Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0217

Transkrypt

1 Plasmid Maxi AX Sil Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja izolacje Nr kat S Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 1 mg. 1

2 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Kolumny Maxi AXSil 2 szt. Temp. Pok. Probówki 50 ml 6 szt. Temp. Pok. Strzykawki do filtrowania lizatu 2 szt. Temp. Pok. L1 roztwór do zawieszania komórek (roztwór z barwnikiem) 45 ml Temp. Pok. L2 roztwór lizujący 45 ml Temp. Pok. L3 roztwór zobojętniający 45 ml Temp. Pok. K1Sil roztwór równoważący 55 ml Temp. Pok. K2Sil roztwór płuczący 130 ml Temp. Pok. K3 roztwór elucyjny 55 ml Temp. Pok. TE bufor 5 ml Temp. Pok. Izopropanol 50 ml Temp. Pok. Wyposażenie i materiały niezbędne do izolacji DNA, które nie wchodzą w skład zestawu 1. Materiał do izolacji plazmidowego DNA 2. Etanol 70% 3. Wirówka 4. Woda jałowa (wolna od nukleaz, traktowana DEPC) (nr kat , ) (opcjonalnie) 5. Zlewki laboratoryjne UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy zalecamy oczyszczenie powierzchni roboczej używając produktu LabZAP (nr kat ) Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do izolacji plazmidowego DNA w wypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych lub niewłaściwie przechowywanych odczynników oraz kolumn 2

3 Protokół izolacji Uwagi: 1. Zestaw zawiera barwny system LySee, który umożliwia łatwą i wygodną kontrolę etapów lizy alkalicznej (więcej informacji - str. 6). 2. W roztworze lizującym L2 znajduje się SDS, który precypituje w niskich temperaturach. Dlatego, jeżeli roztwór lizujący L2 nie jest klarowny, należy go ogrzać w temp. 40 ºC do uzyskania całkowitej klarowności. 1. Zwirować od 200 do 500 ml nocnej hodowli bakteryjnej. Uwaga: Ilość hodowli bakteryjnej zależy od kopijności plazmidu, pamiętając, że pojemność kolumny Maxi AXSil wynosi 1 mg. Supernatant usunąć, a osad dokładnie zawiesić w 20 ml roztworu L1 do zawieszania komórek. W trakcie zawieszania osadu bakteryjnego roztwór będzie zmieniał wygląd z całkowicie transparentnego o odcieniu ciemnoróżowym na nieprzezroczysty o odcieniu jasnoróżowym. Zawieszanie można zakończyć po całkowitym zniknięciu osadu u dołu probówki. Przenieść po 10 ml zawiesiny do dwóch probówek 50 ml (w zestawie). 2. Do każdej z probówek dodać po 10 ml alkalicznego roztworu lizującego L2 i ostrożnie wymieszać do całkowitej lizy. Pozostawić na 3 min w temp. pokojowej. Po dodaniu roztworu lizującego L2, należy ostrożnie mieszać zawartość probówki, aby nie spowodować fragmentacji chromosomalnego DNA. Zwykle wystarczy sześciokrotne odwrócenie probówki. Mieszanina powinna zmieniać wygląd i zabarwienie. Po 3 min inkubacji, lizat powinien być całkowicie klarowny i jednolicie malinowy. Jeżeli nie jest, należy wymieszać lizat kilka razy i przedłużyć czas inkubacji o dalsze 3 min. 3. Do każdej z probówek dodać po 10 ml roztworu zobojętniającego L3 i ostrożnie wymieszać, aż do zniknięcia malinowej barwy lizatu. Po dodaniu roztworu zobojętniającego L3, następuje gwałtowna precypitacja potasowych soli SDS oraz chromosomalnego DNA i niektórych białek. Po wymieszaniu zawartość probówki powinna zmienić zabarwienie na lekko żółte. Brak śladów malinowego zabarwienia wskazuje na całkowite zobojętnienie i pomyślne zakończenie lizy alkalicznej. Inkubować w lodzie przez 15 min. 3

4 4. Przygotować kolumnę Maxi AXSil przez umieszczenie jej w pozycji pionowej w statywie. Pod kolumnę Maxi AXSil podstawić zlewkę do odbioru roztworów wypływających z kolumny Maxi AXSil. Zrównoważyć kolumny Maxi AXSil przez naniesienie na złoże po 25 ml roztworu równoważącego K1Sil. Poczekać, aż roztwór wypłynie z kolumny Maxi AXSil. 5. Po inkubacji próbki (z punktu 3) wirować przez 10 min przy RPM. 6. Wyjąć tłok ze strzykawki do filtrowania lizatu i przelać do niej supernatanty z dwóch probówek wraz z pływającą w nich niewielką ilością precypitatu. 7. Włożyć tłok i przefiltrować lizat bezpośrednio do zrównoważonej uprzednio kolumny Maxi AXSil (z punktu 4). Poczekać, aż lizat wypłynie z kolumny Maxi AXSil. 8. Nanieść na kolumnę Maxi AXSil po 30 ml roztworu płuczącego K2Sil. Poczekać, aż roztwór wypłynie z kolumny Maxi AXSil. Należy obserwować, czy roztwór w całości przeszedł przez kolumnę. Gdy roztwór przestanie kapać z kolumny należy przejść do kolejnego punktu. 9. Ponownie nanieść na kolumny Maxi AXSil po 30 ml roztworu płuczącego K2Sil. Poczekać, aż roztwory wypłyną z kolumny Maxi AXSil. Należy obserwować, czy roztwór w całości przeszedł przez kolumnę. Gdy roztwór przestanie kapać z kolumny należy przejść do kolejnego punktu. 10. Usunąć zlewkę, a pod wylot kolumny Maxi AXSil podstawić nową probówkę elucyjną 50 ml typu Falcon (w zestawie). Nanieść na kolumnę Maxi AXSil po 25 ml roztworu elucyjnego K3 i poczekać, aż eluat wypłynie z kolumny Maxi AXSil. 4

5 11. Do eluatu znajdującego się w probówce elucyjnej 50 ml typu Falcon dodać po 20 ml Izopropanolu. 12. Całość wymieszać, a następnie wirować przez 20 min przy x g. 13. Ostrożnie zlać supernatant, tak aby nie usunąć osadu plazmidowego DNA. W trakcie zlewania supernatantu bardzo łatwo wylać osad plazmidowego DNA. Dla bezpieczeństwa zaleca się wylewać supernatant do przygotowanej probówki, tak aby można było go odzyskać. Dodać po 2 ml etanolu 70% (nie ma w zestawie), lekko zamieszać i wirować przez 3 min przy x g. 14. Ostrożnie zlać supernatant, tak aby nie usunąć osadu plazmidowego DNA. W trakcie zlewania supernatantu bardzo łatwo wylać osad plazmidowego DNA. Dla bezpieczeństwa zaleca się wylewać supernatant do przygotowanej probówki, tak aby można było go odzyskać. Następnie osad plazmidowego DNA suszyć przez 10 min w temp. pokojowej przez odwrócenie probówki. 15. Po tym czasie zawiesić DNA w 0,2-1 ml buforu TE (w zestawie) lub wody jałowej (nie ma w zestawie). Próbki plazmidowego DNA przechowywać w temp. +4 do +8 ºC do czasu dalszych analiz. 5

6 System LySee System LySee umożliwia łatwą i wygodną kontrolę etapów lizy alkalicznej. Dzięki kontroli wizualnej, umożliwia wyeliminowanie ewentualnych błędów jak: niecałkowite zawieszenie komórek, nieefektywna liza komórek i niepełna precypitacja niepożądanych składników komórkowych. Bezpośrednia kontrola wizualna procesu zawieszenia komórek, lizy, zobojętniania i precypitacji: 1. Zawieszanie i liza: Dodanie do osadu komórek bakteryjnych przejrzystego purpurowego roztworu L1 sprawia, że osad jest łatwy do zlokalizowania (rys. 1). Podczas procesu zawieszania, mieszanina staje się mętna o jasnoróżowym odcieniu (rys. 2). Etap zawieszanie jest zakończony, gdy osad komórek bakteryjnych na dnie probówki całkowicie zniknie. Po dodaniu roztworu lizującego L2 i inkubacji lizat staje się malinowy. Liza komórek jest zakończona, gdy roztwór osiągnie jednorodnie przejrzysty malinowy wygląd (rys. 3). rys. 1 rys. 2 rys Zobojętnianie i precypitacja: Dodanie do mieszaniny roztworu zobojętniającego L3 powoduje gwałtowną precypitację potasowych soli SDS, chromosomalnego DNA i niektórych białek (rys. 4). Po wymieszaniu mieszanina staje się lekko żółta (rys. 5). Brak śladów malinowego zabarwienia wskazuje na całkowite zobojętnienie i pomyślne zakończenie lizy alkalicznej (rys. 6). rys. 4 rys. 5 A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia rys. 6 NIP

7 Produkty powiązane Produkt Ilość Nr kat. Plasmid Mini 50 izolacji izolacji Plasmid Mini AX 50 izolacji Plasmid Mini AX Gravity 100 izolacji Plasmid Midi AX 10 izolacji E.coli Transformer Kit 6x40 reakcji Saccharomyces Transformer Kit 120 reakcji Pichia Transformer Kit 120 reackji KineX OverLap Assembly Ligaza T4 DNA 20 reakcji reakcji reakcji reakcji U U

8 Informacje bezpieczeństwa L2 roztwór lizujący H315 Działa drażniąco na skórę. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. L3 roztwór zobojętniający H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenia oczu. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu/ ochronę twarzy. K1Sil roztwór równoważący H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. UWAGA K2Sil roztwór płuczący H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. K3 roztwór elucyjny H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. Izopropanol H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. 8