XIX. Pałeczki Gram-ujemne część I - ćwiczenia praktyczne

Transkrypt

1 XIX. Pałeczki Gram-ujemne część I - ćwiczenia praktyczne Ćwiczenie 1. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama Opis preparatu: Ćwiczenie 2. Ocena wzrostu szczepów na podłożach stałych a. Agar z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej Escherichia coli typ hemolizy Proteus vulgaris typ hemolizy

2 Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloaceae b. Podłoże Mac Conkeya Escherichia coli.. Proteus vulgaris..

3 Klebsiella pneumoniae.. Enterobacter cloaceae. Ćwiczenie 3. Badanie właściwości biochemicznych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae a. podłoże Kliglera - badanie zdolności bakterii do rozkładu cukrów (glukoza, laktoza gazowo lub bezgazowo) oraz zdolności redukcji tiosiarczanu do siarkowodoru. b. woda peptonowa z 10% laktozą pod parafiną - badanie zdolności bakterii do rozkładu laktozy w warunkach beztlenowych c. woda peptonowa z tryptofanem - badanie zdolności bakterii do rozkładu tryptofanu do indolu. Przed odczytem na powierzchnię podłoża nawarstwić 1-2 krople odczynnika Ehrlicha lub Kovacsa d. woda peptonowa z mannitolem i rurką Durhama - badanie zdolności bakterii do gazowego rozkładu mannitolu e. podłoże Christensena - badanie zdolności bakterii do wytwarzania ureazy i rozkładu mocznika

4 a b c d e Eschericha coli Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris Enterobacter cloaceae Ćwiczenie 4. Identyfikacja pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae z wykorzystaniem testu API 20E Zasada metody: Paski API 20 E składają się z 20 mikroprobówek zawierających odwodnione substraty. Integralną częścią testu API 20 E jest też test na oksydazę. Substraty zostają uwodnione poprzez dodanie zawiesiny bakterii. Uwodnione substraty stanowią również podłoża do hodowli bakterii. Procesy metaboliczne zachodzące podczas inkubacji powodują zmiany koloru, które są albo spontaniczne, albo wywołane przez dodanie odczynników. Odczyt testu: Dodać do mikroprobówek TDA, VP, IND odpowiednie odczynniki wg schematu: 1. test TDA: dodać 1 kroplę odczynnika TDA (chlorek żelaza). Czerwono-brązowy kolor wskazuje na reakcję pozytywną 2. test VP: dodać po 1 kropli z każdego odczynnika VP1 (α-naftol) i VP2 (KOH). Odczekać przynajmniej 10 min; różowy lub czerwony kolor wskazuje na reakcję

5 pozytywną; jeśli po 10 min pojawi się blado różowy kolor, reakcję należy uznać za negatywną 3. test IND: dodać 1 kroplę odczynnika JAMES; różowy kolor powstający w całej probówce wskazuje na reakcję pozytywną Odczytać pozostałe testy wg załączonej instrukcji a wyniki wpisać karty odczytu Zinterpretować otrzymane wyniki zgodnie z książką kodową lub odczytem z APIweb Ćwiczenie 5. Identyfikacja pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae z wykorzystaniem testu ENTERO-Screen Zestaw ENTERO-Screen umożliwia przeprowadzenie ośmiu testów biochemicznych mających na celu zidentyfikowanie bakterii z rodziny Enterobacteriaceae: glukoza (beztlenowa), acetoina, fenyloalanina, indol, sacharoza, ureaza, lizyna i ornityna. Wykonanie oznaczenia: Opisać przygotować zestawu zgodnie z instrukcją producenta. 1. Przygotowanie

6 2. Inokulacja Inkubacja Odczyt

7 Ćwiczenie 6. Wykorzystanie testu IMViC do identyfikacji rodzajowej szczepów z rodziny Enterobacteriaceae I wytwarzanie indolu - woda peptonowa z tryptofanem - badanie zdolności bakterii do rozkładu tryptofanu do indolu. Zawarty w podłożu tryptofan za pośrednictwem tryptofanazy przekształcany jest w indol, skatol, amoniak i kwas pirogronowy. Przed odczytem na powierzchnię podłoża nawarstwić 1-2 krople odczynnika Ehrlicha lub Kovacsa. Powstanie ciemnoczerwonego pierścienia świadczy o rozkładzie tryptofanu. M próba MR za pomocą tej próby określa się określanie typ fermentacji glukozy. Badane szczepy posiewa się na podłoże Clarka i inkubuje w 37 0 C przez godzin. Po tym czasie do hodowli dodaje się kilka kropli czerwieni fenolowej. Hodowle w których bakterie zakwaszają hodowle do ph poniżej 4,5 przyjmują barwę czerwoną - wynik (+). Jeżeli hodowla ma ph wyższe niż 4,5 hodowla ma kolor żółty - wynik (-) V- próba VP (Vogesa Proskauera) określanie typu fermentacji glukozy. Kwas pirogronowy powstający w komórkach bakterii w wyniku rozkładu glukozy może być przekształcony m.in. w acetoninę. Ta pod wpływem ługu, dostępie tlenu utlenia się do di acetylu, a związek ten w obecności α-naftolu daje karminowe zabarwienie. Badane szczepy posiewa się na podłoże Clarka i inkubuje w 37 0 C przez godzin. Po tym czasie do hodowli dodaje się 0,5 ml 40% KOH i 0,2 ml 6% alkoholowego roztworu α-naftolu i odstawia na 15 minut. Powstanie karminowego zabarwienia świadczy o obecności acetoniny

8 C- wykorzystywanie cytrynianu określa się zdolność bakterii do wykorzystywania węgla z cytrynianu. Cechę tę bada się na podłożu Simmonsa. Zawarty w pożywce błękit bromotymolowy w środowisku obojętnym ma zielone zabarwienie. Pałeczki, które mają zdolność wykorzystania tych substratów alkalizują podłoże i zmieniają zabarwienie na niebieskie. I M V C Eschericha Klebsiella Proteus Enterobacter Serratia

9 Ćwiczenie 7. Oznaczanie mechanizmów oporności ESBL Opis wykonania oznaczenia w ćwiczeniu IX.... Ćwiczenie 8. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości Wykonanie odczytu: Na podłożach przeźroczystych, odczytać średnicę zahamowania wzrostu wokół krążka z antybiotykiem, trzymając płytkę 5-8 cm nad czarną powierzchnią oświetloną z boku, z dokładnością do 1 mm, przykładając miarkę od tyłu Na podłożach nieprzeźroczystych oświetlić płytkę światłem padającym z boku pod kątem 45 0 i odczytać strefę zahamowania wzrostu (nie odczytywać strefy hemolizy)

10 1. Wynik badania lekowrażliwości dla szczepu... Antybiotyk Strefa zahamowania wzrostu w mm Interpretacja wyniku Wnioski: