Karol Dziubek. Wpływ czynników chemicznych i fizycznych na zawartość < lntationn zredukowanego {tishf i ntlenioneijo (GSSG) w niektórych narządach

Transkrypt

1 Karol Dziubek Wpływ czynników chemicznych i fizycznych na zawartość < lntationn zredukowanego {tishf i ntlenioneijo (GSSG) w niektórych narządach Iłami csculcnta L. w okresie zimowania Wydawnictwo Naukowe AP Kraków

2

3 Wpływ czynników chemicznych i fizycznych a zawartość glutatioun zredukowanego GSH i utlenionego (CSSG) w niektórych uarziądacli esculent a L. w okresie zimowania

4 Akademia Pedagogiczna im. Komisji Edukacji Narodowej w Krakowie Prace Monograficzne nr 237

5 Karol Dziubek Wpływ czynników chemicznych i fizycznych na zawartość glntationii zredukowanego (CSH) i utlenionego {CSSC) w niektórych narządach Rama esculent a L. w okresie zimowania Wydawnictwo Naukowo AP Kraków

6 Recenzenci prof, dr hab. BARBARA PŁYTYCZ prof, dr hab. ZOFIA WALTER redakcja M arta Łukaszczyk Copyright by Wydawnictwo Naukowe AP, Kraków 1996 I55N ISDN Wydanie II poprawione i uzupełnione łamanie, druk i oprawa Wydawnictwo Naukowe Akademii Pedagogicznej Redakcja / Dział Promocji Kraków, ul. 5tudencka 5 tel. / fax (012) Zam. nr 16/2000

7 Spis treści Wykaz najczęściej stosowanych skrótów...7 Wstęp Cel pracy Materiał i metody Zwierzęta Narządy Grupy badawcze Odczynniki Oznaczanie GSH metodą Ellmana (1959; Oznaczanie GSH i GSSG metodą Matsumoto i wsp. (1996) Oznaczanie glukozy Statystyczna analiza wyników Wyniki Wpływ wieku na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Wpływ podwyższenia temperatury na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Wpływ insuliny na zawartość glukozy, GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Wpływ estru monoetylowego glutationu na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Wpływ allopurynolu na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Oddziaływanie kwasu L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowego (OTZ) na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Wpływ witaminy E na zawartość GSH, GSSG oraż wartość stosunku GSSG/GSH Wpływ promieniowania UVA na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Wpływ etanolu na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH... 51

8 4. Dyskusja Zawartość GSH jest odwrotnie proporcjonalna do zawartości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH Zawartość GSH maleje z wiekiem Zawartość GSH wzrasta wraz z temperaturą Insulina podwyższa zawartość GSH Ester monoetylowy glutationu podwyższa zawartość GSH Allopurynol podwyższa zawartość GSH OTZ podwyższa zawartość GSH Witamina E podwyższa zawartość GSH UVA (365 nm) obniża zawartość GSH Etanol obniża zawartość GSH...78 Podsumowanie i wnioski...81 Streszczenie Literatura... 84

9 Wykaz najczęściej stosowanych skrótów A - promieniowanie UVA (365 nm) ADP - adenozynodwufosforan Al. - allopurynol ATP - adenozynotrój fosforan BSO - butioninosulfoksymina D - żaby dojrzałe płciowo E - ester monoetylowy glutationu Et. - alkohol etylowy GGT - y-glutamylowa transpeptydaza GSH - glutation zredukowany GSSG - glutation utleniony GSH-Px - peroksydaza glutationowa GSH-Rd - reduktaza glutationowa GSH-Tr - transferazy S-glutationowe In. - insulina M - mózg Mł. - żaby młodociane NADPH - fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowy N - nerki OTZ (O)- kwas L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowy 0 2 *- anionorodnik ponadtlenkowy OX - oksydaza ksantynowa OH - rodnik hydroksylowy RFT - reaktywne formy tlenu S - grupa kontrolna po iniekcji soli fizjologicznej Sk. - skóra SOD - dysmutaza ponadtlenkowa T - witamina E W - wątroba

10 Wstęp Glutation (GSH) jest trójpeptydem powszechnie obecnym we wszystkich typach komórek zwierzęcych. Jego ilość waha się od 0,1-10 mm/1 i od 0,1-9 pm/g, w zależności od narządu i znacznie przekracza stężenia innych niskocząsteczkowych związków tiolowych. Zmiany w ilości GSH są procesami dynamicznymi odzwierciedlającymi równowagę między tempem jego syntezy i utylizacji. W warunkach fizjologicznych ponad 99% glutationu występuje w formie zredukowanej (GSH), zaś forma utleniona disulfidowa (GSSG) stanowi jego znikomą frakcję. Pomimo tego stosunek GSSH/GSH jest odpowiednio stały (Bradshaw i wsp. 1997). GSH jest syntetyzowany głównie w cytozolu, a co ciekawe uczestniczy w detoksykacji, ochronie i regulacji fizjologicznych funkcji również w jądrze komórkowym, mitochondriach, siateczce śródplazmatycznej, a nawet w przestrzeniach pozakomórkowych (Grigg i wsp. 1993; Kruman i wsp. 1997). Odpowiednia ilość GSH jest szczególnie ważna w jądrze komórkowym, w którym prawie zawsze jest utrzymywana na odpowiednio stałym poziomie. Ilość ta zależy głównie od importu GSH z cytozolu, natomiast w mniejszym stopniu od syntezy w samym jądrze. Jądro komórkowe posiada wprawdzie enzymy syntetyzujące GSH, ale ich aktywność jest niewystarczająca do zapewnienia syntezy odpowiedniej ilości tego trójpeptydu. Dlatego też w porównaniu z cytozolem w jądrze komórkowym występuje tylko od 1do 2% GSH (Ho i Guenthner 1994). GSH obecny w jądrze ma chronić jądrowy DNA przed cytotoksycznością, np. wywoływaną przez związki alkilujące. Co więcej, ewentualne obniżenie tej ilości zmniejsza aktywność i efektywność naprawy oksydacyjnych uszkodzeń DNA (Jevtovic-Todorovic i Guenthner 1991). W porównaniu z jądrem komórkowym w mitochondriach występuje około 30% GSH w porównaniu z całkowitą jego zawartością w komórce

11 (Schnellmann i wsp. 1988). Pochodzenie mitochondrialnego GSH nie jest do końca jasne. Podobnie jak w przypadku jądra, mitochondrialny GSH może pochodzić albo z importu z cytozolu lub, co nie jest wykluczone, może być częściowo syntetyzowany de novo. Synteza ta jest jednak niewystarczająca do zapewnienia mitochondriom odpowiedniej ochrony antyoksydacyjnej (Lash 1993). Dlatego też import GSH z cytozolu jest konieczny. Transport cytozolowego GSH do mitochondriów jest zależny od Na+i jest hamowany przez koniuganty glutationowe (McKernan i wsp. 1991; Schnellmann 1991). Interesujący jest fakt, że powstający z GSH w mitochondriach glutation utleniony (GSSG) nie jest eksportowany do cytozolu, lecz jest w całości w nich redukowany do GSH. Mitochondria mają bowiem odpowiednio wysoki poziom reduktazy glutationowej (GSH-Rd), dzięki której GSSG jest efektywnie redukowany do GSH. Ponieważ mitochondria są głównym źródłem reaktywnych form tlenu (RFT) w komórce, dlatego ewolucja wyposażyła je w wydajny system anty oksydacyjny, w którym główną rolę odgrywa GSH. W przeciwnym razie byłyby w pierwszej kolejności utleniane przez RFT (Heales i wsp. 1995). Poza komórkami GSH występuje również w płynach ustrojowych (Jones i wsp. 1995). W płynach tych jego stężenie waha się od 1-10 pm/1, podczas gdy w komórce wynosi ono od 0,1-9 pm/g (Roum i wsp. 1993; Stenzel i wsp. 1993). Pozakomórkowy GSH występuje głównie w płynie mózgowo-rdzeniowym i w osoczu (Bernhard i wsp. 1998). Świadczy to o powszechności uwalniania GSH z komórek, a także o tym, że w przestrzeniach tych spełnia on specyficzne funkcje fizjologiczne. Najważniejsza z nich ma polegać na kontrolowaniu i utrzymaniu pozakomórkowego statusu oksydacyjno-redukcyjnego (Hwang i Sinskey 1991). Nie należy zapominać, że pozakomórkowy GSH jest także pojemnym magazynem cysteiny, która może być wykorzystywana przez różne typy komórek do resyntezy GSH. Jest też substratem pozakomórkowych enzymów tj. glutationowych S-transferaz (GSH-Tr) i peroksydazy glutationowej (GSH-Px) (Maser i wsp. 1994). Pozakomórkowy GSH ma także bezpośrednio chronić receptory obecne na zewnętrznych powierzchniach komórek przed związkami utleniającymi i RFT (Sternberg i wsp. 1993). Podobnie jak w komórce, tak też w całym organizmie ma miejsce wymiana GSH między różnymi narządami. GSH syntetyzowany w wątrobie jest

