Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności peroksydazy

Transkrypt

1 Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności peroksydazy Cel ćwiczenia: Ćwiczenie poświęcone jest zapoznaniu się z metodą oznaczania aktywności peroksydazy chrzanowej jako jednego z enzymów z klasy oksydoredukataz. Wprowadzenie: Peroksydazy (EC...-4) to grupa enzymów należących do klasy oksydoreduktaz katalizujących utlenianie nadtlenkiem wodoru różnych substratów organicznych i nieorganicznych (Verma i Dubey, 0003). Grupą prostetyczną peroksydaz może być kofaktor hemowy, a także reszty selenocysteiny lub cysteiny luźno związane z apoenzymem. W reakcji katalizowanej przez peroksydazę, nadtlenek wodoru jest redukowany kosztem różnych związków np. kwasu askorbinowego, hydrohinonów i zredukowanego cytochromu. Sumarycznie równanie reakcji katalizowanej przez peroksydazę przedstawia się następująco: H O + AH H O + A gdzie: AH i A to, odpowiednio, substrat w stanie zredukowanym i utlenionym. Peroksydazy roślinne należą do kluczowych enzymów kontrolujących różnicowanie się i rozwój komórek roślinnych. Biorą one udział w takich procesach, jak: wczesny rozwój roślin, kiełkowanie, dojrzewanie owoców, starzenie oraz opadanie liści. Dodatkowo pełnią funkcję enzymów o charakterze antyoksydantów, uczestnicząc w unieczynnianiu reaktywnych form tlenu (RFT). RFT powstają w każdej żywej komórce jako nieuchronny produkt metabolizmu tlenowego. Nadmierne ich generowanie prowadzi do stresu oksydacyjnego oddziałując negatywnie na funkcje wszystkich organelli komórkowych, uszkadzając białka, lipidy oraz kwasy nukleinowe (Zacchini i in., 003). Organizmy roślinne i zwierzęce wykształciły system antyoksydacyjny, który składa się zarówno z enzymów (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza oraz alternatywna oksydaza) jak i związków niskocząsteczkowych (askorbinian, cysteina, glutation). Do peroksydaz biorących udział w usuwaniu RFT należą: peroksydaza glutationowa, gwajakolowa czy askorbinowa (Mehlhorn, i in., 996). Enzymy te zlokalizowane są m.in. w cytozolu, wakuoli, chloroplastach, ścianie komórkowej i przestrzeni międzykomórkowej. Uczestniczą nie tylko w obronie antyoksydacyjnej, ale również biorą udział w procesach lignifikacji, biosyntezie etylenu i obronie przed patogenami. Peroksydazy są wysoce specyficzne w stosunku do donora wodoru (np. peroksydaza cytochromowa, peroksydaza NADH, peroksydaza NADPH) lub niespecyficzne przenosząc atom wodoru z organicznego substratu na nadtlenek wodoru (np. peroksydaza chrzanowa). Prawie wszystkie peroksydazy niespecyficzne są hemoproteinami. Dzięki występowaniu ugrupowania hemowego połączonego ze specyficznym białkiem wykazują one charakterystyczne widmo absorpcyjne. Utworzenie przejściowego kompleksu enzymu z H O, powoduje aktywacje nadtlenku wodoru, w wyniku, czego działa jako akceptor wodoru. Peroksydazy mogą również katalizować reakcję bezpośredniego utlenienia substratów z udziałem tlenu cząsteczkowego. Do peroksydaz o charakterze niespecyficznym należy m.in. peroksydaza chrzanowa. Jest ona glikoproteiną o masie cząsteczkowej 44 kda, zawierającą cztery reszty lizynowe.

2 Substratem, a więc donorem wodoru mogą być m.in. fenole oraz aminy tj. e-toluidyna, gwajakol czy pirogalol. Oznaczanie aktywności peroksydazy chrzanowej Aktywność peroksydazy może być oznaczana na podstawie: spadku stężenia nadtlenku wodoru, spadku stężenia donoru wodoru lub pomiarze poziomu utworzonych produktów utlenienia. Na dzisiejszych ćwiczeniach pomiar aktywności peroksydazy chrzanowej będzie się opierał na trzeciej metodzie, czyli na pomiarze poziomu utworzonych produktów utlenienia. Przy oznaczaniu aktywności peroksydazy nadtlenek wodoru stosuje się w niewielkim nadmiarze ze względu na jego inaktywujące działanie na enzymy. Reakcję przeprowadza się przez 5-0 minut ze względu na szybkie wyczerpywanie się nadtlenku wodoru. Zasada fotometrycznej metody oznaczania aktywności peroksydazy chrzanowej Metoda opiera się na reakcji utleniania pirogalolu do purpurogaliny przy udziale nadtlenku wodoru. Ilość powstającej purpurogaliny mierzona jest fotometrycznie przy długości fali 430 nm i temperaturze 5 C. Próbę materiałową wykonuje się bez dodatku H O w celu wyeliminowania aktywności oksydazy polifenolowej, która również wykazuje właściwości utleniające. Aktywność peroksydazy uzyskujemy poprzez odjęcie od absorbancji dla wartość absorbancji dla (Próba pełna Próba materiałowa). Rys.. Utlenienie pirogalolu do purpurogaliny. Odczynniki. 0. M bufor fosforanowy ph 7.0:. 0. M roztwór pirogallolu M H O 4. 0% Kwas siarkowy 5. 0% Siarczyn sodowy 6..5 g Chrzanu/000ml Wykonanie Wyciąg enzymowy (zadanie kontrolne) uzupełnić wodą destylowaną w kolbie miarowej na 5 ml. Procedura Wykonywane są następujące y:

3 ) kontrolna zawiera wszystkie składniki, ale bez wyciągu enzymowego. Służy do wyzerowania spektrofotometru i kompensuje absorbancję pochodzącą od odczynników. ) materiałowa bez dodatku H O w celu wyeliminowania aktywnej w roślinach oksydazy polifenolowej wykazującej właściwości utleniające pirogalol. 3) pełna zawierająca wszystkie odczynniki oraz enzym i H O. Aktywność peroksydazy chrzanowej wykonuje się w buforze fosforanowym ph 7.0, temperaturze 5 o C, inkubację prowadzi się przez 0 minut. Do probówek należy odpipetować następujące ilości odczynników: Próba kontrolna Próba materiałowa (w powtórzeniach) Próba pełna (w powtórzeniach) Enzym Enzym 0.7 ml 0.7 ml 0. ml Wstawić do łaźni wodnej na 5 minut o temperaturze 5 C Nadtlenek wodoru Nadtlenek wodoru Inkubować w łaźni wodnej przez 0 minut o temperaturze 5 C Kwas siarkowy Kwas siarkowy Kwas siarkowy* Siarczyn sodowy Siarczyn sodowy Siarczyn sodowy** *zahamowanie reakcji przez dodanie 0 % kwasu siarkowego ** rozłożenie pozostałego nadtlenku wodoru Absorbancję uzyskanych roztworów ( y pełne, y materiałowe) należy odczytać w fotometrze wobec y kontrolnej przy długości fali 430 nm. Opracowanie wyników Od średniej wartości absorbancji odjąć średnią wartość absorbancji. Dla otrzymanej absorbancji odczytać z krzywej wzorcowej stężenie purpurogaliny. Obliczyć aktywność peroksydazy wyrażona w μmol purpurogaliny utworzonej w ciągu minuty w przeliczeniu na g korzenia. 3

4 Przykładowe obliczenie Średnia absorbancja Średnia absorbancja Różnica Stężenie purpurogaliny (μg) Różnica absorbancji 0.45 W y znajduje się 900 μg purpurogaliny W 5 ml (w kolbce) μg purpurogaliny (900 μg x 50) Do kolbki przed dopełnieniem jej wodą do objętości 5 ml wlano np. 3 ml analizowanego ekstraktu z korzenia chrzanu (wartość tę poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu różnic absorbancji P pełna P materiałowa). W 3 ml roztworu było μg purpurogaliny, zatem w 000 ml: μg purpurogaliny x 000/3 = μg purpurogaliny Masa molowa purpurogaliny 0 μg/μmol, zatem μg/0 μg/μmol = 68 8 μmol Do doświadczenia użyto.5 g korzenia chrzanu a aktywność musimy przeliczyć na g i na minutę: 68 8 μmol x g/.5 g = 7 7 μmol 7 7 μmol x minuta/0 minut = 77 μmol Schemat rozcieńczeń.5g 000 ml X ml Zadanie kontrolne 5 ml Pytania: ) Do jakiej klasy enzymów należą peroksydazy i jakie reakcje katalizują? ) Wyjaśnij, dlaczego w metodach oznaczania aktywności peroksydaz reakcję prowadzi się tylko przez krótki czas? 3) W jaki sposób przerywa się na ćwiczeniu reakcję katalizowaną przez peroksydazę chrzanową? W jakim celu po zakończeniu reakcji enzymatycznej dodaje się siarczynu sodowego? 4) Czym różnią się y kontrolne od w fotometrycznej metodzie oznaczania aktywności peroksydazy? Do czego służy a kontrolna, materiałowa oraz pełna? 4

5 Literatura: ) Becana M, Dalton DA, Moran JF, Iturbe-Ormaetxe I, Matamoros MA, Rubio MC Reactive oxygen species and antioxidants in legume nodules. Physiologia Plantarum 09: ) Mehlhorn H, Lelandais M, Korth HG, Foyer CH Ascorbate is the natural substrate for plant peroxidases? FEBS Lett: 378: ) Małecka A., Tomaszewska B Reaktywne formy tlenu w komórkach roślinnych i enzymatyczne systemy obronne. Postępy Biologii Komórki 3:3-35 4) Verma, S. and R.S. Dubey, 003. Lead toxicity induces lipid peroxidation and alters the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Sci: 64: ) Zacchini M., Rea E., Tullio M., de Agazio M Increased antioxidative capacity in maize calli during and after oxidative stress induced by a long lead treatment. Plant Physiology and Biochemistry: 4: