Zestaw do izolacji genomowego DNA z bakterii

Transkrypt

1 Nr kat. EM02 Wersja zestawu: Zestaw do izolacji genomowego DNA z bakterii EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.

2

3 Nr kat. EM02 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA BACTERIA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji bakteryjnego DNA o wysokiej czystości z hodowli płynnych i powierzchniowych oraz osadów mrożonych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM EM EM EM02-D BacL Buffer (Lysis Buffer) 15 ml 45 ml 75 ml 900 µl RNase A (lyophilized) 1 szt. 3 szt. 5 szt. 1 szt. RNase Buffer 220 µl 660 µl 1,1 ml 100 µl Proteinase K (lyophilized) 1 szt. 3 szt. 5 szt. 1 szt. Proteinase Buffer 700 µl 2,1 ml 3,5 ml 200 µl BacB Buffer (Binding Buffer) 18 ml 53 ml 88 ml 1,1 ml BacW Buffer (Wash Buffer) 50 ml 150 ml 250 ml 3 ml Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 600 µl DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Enzymy RNaza A oraz Proteinaza K dostarczane są w postaci liofilizowanej. Każda probówka zawiera odpowiednią ilość enzymu do przeprowadzenia 50 izolacji DNA. Liofilizaty enzymów należy przechowywać w temperaturze +4 C. Przed pierwszym użyciem liofilizat RNazy A należy rozpuścić w 220 µl RNase Buffer (w zestawie DEMO w 100 µl RNase Buffer). RNaza A w roztworze przechowywana w temp. +4 C zachowuje całkowitą aktywność przez kilka dni. Jeśli wymagane jest przechowywanie RNazy A przez dłuższy okres czasu, zaleca się rozporcjowanie roztworu RNazy i przechowywanie w temp. -20 C. 3

4 Liofilizat proteinazy K należy rozpuścić w 700 µl Proteinase Buffer (w zestawie DEMO w 200 µl Proteinase Buffer). Roztwór proteinazy K należy przechowywać w temperaturze 20 C! Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15-25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność minimum przez okres 12 miesięcy. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT jałowe próbówki wirownicze typu Eendorf (1,5-2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5-2 ml (> 11 tys. x g) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) worteks IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA składa się z 5 etapów i przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże krzemionkowe, wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. W pierwszym etapie izolacji DNA, podczas lizy enzymatycznej z wykorzystaniem BacL Buffer oraz proteinazy K, następuje dezintegracja ściany komórkowej, degradacja błon i białek komórkowych. Dodatkowo w celu otrzymania DNA wolnego od RNA stosuje się RNazę A. Po dodaniu soli chaotropowych, lizat przenoszony jest do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (ph 7,0-9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qpcr, Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi, ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. 4

5 Nr kat. EM02 V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA BACTERIA testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcjach PCR, qpcr oraz trawienia enzymami restrykcyjnymi. VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY Bakteryjna hodowla płynna lub powierzchniowa bądź mrożony osad bakteryjny. WYDAJNOŚĆ IZOLACJI Liczba komórek: 5 x % Liczba komórek: 1 x x % (wg protokołu izolacji DNA z dużej ilości komórek) Liczba komórek: 1 x x % (wg protokołu standardowego) POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 40 µg DNA CZAS IZOLACJI ok minut CZYSTOŚĆ DNA A 260/A280 = 1,7-1,9 5

6 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Hodowla bakteryjna jest biologicznym materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z hodowlami mikroorganizmów należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Zalecane jest używanie jałowych końcówek z filtrami do pipet. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. W przypadku rozlania cieczy zawierającej mikroorganizmy, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć wodnym roztworem detergentu. VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Materiał Wydajność izolacji i jakość wyizolowanego DNA mogą zależeć od: ilości komórek bakteryjnych w materiale wyjściowym, typu komórki (morfologia), obecności antybiotyków w pożywce, rodzaju pożywki, a także fazy wzrostu, wieku i stanu komórek bakteryjnych. Zestaw przeznaczony jest do izolacji DNA maksymalnie z 3 x 10 9 komórek bakteryjnych. Użycie większej liczby komórek może spowodować drastyczny spadek wydajności izolacji oraz czystości wyizolowanego DNA. Zaleca się prowadzenie izolacji ze świeżej hodowli lub mrożonych osadów bakteryjnych. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania materiału przed izolacją. Użycie starego bądź wielokrotnie rozmrażanego materiału może skutkować niską wydajnością izolacji wielkocząsteczkowego DNA. 6