12 transportowany do przestrzeni pozakomórkowych i następnie wykorzystywany przez nerki i śledzionę. Dla przykładu u człowieka do krążenia jest uwalniane około 14 g GSH na dobę (Burgunder i Lauterburg 1987). Poza komórkami zwierzęcymi GSH występuje również w komórkach roślinnych (Reunenbery i Brunold 1994). Dlatego też przyjmuje się, że występuje on powszechnie w komórkach wszystkich żyjących organizmów. GSH jest N-[N-L-y-glutamylo-L-cysteinylo]glicyną (Schemat 1) syntetyzowaną z glutaminianu, cysteiny i glicyny (Schemat 2). Synteza ta przebiega w dwóch etapach i jest katalizowana przez dwa cytoplazmatyczne enzymy, mianowicie syntetazę y-glutamylocysteinową (EC ) oraz syntetazę glutationową (EC ). Synteza ta została po raz pierwszy opisana w 1952 roku przez Snoke i Blocha. Schemat 1. Glutation zredukowany W pierwszym etapie syntezy powstaje y-glutamylocysteina (Schemat 2). L-Glutaminian + L-cysteina + ATP -> L-y-glutamylo-L-cysteina + ADP Schemat 2. Pierwszy etap syntezy GSH Pierwszy etap reakcji jest katalizowany przez syntetazę y-glutamylocysteinową, która w obecności jonów Mg2+ przyłącza kwas glutaminowy i L-cysteinę do y-glutamylocysteiny. Jej aktywność jest regulowana na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego, mianowicie nadmiar GSH i cysteiny hamuje jej aktywność, zaś nadmiar glutaminianu znosi tę inhibicję (Richman i Meister 1975). Ostatecznie GSH powstaje w drugim etapie reakcji przy udziale syntetazy glutationowej zależnej od ATP. Na tym

13 etapie syntezy także wymagana jest obecność jonów Mg2+(Meister 1975) (Schemat 3). L-y-Glutamylo-L-cysteina + glicyna + ATP -> GSH + ADP Schemat 3. Drugi etap syntezy GSH Syntetaza glutationowa jest enzymem obecnym prawie we wszystkich typach komórek zwierzęcych. W przeciwieństwie do syntetazy y-glutamylocysteinowej, jej aktywność nie jest hamowana przez nadmiar GSH lecz przez ilość ADP, który w tej reakcji odgrywa rolę regulacyjną, mianowicie wzrost ilości ADP hamuje aktywność enzymu (Huang i wsp. 1995). Na wzrost tempa syntezy GSH wpływa także szybkość absorbcji jego prekursorów, głównie cysteiny. Cysteina może pochodzić z diety białkowej, proteolizy białek lub może być syntetyzowana z L-metioniny i seryny. Szybkość syntezy GSH zależy także od rodzaju narządu. Prawdopodobnie najszybciej synteza ta przebiega w hepatocytach i kanalikach proksymalnych nerki (O Connor i wsp. 1995; Atmaca i Fry 1996). Tak jak wcześniej wspomniano, wszystkie komórki syntetyzujące GSH mogą go eksportować do przestrzeni pozakomórkowych. Długo nie znano mechanizmu tego transportu. Obecnie wiadomo, że GSH jest cząsteczką hydrofilną i pomimo wysokiego stężenia w komórce nie może dyfundować przez podwójną warstwę lipidową błony komórkowej. Jest więc aktywnie transportowany przez błony komórkowe za pomocą tzw. przenośników. Takie przenośniki po raz pierwszy stwierdzono w hepatocytach i oocytach Xenopus laevis (Femandez-Checa i wsp. 1993b). Ich obecność potwierdzili także Yi i wsp. (1994), którym udało się wyróżnić dwa ich rodzaje, mianowicie RcGshT (kanalikowy przenośnik) i RsGshT (sinusoidalny). Obecnie wiadomo, że RcGshT występuje we wszystkich komórkach ssaków i uczestniczy w lokalnej homeostazie GSH (w danym narządzie), zaś RsGshT występuje tylko w wątrobie i utrzymuje homeostazę GSH między różnymi narządami (Yi i wsp. 1995). W 1994 roku Zlokovic i wsp. opisali inny przenośnik pośredniczący w transporcie GSH, ale nie z narządu do krwi, lecz odwrotnie z krwi do soczewki oka. Przenośnik ten jest wyraźnie różny od przenośników RcGshT i RsGshT. Tylko za pomocą tego przenośnika GSH krążący

14 w krwi jest transportowany do soczewki oka. Jest to niezwykle ważne, ponieważ soczewka oka dysponuje małą ilością cysteiny z powodu ograniczonych możliwości jej resorbcji, przez co synteza GSH w tym narządzie jest znikoma (Rathbun i Murray 1991). Przypuszcza się, że przenośnik ten jest zależny od sodu Na+(Kannan i wsp. 1999). Do dzisiaj nie wiadomo jaka jest efektywność przenośników GSH i od jakich czynników ma ona zależeć. Przypuszcza się tylko, że y-glutamyloaminokwasy cis hamują, a trans stymulują transport GSH (Lu i wsp. 1996). Część pozakomórkowego GSH ulega rozkładowi. Ponieważ w cząsteczce GSH występuje wiązanie izopeptydowe między grupą y-karboksylową glutaminianu a grupą aminową cysteiny, to dlatego jest on oporny na działanie peptydaz. Dlatego rozkład ten rozpoczyna nie peptydaza lecz transpeptydaza y-glutamylowa (GGT, EC ). Jest ona jedynym znanym enzymem zdolnym do inicjowania hydrolizy pozakomórkowego GSH. Dzięki tej hydrolizie komórki uzyskują dodatkowe źródło cysteiny, którą mogą wykorzystać do resyntezy cząsteczki GSH (Schoffner i wsp. 1995). Badania histologiczne sugerują także specyficzną rolę GGT w biologii nowotworów. Okazuje się, że komórki nowotworowe w porównaniu z komórkami zdrowymi charakteryzują się wysoką aktywnością GGT. Określa się je więc jako GGT-pozytywne (Paolicchi i wsp. 1997). Ekspresja GGT ma miejsce w różnych typach nowotworów, głównie jednak w nowotworach wątroby, śledziony, gruczołów mlecznych i jajników (Hanigan i wsp. 1994). Komórki nowotworowe dzięki GGT efektywnie korzystają z pozakomórkowego GSH, przez co stają się oporne na podawane leki (Hochwald i wsp. 1996). GGT uczestniczy także w transporcie aminokwasów do wnętrza komórek i w metabolizmie cząsteczek y-glutamylowych (Kannan i wsp. 1996). Powstająca w wyniku rozkładu GSH reszta glutamylowa może być przez GGT przenoszona nie tylko na cysteinę, ale także na metioninę, alaninę i walinę. W organizmach zwierzęcych GGT najczęściej przenosi jednak resztę glutamylową na cysteinę. W wyniku tego powstaje cysteinyloglicyna i odpowiedni y-glutamyloaminokwas (Schemat 4). GSH + aminokwas -» y-glutamyloaminokwas + cysteinyloglicyna Schemat 4. Rozkład GSH

15 Powstające y-glutamyloaminokwasy i cysteinyloglicyna są transportowane do wnętrza komórek przy udziale przenośników dipeptydów. W komórkach ma miejsce przekształcanie y-glutamyloaminokwasów przez y-glutamylotransferazę (EC ). Enzym ten przekształca resztę y-glutamylową w 5-oksoprolinę z równoczesnym uwalnianiem aminokwasu, który w pierwszej reakcji był akceptorem tej reszty (Schemat 5). y-glutamyloaminokwas >5-oksoprolina + aminokwas Schemat 5. Przekształcanie y-glutamyloaminokwasów Od aktywności y-glutamylotransferazy zależy czy komórka importuje GSH, czy jest jego eksporterem. W przypadku nadmiaru aktywności enzymu komórka importuje GSH. Odwrotnie, przy małej aktywności y-glutamylotransferazy jest jego eksporterem. Tak więc aktywność transglutynacji na powierzchni komórki decyduje o kierunku obiegu GSH w organizmie. W wątrobie wzrost aktywności y-glutamylocyklotransferazy obserwuje się po podaniu niektórych ksenobiotyków, np. fenobarbitalu, etanolu lub różnych związków kancerogennych, zaś spadek po podaniu syntetycznego testosteronu i gestagenu (Kretzschmar i wsp a,b). Drugi produkt reakcji katalizowanej przez y-glutamylowątranspeptydazę, mianowicie cysteinyloglicyna jest hydrolizowana przez dwupetydazę cysteinyloglicynową do cysteiny i glicyny (Schemat 6). Cysteinyloglicyna -> cysteina + glicyna Schemat 6. Hydroliza cysteinyloglicyny GSH uczestniczy w wielu biochemicznych reakcjach, w których jest donorem elektronów. Dzięki temu w komórkach utrzymywany jest odpowiedni status redoksowy, a także zachodzą reakcje detoksykacji. W reakcjach transferu jednego elektronu GSH oddaje atom wodoru, który jest przyłączany do atomu węgla, tlenu lub azotu. W wyniku tego powstaje rodnik glutationylowy ( GS ), który dimeryzuje do GSSG. Dzięki tym reakcjom są detoksykowane RET, a białkowe grupy tiolowe są utrzymywane w stanie zredukowanym (Sies 1991). GSH redukuje także H20 2lub nadtlenki organiczne. Reakcje te katalizuje selenozależna GSH-Px, w której selen występuje w postaci seleno-

16 cysteiny na powierzchni enzymu, co czyni go łatwo dostępnym dla H202. Nadtlenek wodoru jest również substratem katalazy, ale jednak głównym szlakiem jego usuwania jest reakcja z GSH-Px (Schemat 7). 2GSH + H202-> GSSG + 2H20 Schemat 7. Redukcja nadtlenku wodoru przez GSH Reakcja ta poza usuwaniem H202zapobiega również powstawaniu niezwykle groźnych rodników hydroksylowych ( OH), a także tlenu singletowego ( 0 2). Ilość GSSG powstającego w reakcjach detoksykacji H202 wyraźnie wzrasta w miarę wzrostu w komórkach tego nadtlenku. W takiej sytuacji w komórkach wzrasta wartość stosunku GSSG/GSH, czemu towarzyszy zahamowanie wielu funkcji komórek, między innymi biosyntezy białka (Zoeren-Grobben i wsp. 1997). Powstający GSSG jest redukowany do GSH przy udziale NADPH (Schemat 8) lub NADH (Schemat 9). GSSG + NADPH + H+ - 2GSH + NADP+ Schemat 8. Redukcja GSSG przy udziale NADPH GSSG + NADH + H+-> 2GSH + NAD+ Schemat 9. Redukcja GSSG przy udziale NADH Reakcję redukcji GSSG katalizuje reduktaza glutationowa (EC ) (GSH-Rd). Jest ona enzymem powszechnie występującym w komórkach zwierzęcych. To dzięki niej w normalnie funkcjonujących komórkach istnieje odpowiednio stały stosunek GSSG/GSH (Sies 1991). W przypadku zahamowania aktywności GSH-Rd nadmiar powstającego GSSG może być wydalany poza komórkę (Lapshina i Bartosz 1995). GSH nie tylko usuwa H202(Rosenblat i Aviram 1998), ale także uczestniczy w enzymatycznych reakcjach koniugacji z egzogennymi i endogennymi reaktywnymi metabolitami powstającymi w czasie metabolizmu ksenobiotyków (Onaran i wsp. 1998). Zapobiega również uszkodzeniom komórek wywoływanym przez związki elektrofilowe (Zimniak i Awasthi 1993), szok cieplny (Aucoin i wsp. 1995), promieniowanie

17 ultrafioletowe (Leccia i wsp. 1998), promieniowanie jonizujące (Shimizu i wsp. 1998), infekcję (Meister 1995), a także przez różne oksydanty (Hiragama i Yasutake 1998). W tej ochronnej roli GSH nie jest odosobniony i jest efektywnie wspomagany przez inne składniki wchodzące w skład antyoksydacyjnego systemu komórkowego, mianowicie katalazę, GSH-Px, GSH-Rd, SOD, witaminę C i witaminę E. Witaminy te podobnie jak tiole białkowe dzięki GSH są utrzymywane w stanie zredukowanym (Meister 1991). Na tej podstawie sugeruje się, że istnieją synergistyczne interakcje pomiędzy wszystkimi składnikami antyoksydacyjnego systemu komórkowego (Allen i Venkatraj 1992). Interesujący jest fakt, że w reakcjach przeciwdziałających komórkowym uszkodzeniom zawsze obniża się ilość wewnątrzkomórkowego GSH, która jednak szybko powraca do normy, kiedy ustanie działanie czynnika obniżającego jego poziom (Ishikawa i Sies 1989). Dlatego też zmiany w zawartości i w tempie metabolizmu GSH w różnych tkankach decydują 0 ich wrażliwości na czynniki wywołujące stres oksydacyjny (Lautier 1wsp. 1992). GSH odgrywa także ważną rolę w funkcjach immunologicznych, np. w aktywacji limfocytów i ich cytotoksyczności (Staal i wsp. 1990). Potwierdzają to badania nad wpływem GSH na wirusa HIV. W czasie zakażenia tym wirusem zawsze obniża się koncentracja GSH w krwi (Staal i wsp. 1993). Ponieważ grupy -SH glutationu odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu limfocytów i regulacji czynników transkrypcyjnych, np. NFkB, to obniżenie się koncentracji tych grup przyczynia się do postępu choroby. I rzeczywiście infekcja HIV w zakażonych komórkach ulega zahamowaniu w warunkach wzrostu koncentracji sulfhydryli (Mihm i wsp. 1991). Bardzo wyraźnie potwierdzają to badania Palamara i wsp. (1996), a także Sprietsma (1999), w których wykazano, że bezpośrednie podanie GSH w pierwszych tygodniach zakażenia wirusem HIV powoduje regres choroby. Od niedawna nieśmiało mówi się o tym, że GSH może pełnić rolę neurotransmitera, przez co może wpływać na neuronalną aktywność mózgu (Shaw i wsp. 1996). Mówi się także o jego udziale w przekazywaniu sygnałów wewnątrz komórki (Sundaresan i wsp. 1995), jak również o jego hamującym wpływie na apoptozę komórek (Pan i Perez-Polo 1993; Ylachaki i Meyn 1998). Sądzi się tak, gdyż GSH uczestniczy w utrzymy

