktozą, żółcią i zielenią brylantową 37 o C (bakterie z grupy coli i bakterie z grupy coli typ fekalny) / 24 ± 2 h Wynik końcowy podać jako liczba bakterii z grupy coli w 1 ml lub 1 g badanej próbki, zgodnie z normą PN-ISO 4832: III. OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI I BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY W ŻYWNOŚCI I INNYCH PRODUKTACH METODĄ NAJBARDZIEJ PRAWDOPODOBNEJ LICZBY wg PN-ISO 4831: 2007 Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby bakterii z grupy coli w większości produktów spożywczych i paszach oraz innych matrycach pod warunkiem wykazania jej przydatności. wyjściowej przy użyciu W zależności od systemu posiewu: 3x1g (ml), 3x0,1g (ml), 3x0,01g (ml) itd. lub 5x1g (ml), 5x0,1g (ml), 5x0,01g (ml) itd. przenieść po 10 ml zawiesiny wyjściowej do 2xstęzonej pożywki namnażająco-selektywnej. W przypadku posiewu 1 ml zawiesiny wyjściowej i kolejnych jej rozcieńczeń zastosować należy pożywkę 1xstężoną. 30 lub 37 ± 1 o C / 24 ± 2 h (48 ± 2 h) Po inkubacji z każdej dodatniej probówki (zmętnienie/gaz) pobrać hodowlę i przenieść do probówek z pożywką potwierdzająca 30 lub 37 ± 1 o C / 24 ± 2 h (48 ± 2 h) Odczyt za dodatni wynik należy uznać obecność zmętnienia lub gazu (obecność bakterii z grupy coli) W celu potwierdzenia obecności bakterii z grupy coli typ fekalny należy przenieść hodowlę z każdej dodatniej probówki z pożywką potwierdzającą grupę coli na agar Endo 44 ± 1 o C / 24 ± 2 h (48 ± 2 h) Odczyt za dodatni wynik należy uznać obecność ciemnoczerwonych kolonii często z metalicznym zielonozłotym połyskiem (obecność bakterii z grupy coli typ fekalny) Wynik końcowy podać jako NPL bakterii z grupy coli w 1 ml lub 1 g badanej próbki na podstawie tablic NPL, zgodnie z normą PN-ISO 4831: 2007.

3 IV. WYKRYWANIE I OZNACZANIE LICZBY ENTEROBACTERIACEAE wg PN-ISO : 2005 Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby Enterobacteriaceae w większości produktów spożywczych i paszach oraz próbkach środowiskowych z obszaru produkcji i obrotu żywnością. 4. wyjściowej przy użyciu Przenieść po 1 ml z każdego rozcieńczenia do dwóch płytek Petriego i zalać 10 ml podłoża VRBG. Po zestaleniu wlać po 15 ml pożywki VRBG 37 o C / 24 ± 2 h Odczyt policzyć wszystkie kolonie barwy różowej do purpurowej na każdej płytce zawierającej mniej niż 150 charakterystycznych kolonii Wykonać testy potwierdzające dla Enterobacteriaceae 1. Test na obecność oksydazy 2. Test na zdolność fermentacji 5. Kolonie, które są oksydazo-ujemne i glukozo-dodatnie uważa się za potwierdzone jako Enterobacteriaceae. Wynik końcowy podać jako liczba Enterobacteriaceae w 1 ml lub 1 g badanej próbki. V. OZNACZANIE LICZBY GRONKOWCÓW KOAGULAZO-DODATNICH W ŻYWNOŚCI METODĄ Z ZASTOSOWANIEM POŻYWKI AGAROWEJ BAIRD-PARKERA wg PN-EN ISO : PN-EN ISO : 2001/A1: 2004 Instrukcja wykonana na podstawie normy PN-EN ISO : PN-EN ISO : 2001/A1: Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphyloccocus aureus i innych gatunków). Część 1: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej Baird-Parkera. Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich w większości produktach spożywczych i paszach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta. wyjściowej przy użyciu Przenieść po 0,1 ml z każdego rozcieńczenia do dwóch płytek Petriego z podłożem Baird-Parkera i rozprowadzić inokulum na całej powierzchni podłoża 35 lub 37 o C±1 o C / 24±2 h (+ dodatkowe 24±2 h)

4 Odczyt: - Po 24 h: zaznaczyć na dnie płytki każdą typową kolonię. - Po 48 h: zaznaczyć wszystkie nowe typowe kolonie i kolonie nietypowe. Kolonie typowe: czarne lub szare, błyszczące i wypukłe (od 1 mm do 1,5 mm średnicy po inkubacji trwającej 24 h, i od 1,5 mm do 2,5 mm średnicy po inkubacji 48 h), otoczone przezroczysta strefą, która może być częściowo nieprzezroczysta. Po inkubacji co najmniej 24 h, w opalizującym pierścieniu, w kontakcie z koloniami może ukazywać się przezroczysta obwódka. Kolonie nietypowe: wykazują tę sama wielkość co typowe kolonie i mogą charakteryzować się następującymi cechami: czarne błyszczące kolonie z wąskim białym brzegiem lub bez niego; nieobecna lub słabo widoczna przezroczysta obwódka oraz nieobecny lub słabo widoczny opalizujący pierścień; lub są szare bez przezroczystej obwódki. Uwaga!: Wszystkie inne kolonie obecne na płytkach, które nie wykazują typowego lub nietypowego wyglądu należy uznać za mikroflorę towarzyszącą Potwierdzenie: Do potwierdzenia wybrać co najmniej po 5 typowych i nietypowych kolonii. Z każdej kolonii pobrać materiał i przenieść do probówki z bulionem mózgowo-sercowym. 35 lub 37 o C±1 o C / 24±2 h Test na koagulazę: Do probówek zawierających po 0,3 ml uwodnionej plazmy króliczej dodać po 0,1 ml hodowli na bulionie mózgowo-sercowym. 35 lub 37 o C±1 o C Odczyt: Dokonać odczytu po 4 do 6 h inkubacji. Za wynik pozytywny należy uznać, jeżeli objętość skrzepu wynosi więcej niż połowę początkowej objętości płynu. Uwaga!: Dla każdej partii plazmy należy wykonać negatywną próbę kontrolną, dodając 0,1 ml jałowego bulionu mózgowosercowego do zalecanej objętości plazmy i inkubować. Aby zapewnić prawidłowe wykonanie testu na koagulazę, stosowana plazma nie może wykazywać żadnych śladów skrzepów. Wynik podać zgodnie z Normą PN-EN ISO : PN-EN ISO : 2001/A1: 2004 jako liczbę gronkowców koagulazo-dodatnich w 1 ml lub 1 g badanej próbki. VI. OZNACZANIE LICZBY GRONKOWCÓW KOAGULAZO-DODATNICH W ŻYWNOŚCI METODĄ NPL wg PN-EN ISO : PN-EN ISO : 2004/AC: 2005 Instrukcja wykonana na podstawie normy PN-EN ISO : PN-EN ISO : 2004/AC: Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphyloccocus aureus i innych gatunków). Część 3: Wykrywanie obecności i oznaczanie liczby metodą NPL. Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich w większości produktach spożywczych i paszach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta oraz próbkach środowiskowych związanych z produkcją żywności. Przygotować zawiesinę wyjściową, a jako rozcieńczalnika użyć wyjściowej przy użyciu Zastosować system posiewu: 3x1g (ml), 3x0,1g (ml), 3x0,01g (ml). W tym celu przenieść po 10 ml zawiesiny wyjściowej do 2 x stężonej pożywki Giolitti-Cantoni. W przypadku posiewu 1 ml zawiesiny wyjściowej i kolejnych jej rozcieńczeń zastosować należy pożywkę 1xstężoną. Dokładnie wymieszać pożywkę z posianym materiałem i wprowadzić ostrożnie schłodzony agar, tak aby powstał uszczelniający korek i pozostawić do zestalenia.

5 37 o C±1 o C / 24±2 h Odczyt: Reakcja dodatnia: zaczernienie pożywki lub czarny osad. Z dodatnich probówek przenieść materiał na płytki Petriego z pożywką agarową Baird-Parkera W przypadku braku pozytywnych reakcji przedłużyć inkubację o dodatkowe 24±2 h i przesiać z pozostałych probówek w których stwierdzono lub nie stwierdzono reakcji pozytywnej 37 o C±1 o C / 24±2 h Odczyt:- Po 24 h: zaznaczyć na dnie płytki każdą typową kolonię. - Po 48 h: zaznaczyć wszystkie nowe typowe kolonie i kolonie nietypowe. Kolonie typowe: czarne lub szare, błyszczące i wypukłe (od 1 mm do 1,5 mm średnicy po inkubacji trwającej 24 h, i od 1,5 mm do 2,5 mm średnicy po inkubacji 48 h), otoczone przezroczysta strefą, która może być częściowo nieprzezroczysta. Po inkubacji co najmniej 24 h, w opalizującym pierścieniu, w kontakcie z koloniami może ukazywać się przezroczysta obwódka. Kolonie nietypowe: wykazują tę sama wielkość co typowe kolonie i mogą charakteryzować się następującymi cechami: czarne błyszczące kolonie z wąskim białym brzegiem lub bez niego; nieobecna lub słabo widoczna przezroczysta obwódka oraz nieobecny lub słabo widoczny opalizujący pierścień; lub są szare bez przezroczystej obwódki. Uwaga!: Wszystkie inne kolonie obecne na płytkach, które nie wykazują typowego lub nietypowego wyglądu należy uznać za mikroflorę towarzyszącą Potwierdzenie: Do potwierdzenia wybrać co najmniej po 5 typowych i nietypowych kolonii. Z każdej kolonii pobrać materiał i przenieść do probówki z bulionem mózgowo-sercowym. 35 lub 37 o C±1 o C / 24±2 h Test na koagulazę: Do probówek zawierających po 0,3 ml uwodnionej plazmy króliczej dodać po 0,1 ml hodowli na bulionie mózgowo-sercowym. 35 lub 37 o C±1 o C Odczyt: Dokonać odczytu po 4 do 6 h inkubacji. Za wynik pozytywny należy uznać, jeżeli objętość skrzepu wynosi więcej niż połowę początkowej objętości płynu. Uwaga!: Dla każdej partii plazmy należy wykonać negatywną próbę kontrolną, dodając 0,1 ml jałowego bulionu mózgowosercowego do zalecanej objętości plazmy i inkubować. Aby zapewnić prawidłowe wykonanie testu na koagulazę, stosowana plazma nie może wykazywać żadnych śladów skrzepów. Wynik podać zgodnie z Normą PN-EN ISO : PN-EN ISO : 2004/AC: 2005 jako NPL gronkowców koagulazo-dodatnich w 1 ml lub 1 g badanej próbki. VII. WYKRYWANIE PAŁECZEK SALMONELLA spp. wg. PN-EN ISO 6579: 2003 Instrukcja wykonana na podstawie normy PN-EN ISO 6579: 2003 Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp. Metoda ma zastosowanie do wykrywania obecności pałeczek Salmonella spp. w żywności i paszach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta, a także w próbkach środowiskowych związanych z produkcją i przetwórstwem żywności oraz próbkach naturalnych (osady, gleby, wszystkie rodzaje wód). Przednamnażanie Odważyć 25 g badanej próbki i przenieść do 225 ml zbuforowanej wody peptonowej (lub jej wielokrotność przy zachowaniu stosunku 1:9). W przypadku próbek wody należy przefiltrować 100 ml badanej próbki przez filtr membranowy o rozmiarach porów 45 µm, a następnie filtr umieścić w 225 ml zbuforowanej wody peptonowej. Podobnie postępować z wymazami z powierzchni i tusz zwierzą rzeźnych.

6 37 o C±1 o C / 18±2 h Selektywne namnażanie Po inkubacji przenieś 0,1 i 1 ml zawiesiny, odpowiednio, do pożywki RVS i MKTTn Pożywka RVS: 41,5 o C±1 o C / 24±3 h Pożywka MKTTn: 37 o C±1 o C / 24±3 h Posiew na selektywne podłoża agarowe Po inkubacji przy pomocy ezy przenieś hodowlę z każdej pożywki płynnej na podłoże BGA i podłoże XLD i dokonać posiewu redukcyjnego, tak aby uzyskać pojedyncze kolonie 37 o C±1 o C / 24±3 h Odczyt: Kolonie na BGA: typowe kolonie są różowe, wypukłe i drobne otoczone strefą czerwono zabarwionej pożywki. Kolonie na XLD: typowe kolonie mają czarny zabarwiony środek oraz lekko przezroczyste obrzeże czerwonawej barwy spowodowane zmianą zabarwienia wskaźnika Uwaga!: Szczepy Salmonella nie produkujące siarkowodoru rosną na XLD w postaci różowych kolonii z ciemniejszymi środkami. Szczepy Salmonella laktozo-dodatnie rosną w postaci żółtych kolonii z charakterystycznym zaczernieniem lub bez takiego czarnienia. Dokonać posiewu charakterystycznych i podejrzanych kolonii na agar odżywczy (co najmniej jedną z każdej płytki (w przypadku wyniku negatywnego do potwierdzenia wybrać dalsze cztery kolonie) 37 o C±1 o C / 24±3 h Potwierdzenie Potwierdzenie serologiczne: wykonać aglutynację szkiełkową z wykorzystaniem surowic O, Vi, H, przy czym w pierwszej kolejności należy sprawdzić możliwość wystąpienia autoaglutynacji (w przypadku pozytywnej reakcji nie należy wykonywać testu z pozostałymi surowicami) Potwierdzenie biochemiczne: użyć gotowych testów API 20E i postępować zgodnie z zaleceniami producenta, a odczytu dokonać przy pomocy specjalnej ksiązki kodowej. Wynik podać zgodnie z Normą PN-EN ISO 6579: 2003 jako obecność lub nieobecność Salmonella spp. w 25 g (ml) próbki lub jako obecność lub nieobecność w 100 ml wody i na określonej powierzchni wymazu.