7 Nr kat. EM02 Interakcje z buforem wiążącym BacB Buffer Niektóre gatunki bakterii po dodaniu buforu wiążącego mogą tworzyć gęstą zawiesinę przy powierzchni. W takim przypadku po inkubacji z BacB Buffer w temp. 55 C należy jak najdokładniej rozbić zawiesinę przez intensywne worteksowanie lub rozpipetowanie. Jeśli nie uda się rozbić zawiesiny, należy wydłużyć inkubację w temp. 55 C o kolejne 10 min. Następnie po zwirowaniu lizatu (nie naruszając osadu), całość należy przenieść do minikolumny ze złożem i kontynuować izolację od pkt. 11 Protokołu izolacji (sekcja XI). Nie powinno to obniżyć wydajności izolacji ani czystości DNA. Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości komórek użytych do izolacji oraz od oczekiwanego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie μl Elution Buffer przy izolacji maksymalnie z 10 9 komórek oraz zwiększenie objętości buforu elucyjnego do 200 μl w przypadku większej ilości komórek. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć punkty Protokołu izolacji (sekcja XI), umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Elution Buffer zawiera 0,5 mm EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych (np. sekwencjonowanie DNA). Do elucji DNA można użyć także buforu 5-10 mm Tris-HCl, ph 8,0-9,0, innych buforów do specyficznych aplikacji, o ph i stężeniu soli zbliżonych do tego buforu lub wody (ph 7,0-9,0). 7

8 IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Izolacja DNA z hodowli płynnej (0,2 3 ml) Przed pobraniem odpowiedniej objętości hodowli płynnej, zawiesinę komórek należy dokładnie wymieszać. Do 1,5 ml probówki typu Eendorf przenieść żądaną objętość hodowli bakteryjnej (maksymalnie 1,5 ml) i wirować przy 5-6 tys. rpm (3-4 tys. g). Zdekantować supernatant. Jeśli istnieje potrzeba izolacji z większej niż 1,5 ml objętości hodowli, do powstałego osadu dodać k o l e j n e 1, 5 m l h o d o w l i i p o w t ó r z y ć w i r o w a n i e. K o n t y n u o w a ć i z o l a c j ę od pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). Izolacja DNA z dużej liczby komórek W przypadku izolacji DNA z dużej liczby komórek ( 10 9 ), powstały po zwirowaniu osad należy dokładnie zawiesić w 450 μl BacL Buffer oraz zwiększyć ilości dodawanych enzymów odpowiednio do 6 μl w przypadku RNase A (pkt. 3) oraz 15 μl w przypadku Proteinase K (pkt. 5 Protokołu izolacji, sekcja XI). Izolacja DNA z zamrożonego osadu komórkowego Zamrożony osad należy bezzwłocznie zawiesić w 300 μl BacL Buffer. Nie należy doprowadzać do rozmrożenia osadu. Kontynuować izolację od pkt. 3 Protokołu izolacji DNA (sekcja XI). Izolacja DNA z hodowli powierzchniowej Do probówki 1,5 ml typu Eendorf przenieść 300 μl BacL Buffer. Ezą pobrać obfitą liczbę komórek z podłoża na płytce Petriego i zawiesić w buforze. Kontynuować izolację od pkt. 3 Protokołu izolacji DNA (sekcja XI). Izolacja z bakterii Gram-dodatnich Przed przystąpieniem do izolacji DNA z bakterii Gram-dodatnich próbkę należy poddać działaniu odpowiedniego enzymu. Do izolacji DNA z bakterii z rodzaju Staphylococcus zaleca się stosowanie lizostafyny (RP12, RP125), a w przypadku bakterii z rodzaju Enterococcus lizozymu (RP13, RP135). Staphylococcus: 1. Odwirować 1,5 ml hodowli bakteryjnej *. 2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** (dokładnie rozpipetować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 30 μl *** roztworu lizostafyny 400 U/ml (RP12, RP125) i 4 μl RNase A, dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie lub worteksowanie. 4. Inkubować minut *** w temp. 37 C. 8

9 Nr kat. EM02 5. Dodać 300 μl BacL Buffer i 17 μl Proteinase K, dokładnie wymieszać przez worteksowanie. 6. Kontynuować izolację od pkt. 6 Protokołu izolacji DNA (sekcja XI). * ** *** W przypadku gęstych hodowli, izolację należy prowadzić z mniejszych objętości hodowli bakteryjnej. Bufor TE: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0. W przypadku gronkowców koagulazo-ujemnych należy dodać 50 μl preparatu lizostafyny i inkubować 1 godzinę w temp. 37 C. Enterococcus: 1. Odwirować 1,5 ml hodowli bakteryjnej *. 2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** (dokładnie rozpipetować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 40 μl roztworu lizozymu 100 mg/ml i 4 μl RNase A, dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie lub worteksowanie. 4. Inkubować minut w 37 C. 5. Dodać 300 μl BacL Buffer i 17 μl Proteinase K, dokładnie wymieszać. 6. Kontynuować izolację od pkt. 6 Protokołu izolacji DNA (sekcja XI). * ** W przypadku gęstych hodowli, izolację należy prowadzić z mniejszych objętości hodowli bakteryjnej. Bufor TE: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0. X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer) oraz liofilizatu RNase A w odpowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer). 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (BacW Buffer) lub temp C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 37⁰C i 55⁰C. 5. Można ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 6. Ws z y s t k i e e t a p y w i r o w a n i a z o s t a ł y z o p t y m a l i z o w a n e z w y ko r z y s t a n i e m mikrowirówki Eendorf 5417C. P r ę d ko ś c i w i r ow a ni a p o d a n e w j e d n o s t k a c h rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. 9

10 XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Zwirować 0,2-1,5 ml hodowli bakteryjnej przy 5-6 tys. rpm (3-4 tys. g) przez 5 min. Można użyć większej objętości hodowli bakteryjnej. Więcej wskazówek znajduje się w sekcji IX. Przygotowanie próbki. 2. S u p e r n a t a n t z d e k a n t o w a ć, a o s a d b a k t e r y j n y d o k ł a d n i e zawiesić w 300 μl BacL Buffer. 3. Dodać 4 μl RNase A i wymieszać przez worteksowanie. 4. Inkubować 10 min w temp. 37 C. 5. Dodać 10 μl Proteinase K i wymieszać przez worteksowanie. 6. Inkubować 10 min w temp. 55 C. 7. Dodać 350 μl BacB Buffer i dokładnie wymieszać. 8. Inkubować kolejne 5 min w temp. 55 C. 9. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 s. 10. Wirować 2 min przy tys. rpm (11-15 tys. g). 11. Nie naruszając osadu delikatnie przenieść supernatant do minikolumny ze złożem, umieszczonej w probówce odbierającej i wirować 1 min przy tys. rpm (11-15 tys. g). 12. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej. 13. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego BacW Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11-15 tys. g). 10

11 Nr kat. EM Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej ponownie minikolumnę. 15. Dodać do minikolumny 400 μl BacW Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11-15 tys. g). 16. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić ponownie minikolumnę w probówce odbierającej. 17. Wirować 1-2 min przy tys. rpm (15-21 tys. g). Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 18. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. 19. Nanieść μl Elution Buffer uprzednio ogrzanego do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie μl. Więcej wskazówek dotyczących tego etapu znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 20. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min. 21. Wirować 1 min przy tys. rpm (11-15 tys. g). 22. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub -20 C do czasu dalszych analiz. 11