18 waniu równowagi między proliferacją a apoptyczną śmiercią komórek (Celli i wsp. 1998). Sugeruje się także, że koniuganty GSH powstające w reakcjach katalizowanych przez GSH-Tr, a także GSSG są niezwykle czułymi biomarkerami wskazującymi na obecność czynnika toksycznego w organizmie (Cross i wsp. 1992; Nemeth i Boda 1994). Co więcej, mogą nawet określać naturę interakcji tego czynnika z docelowymi strukturami komórkowymi (Smith i wsp. 1996). Poza niewątpliwie istotnym i ochronnym wpływem GSH na organizm nie należy zapominać, że w niektórych sytuacjach jego wysoki poziom czyni chore tkanki opornymi na podawane leki. Aby więc terapia była skuteczniejsza, celowo obniża się ilość GSH. Dopiero bowiem po obniżeniu jego ilości, komórki nowotworowe stają się bardziej wrażliwe na podawane leki przeciwnowotworowe, głównie cisplatynę (Bier i wsp. 1996). Badania nad fizjologicznymi funkcjami GSH prowadzi się głównie na ssakach. Do dzisiaj wyniki tych badań opublikowano w ponad 40 tysiącach prac (Sies 1999). Jeżeli jednak chodzi o płazy, to ilość odnośnych publikacji jest niewielka. W publikacjach tych prezentowano głównie wyniki badań nad wpływem, np. dehydratacji, ultradźwięków, głodzenia, wodorotlenku t-butylu, melatoniny, acetaminofenu, naproksenu, szoku cieplnego i zimna (Dziubek 1985, 1987a,b,c, 1997, 1998a,b, 1999a,b,c,d; López-Torres i wsp. 1993a,b) na zmiany zawartości GSH, ilości GSSG (Hermes-Lima, Storey 1988) i wartości stosunku GSSG/GSH (Hermes- Lima i Storey 1996). Wyniki tych prac nie odpowiadają na pytanie, czy można wpływać na zmiany metabolizmu glutationu u żab w okresie dla nich najbardziej niekorzystnym w ciągu roku, tj. w okresie odrętwienia zimowego, kiedy żaby przebywają w temperaturze około 4 C, nie pobierają pokarmu i mają niskie tempo metabolizmu. Okres odrętwienia zimowego jest interesujący również dlatego, że w podobnej temperaturze w jakiej zimują żaby, przechowuje się narządy przeznaczone do przeszczepów (Kevelaitis i wsp. 1997). Co więcej w skład mediów, w których są one przechowywane wchodzi także GSH, który narządom tym ma zapewnić skuteczną osłonę anty oksydacyjną, (Lemasters i Thurman 1997; Rodriguez i wsp. 1998).

19 1. Cel pracy U Rana esculenta L. w okresie odrętwienia zimowego postanowiono określić zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH pod wpływem: - podwyższenia temperatury, - wieku, - iniekcji insuliny, - podania estru monoetylowego glutationu, - allopurynolu, - kwasu L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowego, - witaminy E, - promieniowania UVA, - etanolu. W tym celu oznaczenia zawartości GSH i GSSG wykonano w mózgu, wątrobie, nerkach, sercu i skórze, ponieważ narządy te odgrywają najważniejszą rolę w metabolizmie GSH (Favilli i wsp. 1994; Sagara i wsp. 1996; Shelly i Lu 1998).

20 2. Materiał i metody 2.1. Zwierzęta Badania przeprowadzono na 420 dojrzałych i 20 młodocianych (niedojrzałych płciowo) samcach Rana esculenta L. Żaby złowiono w okresie odrętwienia zimowego (grudzień, styczeń) w ich naturalnym środowisku, gdy zimowały w wodzie o temperaturze wynoszącej około 4 C. W celu zbadania wpływu danego czynnika na metabolizm GSH, dobierano płazy o podobnej długości ciała. Długość żab mierzono od początku pyska do otworu kloaki. W pracowni płazy dzielono na dwie grupy. Jedną grupę przetrzymywano przez okres 9 dni w temperaturze 4 C (temperatura zbliżona do temperatury zimowiska), zaś drugą w temperaturze 14 C. Temperatury te utrzymywano w czasie trwania eksperymentu, aż do momentu uśpienia żab Narządy Przed pobraniem narządów płazy były usypiane w narkozie eterowej. Następnie w zależności od rodzaju eksperymentu preparowano mózg (M), wątrobę (W), nerki (N), serce (S), skórę (Sk.) oraz pobierano krew w celu uzyskania surowicy. Pobrane narządy dokładnie fragmentowano i płukano w oziębionym płynie fizjologicznym (0,6% roztworze NaCl) w celu usunięcia z nich krwi. Bezpośrednio po wypłukaniu krwi z narządów wykonywano oznaczenia.

21 2.3. Grupy badawcze Wpływ wieku badano na niedojrzałych młodocianych (4,5-5,4 cm) i dojrzałych płciowo żabach (7,5-8,5 cm), natomiast wpływ temperatury na dojrzałych płciowo żabach (7,5-8,5 cm), po ich 9-dniowym przetrzymywaniu w temperaturze 4 C lub 14 C. Wpływ insuliny, estru monoetylowego glutationu, allopurynolu, kwasu L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowego (OTZ), witaminy E (DL-a-tocopheryl acetate), promieniowania UVA oraz etanolu badano u dojrzałych płciowo żab, przetrzymywanych w laboratorium przez 9 dni w temperaturze 4 C lub 14 C, w 6, 12 lub 24 godziny po iniekcji insuliny lub soli fizjologicznej. Dawki związków podano w opisie pod tabelami. Insulinę, ester monoetylowy glutationu, OTZ i sól fizjologiczną wstrzykiwano do worków limfatycznych, natomiast allopurynol, witaminę E i etanol podawano bezpośrednio do żołądka. W celu zbadania wpływu UVA żaby naświetlano przez 70 lub 140 minut lampą F20T12BLB Damar emitującą promieniowanie UVA o maksymalnej długości fali 365 nm. Natężenie promieniowania mierzono radiometrem UVX z sensorem UVA (365 nm, Model UVX-36 UP) Odczynniki Zestaw do oznaczania glukozy BIOCHEMTEST EO, etanol (C2H5OH), fosforan potasowy II zasadowy (K2HPO4), kwas solny (HC1), sodowy fosforan I zasadowy (NaH2PC>4), wersenian dwusodowy (C 6Hi408N2Na2 2H20 ; EDTA), kwas trójchlorooctowy (C2HCI3O2), octan sodowy bezwodny (C2H80 2Na) pochodziły z firmy Polskie Odczynniki Chemiczne, natomiast insulina z CEFARM-u. Batho-phenantroline disulfonic acid (C24H16N20 6S2), GSH (C12H2,N30 6S), GSSG (C2oH32N60 12S2), TRIS (C4H11NO3), kwas 5,5-dwutio-dwu-(2-nitrobenzoesowy) (C14H8N2O8S2; DTNB), NADPH, ester monoetylowy glutationu (C12H2N3O6S), allopurynol (C5H4N4O), DL-a-tocopheryl acetate pochodziły z SIGMY, zaś akrylonitryl (H2C=CHCN) i kwas L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowy (C4H5NO3S; OTZ) z Aldrich Chemical Company.

22 2.5. Oznaczanie GSH metodą Ellmana (1959) Odważano 100 mg narządu i homogenizowano w homogenizatorze z tłokiem teflonowym w 6 ml buforu fosforanowego 0,1 M o ph 7,4 zawierającym 10 mm EDTA. Homogenaty wirowano w wirówce MPW 263 w temperaturze 4 C przez 15 minut, przy obr./minutę. Tak uzyskany supernatant odbiałczano dodając do 500 pl supernatantu, 500 pl TCA oraz 500 pl EDTA. Mieszaninę tę wstawiano do lodówki na 10 minut do temperatury 4 C, a następnie wirowano przez 5 minut przy 5000 obr./minutę. Oznaczenie przeprowadzono dodając próbki badanych supematantów do mieszaniny zawierającej 3,2 M bufor TRIS-HC1 o ph 8,1 i 10 mm EDTA. Następnie dodawano DTNB w 0,05 mm buforze octanowym o ph 5,0. Po upływie 10 minut odczytywano ekstynkcję spektrofotometrem MARCEL S333, przy długości fali 412 nm w porównaniu do próby kontrolnej, którą stanowił roztwór zawierający 10% TCA, 10 mm EDTA i 0,1 M bufor fosforanowy o ph 7,4 w stosunku 1:1:1. DTNB reagując z grupami -SH daje żółte zabarwienie od powstającego kwasu nitrobenzoesowego (TNBA) Oznaczanie GSH i GSSG metodą Matsumoto i wsp. (1996) Pobrane fragmenty narządów o wadze 100 mg homogenizowano w temperaturze 4 C przez 1 minutę w 2 ml 0,1 M HC1 zawierającego 1 mm BAPS (Batho-phenantroline disulfonic acid). Do homogenatu dodawano 170 pl 9,2 M kwasu nadchlorowego. Tak przygotowany homogenat wirowano przez 15 minut przy obr./minutę w temperaturze 4 C. Uzyskany supernatant zobojętniano 2 ml 2 M K2HP04, a następnie całość wirowano przez 15 minut przy 5000 obr./na minutę. Dla określenia ilości GSH supernatant rozcieńczano 100-krotnie 125 mm fosforanem sodu o ph 7,5 zawierającym 6,3 mm EDTA. Do 50 pl rozcieńczonego supernatantu dodawano 1ml mieszaniny zawierającej 0,21 pm NADPH, 0,6 pm DTNB, 125 pmol fosforanu sodu (ph 7,5) i 6,3 pm EDTA i mierzono ekstynkcję przy długości fali 412 nm.

23 Dla określenia ilości GSSG, dodawano do 20 fil akrylonitrylu (295 mm) 50 pl nie rozcieńczonego supematantu i 125 pm fosforanu sodu (ph 8,0) zawierającego 6,3 pm EDTA do objętości 1ml. Całość inkubowano w temperaturze 25 C przez 10 minut. Po inkubacji mierzono ekstynkcję przy długości fali 412 nm. W procedurze tej akrylonitryl blokuje tiolowe grupy -SH Oznaczenie glukozy Do probówki odpipetowano roztwór odbiałczający (kwas nadchlorowy 0,66 M/l) i surowicę krwi w stosunku 10:1. Mieszaninę tę wirowano przez 15 minut przy 3000 obr./min. Tak uzyskany supernatant używano do oznaczeń stężenia glukozy. W tym celu do 0,05 ml supematantu dodawano 2,5 ml roztworu roboczego dostarczanego wraz z zestawem do oznaczania glukozy BIOCHEMTEST EO (Polskie Odczynniki Chemiczne). Po wymieszaniu i pozostawieniu mieszaniny na 20 minut w temperaturze pokojowej mierzono absorbancję próby badanej względem próby odczynnikowej zawierającej 2,5 ml roztworu roboczego i 0,05 ml roztworu odbiałczającego, przy długości fali X= nm w kuwecie o grubości warstwy d=l cm. Pomiary zawsze wykonywano przed upływem 50 minut od momentu dodania roztworu roboczego. W metodzie tej wykorzystuje się fakt, że glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej (EC ) utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem H202. Reakcja ta przebiega w obecności peroksydazy (EC ) i chromogenu [sól sodowa kwasu 2, 2 -azyno-dwu-(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowego)]. Natężenie powstałego zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia glukozy w badanej próbce. Stężenie glukozy w badanej surowicy odczytywano ze sporządzonej krzywej kalibracyjnej Statystyczna analiza wyników Z uzyskanych danych, w poszczególnych grupach badawczych, wyliczono średnie arytmetyczne oraz odchylenia standardowe. W celu uzyskania odpowiedzi na pytanie, czy występuje zróżnicowanie w zawartości GSH, GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH pomiędzy wszystkimi gru-

24 parni w poszczególnych narządach, zastosowano analizę wariancji ANOVA (Winnicki i Wagner 1988). Za pomocą tej analizy starano się wykazać, czy zastosowane czynniki doświadczalne w istotny sposób wpłynęły na uzyskane zmiany badanych parametrów w poszczególnych narządach. Istotność różnic podano na podstawie danych zawartych w komputerowym programie statystycznym Origin. Dla stwierdzenia, czy uzyskane różnice w zawartości glukozy, GSH, GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH między poszczególnymi średnimi w grupach badawczych są statystycznie istotne, zastosowano test t Studenta Gosseta (Fisz 1967). Wszystkie obliczenia statystyczne wykonano przy użyciu programu komputerowego Statistica i Origin.

25 3. Wyniki 3.1. Wpływ wieku na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH W mózgu, wątrobie i w nerkach stwierdzono statystycznie istotny spadek zawartości GSH, wzrost zawartości GSSG oraz wzrost wartości stosunku GSSG/GSH u osobników starszych (dojrzałych płciowo) w porównaniu z osobnikami młodocianymi (niedojrzałymi płciowo) (Tabela 1, Rye. 1). Niezależnie od wieku największą zawartość GSH i GSSG stwierdzono w wątrobie, a najmniejszą w mózgu. W przypadku stosunku GSSG/GSH u osobników młodocianych największe wartości uzyskano w wątrobie, a najmniejsze w mózgu. Inaczej u osobników starszych, u których największe wartości tego stosunku stwierdzono w nerkach, a najmniejsze w wątrobie.

26 Rye. I. Zawartość: a) GSH, b) GSSG, c) wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L. w zależności od wieku. Mł. - osobniki młodociane (n=10) o długości ciała 4,5-5,4 cm; D - osobniki dojrzałe (n=10) o długości ciała 7,5-8,5 cm. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy Mł. przy p< 0, 01 (**), p< 0,001 (***)

27 3.2. Wpływ podwyższenia temperatury na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH W mózgu, wątrobie i nerkach żab pochodzących z temperatury 14 C wykazano statystycznie istotny wzrost zawartości GSH oraz statystycznie istotny spadek zawartości GSSG, a także spadek wartości stosunku GSSG/GSH w porównaniu z płazami pochodzącymi z temperatury 4 C (Tabela 2, Ryc. 2). Niezależnie od temperatury największą zawartość GSH stwierdzono w wątrobie, a najmniejszą w mózgu. W temperaturze 4 C największą zawartość GSSG stwierdzono w wątrobie, a najmniejszą w mózgu. Natomiast w podwyższonej temperaturze największa zawartość GSSG została wykazana w nerkach, a najmniejsza w wątrobie. Niezależnie od temperatury największa wartość stosunku GSSG/GSH została stwierdzona w nerkach, a najmniejsza w mózgu.

28 b c Rye. 2. Zawartość: a) GSH, b) GSSG, c) wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L. w temperaturze 4 lub 14 C. Różnica statystycznie istotna w stosunku do osobników z 4 C przy p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p< 0,001 (***), n= 10

29 3.3. Wpływ insuliny na zawartość glukozy, GSH, GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH Iniekcja insuliny nie wywołała statystycznie istotnych zmian w ilości glukozy w surowicy krwi, ani też w zawartości GSH, GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH w mózgu, wątrobie, nerkach i sercu płazów pochodzących z temperatury 4 C. Statystyczne istotne zmiany w ilości glukozy stwierdzono po 12 godzinach od iniekcji insuliny u żab w temperaturze 14 C. W tej temperaturze spadkowi ilości glukozy towarzyszył statystycznie istotny wzrost zawartości GSH i równoczesny spadek ilości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH. Po 24 godzinach od iniekcji insuliny ilość glukozy oraz zawartość GSH, GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH powróciły do wartości zbliżonych do kontrolnych (Tabela 3, Ryc. 3, 4, 5 i 6). W temperaturze 14 C insulina wywołała największe zmiany w zawartości GSH w mózgu (F = 231,8286), a najmniejsze w wątrobie (F = 104,1835). W przypadku GSSG podobnie największe zmiany stwierdzono w mózgu ( F=180,2151), a najmniejsze w wątrobie (F = 98,1934). czas po iniekcji Ryc. 3. Zawartość glukozy w surowicy krwi R. esculenta L. w temperaturze 4 lub 14 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub insuliny (In.) (10 j. m. na osobnika), 12 h lub 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,05 (*), n = 10

30 a I I S - 12 h In.-12 h ^ 0,6 - (0 O 0.4- Ofl N S 14 C 0 1 (fi CD Ryc. 4. Zawartość GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (S) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4 C, b) 14 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub insuliny (In.) (10 j. m. na osobnika), 12 h lub 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,001 (* *), n = 10

31 Rye. 5. Zawartość GSSG w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (S) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4 C, b) I4 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub insuliny (In.) (10 j. m. na osobnika), 12 h lub 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,05 (*), p< 0,01 (*) oraz p< 0,001 (***), n= 10

32 0,005-4 C UZI S - 12h In - 12 h In.- 24 h X 0,023 0) 2 g opis (/) OT ooo 0,005-0,000 i M m I w N C O.OOB- OT S Oco ** 8 ojooe- 0,000 p I M.1 W i I 1 N ** i I /?yc. 6. Wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (S) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4 C, b) 14 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub insuliny (In.) (10 j. m. na osobnika), 12 h lub 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p 0,05 (*), p< 0,01 (*) oraz p< 0,001 (***), n= 10

33 3.4. Wpływ estru monoetylowego glutationu na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Podanie estru monoetylowego glutationu płazom pochodzącym z temperatury 4 C nie wywołało istotnych zmian w zawartości GSH, GSSG oraz w wartości stosunku GSSG/GSH. Zmiany takie wykazano tylko u żab zaadaptowanych do temperatury 14 C (Tabela 4, Ryc. 7, 8 i 9). W temperaturze 4 C oraz 14 C generalnie największą zawartość GSH stwierdzono w wątrobie, a najmniejszą w sercu. Natomiast największe zmiany w zawartości GSH po podanym estrze zanotowano w sercu (F = 600,4493), a najmniejsze w mózgu (F = 111,6455). Ester monoetylowy glutationu wywołał największy spadek zawartości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH po 6 i 12 godzinach w temperaturze 14 C.

34 M W N S 14 C zo- 1* OJ 1Z- 1JD- X 08- O) O i N * *** *** S Ryc. 7. Zawartość GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (S) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4 C, b) 14 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub estru monoetylowego glutationu (E) (20 mg na osobnika), 6 h, 12 h lub 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,05 (*), p< 0,01 ( *),p<; 0,001 (** ), n= 10

35 GSSGuM/g M W N S 14 C M W N S Ryc. 8. Zawartość GSSG w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (S) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4 C, b) 14 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub estru monoetylowego glutationu (E) (20 mg na osobnika), 6 h, 12 h lub 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p 0,05 (*), p< 0,01 ( ), p<, 0,001 (***), n= 10

36 14 C Ryc. 9. Wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (S) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4 C, b) 14 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub estru monoetylowego glutationu (E) (20 mg na osobnika), 6 h, 12 h lub 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy, p< 0,01 (**), p< 0,001 (***), n= 10

37 3.5. Wpływ allopurynolu na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Podanie allopurynolu żabom przebywającym w temperaturze 4 C nie wywołało zmian w zawartości GSH, GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH. Odwrotnie w temperaturze 14 C zanotowano wzrost zawartości GSH oraz spadek zawartości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH w mózg i sercu po 12 godzinach, a w wątrobie po 6 i 12 godzinach od momentu podania allopurynolu (Tabela 5, Ryc. 10, 11 i 12). Największe zmiany w zawartości GSH po podaniu allopurynolu stwierdzono w nerkach (F = 296,2985), a najmniejsze w wątrobie (F = 161,1717). Podobnie w przypadku GSSG (F= 182,2016, F= 112,3427).

38 I I , I I S - 6 h /VI.- 6 h /VI - 12 h /VI h 14 C Rye. 10. Zawartość GSH w nerkach (N), wątrobie (W) i sercu (S) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4 C, b) 14 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub dożołądkowym podaniu allopurynolu (Al) (300 mg/kg), 6 h, 12 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p 0,05 (*), p< 0,01 (**), p< 0,001 ( **), n= 10

39 14 C Ryc. 11. Zawartość GSH w nerkach (N), wątrobie (W) i sercu (S) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4 C, b) 14 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub dożołądkowym podaniu allopurynolu (Al) (300 mg/kg), 6 h, 12 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,001 (***), n = 10

40 CZHS-6h (^^Al.-6h s Ryc. 12. Wartość stosunku GSSG/GSH w nerkach (N), wątrobie (W) i sercu (S) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4 C, b) 14 C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub dożołądkowym podaniu allopurynolu (Al) (300 mg/kg), 6 h, 12 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p< 0,001 (* *), n= 10

41 3.6. Oddziaływanie kwasu L-2-oksotiazolidyno- -4-karboksylowego (OTZ) na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Podanie OTZ płazom pochodzącym z temperatury 4 C nie wpłynęło istotnie na zmiany zawartości GSH. Natomiast w temperaturze 14 C zmiany takie wystąpiły po 6 godzinach. Po 24 godzinach uzyskane wartości zbliżyły się do kontrolnych. OTZ po 6 godzinach spowodował statystyczny spadek nie tylko zawartości GSSG, ale także wartości stosunku GSSG/GSH w badanych narządach, w temperaturze 4 C jak i 14 C. W przypadku GSSG spadek ten został stwierdzony również w wątrobie w temperaturze 4 C jak i 14 C po 24 godzinach, a w nerkach tylko w temperaturze 14 C. Po 24 godzinach spadek wartości stosunku GSSG/GSH stwierdzono również w wątrobie w temperaturze 4 C (Tabela 6, Ryc. 13, 14 i 15). OTZ wywołał u badanych żab bardzo wyraźne zmiany w zawartości GSH, GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH. I tak, w przypadku GSH największe zmiany stwierdzono w wątrobie (F = 255,2590), natomiast najmniejsze w nerkach (F = 161,8625). Największe zmiany w zawartości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH po podaniu OTZ uzyskano w nerkach (GSGG, F = 175,1380; GSSG/GSH, F= 158,8831), a najmniejsze w wątrobie (GSSG, F = 6,3655; GSSG/GSH, F = 67,5310).