12 XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Niecałkowita liza komórek bakteryjnych. Gęsta zawiesina na powierzchni płynu po inkubacji z BacB Buffer. Niska wydajność izolacji DNA. Prawdopodobna przyczyna Pobrano zbyt dużą ilość komórek do izolacji DNA. Szczep użyty do izolacji należy do bakterii Gramdodatnich. Szczep użyty do izolacji nie jest szczepem bakteryjnym. Za krótki czas lizy dla danego rodzaju i ilości materiału. Charakterystyczna cecha danego szczepu bakteryjnego. Materiał o niskiej zawartości komórek bakteryjnych. Niecałkowita liza komórek. Obniżona aktywność proteinazy K. Niewystarczające zmieszanie lizatu z buforem wiążącym BacB Buffer. Niecałkowite wysuszenie kolumny z resztek buforu płuczącego. Niecałkowita elucja DNA. Niewłaściwe ph wody (ph <7,0). Rozwiązanie Należy powtórzyć izolację z mniejszej objętości hodowli lub zastosować się do zaleceń dotyczących izolacji DNA z dużej ilości komórek (sekcja IX. Przygotowanie próbki). Należy powtórzyć izolację stosując się do zaleceń dotyczących izolacji DNA z bakterii Gram-dodatnich (sekcja IX. Przygotowanie próbki). Należy potwierdzić prawidłowość identyfikacji szczepu, a następnie zastosować odpowiedni zestaw do izolacji DNA. Należy wydłużyć inkubację w temp. 55 C do 20 min lub do całkowitej lizy komórek. Patrz Interakcje z buforem wiążącym BacB Buffer w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. Zwiększyć objętość hodowli użytej do izolacji do 3 ml i/lub zmniejszyć objętość buforu elucyjnego do 20 μl. Patrz Niecałkowita liza komórek bakteryjnych. Sporządzić świeży roztwór proteinazy K. Należy upewnić się, że roztwór proteinazy K jest przechowywany w temp. 20 C. Izolację należy powtórzyć zwracając uwagę na całkowite zmieszanie lizatu z BacB Buffer przed inkubacją w 55 C (pkt.8). Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania (pkt.17) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer do temp. 80 C. Nanieść Elution Buffer centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer do 10 minut. Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć objętość Elution Buffer użytego do elucji do 200 μl. Do elucji użyć Elution Buffer. 12

13 Nr kat. EM02 Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie Zatkane złoże minikolumny. Niskie stężenie wyizolowanego DNA. Wyizolowane DNA jest podegradowane. Niecałkowita degradacja RNA. Reakcje enzymatyczne z użyciem wyizolowanego DNA nie zachodzą prawidłowo. Wyizolowane DNA jest niskiej czystości. Powstanie zawiesiny DNA, która trudno przechodzi przez złoże. Niecałkowita liza komórek. Zbyt duża objętość Elution Buffer. Nieprawidłowe warunki przechowywania materiału. Do izolacji użyto starego materiału. Za krótki czas inkubacji z RNazą A. Obniżona aktywność RNazy A. Niecałkowite wysuszenie minikolumny z resztek buforu płuczącego. Niewystarczająca ilość DNA w eluacie. Duża zawartość RNA w próbce. Niecałkowita degradacja białek w związku z obniżoną aktywnością proteinazy K. Pominięto jeden z dwóch etapów płukania. Niecałkowite wysuszenie minikolumny z resztek buforu płuczącego. Wirowanie należy powtórzyć przez 1 min przy 14 tys. rpm lub maksymalnej prędkości wirowania. Patrz Niecałkowita liza komórek bakteryjnych Objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć do 30 μl bez obniżenia wydajności elucji. Izolację należy prowadzić ze świeżych lub mrożonych osadów komórkowych. Należy unikać częstego zamrażania i rozmrażania materiału. Zalecana jest izolacja ze świeżej hodowli nocnej. Starsze hodowle bakteryjne mogą zawierać podegradowane DNA. Należy wydłużyć czas inkubacji z RNazą A (pkt. 4) do 30 minut. Izolację należy powtórzyć dodając świeży roztwór RNazy A. Upewnić się, że RNaza A jest przechowywana w temp. +4 C nie dłużej niż kilka dni. Przez dłuższy okres czasu RNazę A należy przechowywaćw temp. -20 C. Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania (pkt.17) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. Patrz Niecałkowita liza komórek bakteryjnych i Niskie stężenie wyizolowanego DNA. Patrz Niecałkowita degradacja RNA. Sporządzić świeży roztwór proteinazy K. Należy upewnić się, że roztwór proteinazy K jest przechowywany w temp. 20 C. Izolację należy powtórzyć, pamiętając o obu etapach płukania. Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania (pkt.17) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. 13

14 XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM BacB BUFFER Niebezpieczeństwo H302, H315, H318, H319, P280, P305+P351+P338, P302+P352 BacW BUFFER Niebezpieczeństwo H225, H319, H336, P210, P305+P351+P338 PROTEINASE K Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335, P261, P305+P351+P338, P342+P311, P302+P352 RNase A Uwaga H319, P305+P351+P338 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala o d ź r ó d e ł c i e p ł a / i s k r z e n i a / o t w a r t e g o o g n i a / g o r ą c y c h p o w i e r z c h n i. P a l e n i e w z b r o n i o n e. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342 + P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P302 + P352 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ: Umyć dużą ilością wody z mydłem. 14

15 Nr kat. EM02

16