42 GSHpM/g GSHpM/g 14 C 13. Zawartość GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L. po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub OTZ (O), (2,4 g/kg) w temperaturze a) 4 C i b) 14 C, 6 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p 0,05 (*), p<; 0,01 (* ), pś 0,001 (***), n = 10

43 N 14 C OJ CO ojtm- Opto- OOOB- O ,001- ooce- OOQD- b P M i N flyc. 74. Zawartość GSSG w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L. po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub OTZ (O), (2,4 g/kg) w temperaturze a) 4 C i b) 14 C, 6 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,05 (*), p<; 0,01 (* ), pś 0,001 (***), n = 10

44 GSSG/GSH GSSG/GSH Ryc. 15. Wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L. po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub OTZ (O), (2,4 g/kg) w temperaturze a) 4 C i b) 14 C, 6 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p< 0,001 (***), n= 10

45 3.7. Wpływ witaminy E na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Podanie witaminy E płazom pochodzącym z temperatury 4 C nie wywołało statystycznie istotnych zmian w zawartości GSH w badanych narządach. W tej temperaturze stwierdzono natomiast po 12 godzinach od podania witaminy statystycznie istotny spadek zawartości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH. W temperaturze 14 C witamina E wywołała statystycznie istotny wzrost zawartości GSH po 12 godzinach od momentu jej podania. W tym czasie stwierdzono również spadek zawartości GSSG i spadek wartości stosunku GSSG/GSH (Tabela 7, Ryc. 16, 17 i 18). Podanie witaminy E wywołało największe zmiany w zawartości GSH w sercu (F = 643,4868), a najmniejsze w nerkach (F = 289,2958). W przypadku GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH największe zmiany zanotowano w wątrobie (GSSG, F = 571,7327; GSSG/GSH F = 519,9875), a najmniejsze w sercu (GSSG, F = 162,4296; GSSG/GSH, F = 389,7310).

46 4 C 14 C Ryc. 16. Zawartość GSH w wątrobie (W), sercu (S) i nerkach (N) R. esculenta L. po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub podaniu witaminy E (T), (50 mg/kg) w temperaturze a) 4 C i b) 14 C, 12 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p<0,05 (*), pś0,01 (* ), n = 10

47 GSSGuM/g GSSG pm/g b 14 C W S N Rye. 17. Zawartość GSSG w wątrobie (W), sercu (S) i nerkach (N) R. esculenta L. po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub podaniu witaminy E (T), (50 mg/kg) w temperaturze a) 4 C i b) 14 C, 12 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p<0,05 (*), p<0,01 (**), p<0,001 (***), n = 10

48 b 14 C Rye. 18. Wartość stosunku GSSG/GSH w wątrobie (W), sercu (S) i nerkach (N) R. esculenta L. po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub podaniu witaminy E (T), (50 mg/kg) w temperaturze a) 4 C i b) 14 C, 12 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p<0,05 (*), p<0,01 (**), p<0,001 (***), n= 10

49 3.8. Wpływ promieniowania UVA na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Naświetlanie żab UVA przez 70 i 140 minut spowodowało statystycznie istotny spadek zawartości GSH, wzrost zawartości GSSG oraz wzrost wartości stosunku GSSG/GSH, po 12 godzinach od momentu ekspozycji. Po 24 godzinach zawartość GSH, GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH zbliżyły się do tych, które uzyskano w kontroli, z wyjątkiem nerek w przypadku GSH (Tabela 8, Ryc. 19, 20 i 21). Statystycznie największe zmiany w zawartości GSH wystąpiły w skórze (F = 162,802), a najmniejsze w wątrobie (F = 45,4669). UVA wywołało statystycznie największe zmiany w zawartości GSSG w nerkach (F = 95,3918), a najmniejsze w mózgu (F = 3,8087). Podobnie w przypadku wartości stosunku GSSG/GSH statystycznie największe zmiany stwierdzono w nerkach (F = 217,4946), a najmniejsze w mózgu (F = 47,1863).

50 UVA - 70 minut O) (ZZ)K-12h E223 A - 12 h E=3 A - 24 h ^ M 1 I W N i UVA minut > i M IP ii ii w I II i N Ryc. 19. Zawartość GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i skórze (Sk) R. esculenta L. kontrolnych (K) i naświetlanych UVA (A): a) 70 min UVA (305 W/cm2), b) 140 min UVA (610 W/cm2), 12 h lub 24 h po ekspozycji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy K przy p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p< 0,001 (***), n = 10

51 Ryc. 20. Zawartość GSSG w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i skórze (S) R. esculenta L. kontrolnych (K) i naświetlanych UVA (A): a) 70 min UVA (305 W/cm2), b) 140 min UVA (610 W/cm2), 12 h lub 24 h po ekspozycji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy K przy p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p< 0,001 (***), n= 10

52 i co 8 o co 8 0, D ,016-0,014-0, ,0GB ,001-0,002-0,000- b UVA minut *** M W N S Ryc. 21. Wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i skórze (S) R. esculenta L. kontrolnych (K) i naświetlanych UVA (A): a) 70 min UVA (305 W/cm2), b) 140 min UVA (610 W/cm2), 12 h lub 24 h po ekspozycji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy K przy p^ 0,05 (*), p< 0,01 (*"'), p< 0,001 (***), n= 10

53 3.9. Wpływ etanolu na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Nie stwierdzono wpływu zastosowanych dawek etanolu na zmiany zawartości GSH w temperaturze 4 C. W tej temperaturze po 12 godzinach od momentu podania etanolu wykazano statystycznie istotny wzrost zawartości GSSG i wzrost wartości stosunku GSSG/GSH. W nerkach stosunek GSSG/GSH był statystycznie istotny również po 24 godzinach. W temperaturze 14 C po 12 godzinach od podania etanolu stwierdzono statystycznie istotny spadek zawartości GSH oraz równoczesny wzrost zawartości GSSG i wzrost wartości stosunku GSSG/GSH. W przypadku GSSG i GSSG/GSH wzrost ten okazał się także statystycznie istotny po 24 godzinach (Tabela 9, Ryc. 22, 23 i 24). Etanol wywołał największe zmiany w zawartości GSH i GSSG w temperaturze 4 C i 14 C w mózgu (GSH - F = 235,5160, GSSG - F = 333,5637), a najmniejsze w nerkach ( GSH - F = 84,8812, GSSG - F = 149,9450). Największe zmiany w wartości stosunku GSSG/GSH etanol wywołał w nerkach (F = 149,9450), a najmniejsze w wątrobie (F = 51,8238).

54 14 C o> I M W N Ryc. 22. Zawartość GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. escułenta L. po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub podaniu etanolu (Et.) (40% 4 g/kg) w temperaturze a) 4 C i b) 14 C, 12 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,05 (*), p< 0,001 (***), n = 10

55 GSSGtW/g GSSGj*/l/g 14 C Ryc. 23. Zawartość GSSG w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenła L. po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub podaniu etanolu (Et.) (40% 4 g/kg) w temperaturze a) 4 C i b) 14 C, 12 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p 0,05 (*), p< 0,01 (**), p< 0,001 (** ), n= 10

56 GSSG/GSH GSSG/GSH 14 C Ryc. 24. Wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L. po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub podaniu etanolu (Et.) (40% 4 g/kg) w temperaturze a) 4 C i b) 14 C, 12 h, 24 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p< 0,05 (*), p< 0,001 (***), n = 10

57 4. Dyskusja 4.1. Zawartość GSH jest odwrotnie proporcjonalna do zawartości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH U badanych żab w okresie odrętwienia zimowego ponad 99% glutationu występuje w formie zredukowanej (GSH), natomiast niecałe 1% w postaci utlenionej (GSSG). Zawartość GSH jest odwrotnie proporcjonalna do zawartości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH. Najważniejszą rolą GSH jest jego udział w usuwaniu H20 2i nadtlenków organicznych (np. nadtlenków lipidowych) przy udziale selenozależnej GSH-Px (Ji i wsp. 1992, 1995). GSH-Px katalizuje redukcję H202lub nadtlenków organicznych do H20 (Schemat 7) i alkoholi (Schemat 10) używając GSH jako donora elektronów. W tych reakcjach GSH jest utleniany do formy GSSG. 2 GSH + ROOH -> GSSG + ROH Schemat 10. Redukcja alkoholi przez GSH Reakcje te są bardzo ważne dla prawidłowego funkcjonowania komórek, ponieważ GSSG może wchodzić w reakcję z grupami -SH białek i poprzez tworzenie mieszanych dwusiarczków prowadzić do zahamo

58 wania ich funkcji (Papp i wsp. 1999). Poza reakcjami redukcji GSSG jest także aktywnie wydalany z komórek przez aktywny transport zależny między innymi od jego wewnątrzkomórkowej zawartości (Iantomasi i wsp. 1995). GSSG jest ciągle redukowany do GSH przez GSH-Rd, przy udziale NADPH (Schemat 8). Reakcje katalizowane przez GSH-Px są sprzężone z reakcjami GSH-Rd, przez co tworzą cykl regenerujący GSH (Schemat 11), określany również mianem cyklu oksydoredukcyjnego glutationu (Meister 1995). Schemat 11. Cykl regeneracji glutationu Dzięki tym reakcjom w komórkach istnieje na ogół stały stosunek GSSG do GSH. Potencjał oksydoredukcyjny tego układu wynosi -0,23 V, dzięki czemu układ ten jest dobrym reduktantem i zmiataczem reaktywnych związków elektrofilowych. Dzięki ujemnemu potencjałowi oksydoredukcyjnemu mogą funkcjonować antyoksydacyjne enzymy komórkowe (Kihlstrom 1992; Kretzschmar i wsp. 1992). W sytuacji stresu podnosi się jednak zawartość GSSG i wzrasta wartość stosunku GSSG/GSH. W takiej sytuacji dochodzi do zahamowania biosyntezy białka czy fosforylacji fosfataz (Staal i wsp. 1994; Sundaresan i wsp. 1995; Denu i Tanner 1998). Ponadto zawartość GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH jest skorelowana z zakresem oksydacyjnych uszkodzeń mitochondrialnego DNA (Sastre i wsp. 1996). W normalnych warunkach fizjologicznych wzrost konsumpcji GSH jest kompensowany przez wzrost jego syntezy, a także przez redukcję

59 GSSG. Te mechanizmy wystarczają do utrzymania odpowiedniego poziomu GSH w tkankach (Boya i wsp. 1999). U badanych żab w okresie hibernacji oraz w podwyższonej temperaturze podanie insuliny, estru monoetylowego glutationu, allopurynolu, OTZ czy witaminy E wywołało wzrost zawartości GSH oraz równoczesny spadek ilości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH. Podanie OTZ oraz witaminy E wywołało taki spadek również w temperaturze 4 C. Natomiast w stresie wywołanym etanolem spadkowi zawartości GSH towarzyszył wzrost zawartości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH zarówno w temperaturze 4 jak i 14 C. Z całą pewnością u płazów utrzymuje się odpowiednio stały stosunek GSSG/GSH i to pomimo wyjątkowo niekorzystnych warunków w okresie zimowania. Zmiany w wartości tego stosunku odzwierciedlają reakcje organizmu żab na związki indukujące względnie hamujące wzrost zawartości GSH oraz GSSG Zawartość GSH maleje z wiekiem Zawartość GSH zmienia się wraz z wiekiem żab. Żaby dojrzałe mają mniej GSH, natomiast więcej GSSG oraz większą wartość stosunku GSSG/GSH niż osobniki młodociane. Tabela 1 Wpływ wieku na zawartość GSH, GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) oraz nerkach (N) żab. Wartości istotnie wzrastają (T), maleją (4) Zwierzęta M, W, N M, W, N M, W, N Młodociane-^ Dojrzałe GSH GSSG GSSG/GSH i i i t t t t T t Wpływ wieku na zawartość GSH badano u różnych gatunków ssaków (Lang i wsp. 1992; Iantomasi i wsp. 1993). Uzyskiwano wyniki rozbieżne, gdyż albo nie wykazywano zależności między wiekiem osobników a ilością GSH (Barja de Quiroga i wsp. 1990), albo wykazywano je tylko częściowo (Farooqui i wsp. 1987). Te rozbieżności zdaniem Christon i innych (1995) mogą zależeć tylko od wieku zwierząt. Okazuje się

60 bowiem, że uzyskiwano wyniki całkowicie różne kiedy porównywano stare szczury z młodymi 2-miesięcznymi i stare też z młodymi ale już 6-miesięcznymi (Iantomasi i wsp. 1993). Bardzo wyraźny spadek ilości GSH stwierdzono w mózgu starych zwierząt (Benzi i wsp. 199la, b). Ma na to niewątpliwie wpływ osłabiona efektywność eliminacji H2O2 z mózgu tych zwierząt, z powodu obniżania się aktywności katalazy z wiekiem (Sastre i wsp. 1996). Powstający w nadmiarze H2C>2 przenika przez błony biologiczne (Halliwell 1990), indukuje reakcje wolnorodnikowe i w ostateczności uszkadza komórki (Saran i Bors 1991). Uczestniczy również w powstawaniu wyjątkowo groźnego rodnika hydroksylowego (*OH). Może także tworzyć addukty z wieloma składnikami komórek (Schubert i Wilmer 1991). Jednym z najczęstszych takich adduktów jest addukt z histydyną który wyraźnie zwiększa transfer H2C>2 do komórki, przez co dodatkowo wzrasta ilość powstających rodników *OH. Ilość tych rodników bardzo wyraźnie wzrasta w obecności metali przejściowych, co objawia się wzrostem aberacji chromosomowych, głównie w fibroblastach ludzkich embrionów (Oya i Yamamoto 1988). Oprócz katalazy H2O2 jest rozkładany przez GSH-Px. W tej reakcji GSH jest donorem elektronów i jest utleniany do GSSG (Halliwell i Gutteridge 1989). Jeżeli ilość GSH obniży się znacznie, a tak jest zawsze u osobników starych (Garcia de la Asuncion i wsp. 1996; Teramoto i wsp. 1994; Nokata i wsp. 1996), to dochodzi do nadmiernego wzrostu ilości H20 2, który w obecności jonów Fe2+w reakcji Fentona zostaje przekształcony w *OH (Yamasaki i Piette, 1991) (Schemat 12): Fe2++ H202-> Fe3++ OH + -OH Schemat 12. Reakcja Fentona Rodnik ten jest wyjątkowo niebezpieczny ponieważ działa nie tylko na poziomie molekularnym, ale również komórkowym. Na poziomie molekularnym utlenia białka, powoduje peroksydację lipidów, uszkadza mitochondrialny DNA oraz zmienia ekspresję genów (Barreau i wsp. 1996). Natomiast na poziomie komórkowym wpływa na transdukcję sygnałów w komórce i zmienia funkcjonowanie błon komórkowych (Gille i Sigler 1995).

61 Końcowy etap syntezy GSH jest katalizowany przez syntetazę glutationową. Aktywność tego kluczowego enzymu zależy od dostępności ATP. Ponieważ jednak synteza ATP obniża się z wiekiem (Di Monte i wsp. 1993), to spada także aktywności tej syntetazy (Deoliveira i Deangelis 1996). Ponadto w wyniku obniżania się syntezy ATP, komórki stare otrzymują mniej aminokwasów potrzebnych do syntezy GSH (Hochwald i wsp. 1996). W ostateczności obniża się tempo biosyntezy GSH w komórkach, a tym samym spada jego koncentracja w narządach. Innym dodatkowym powodem spadku zawartości GSH u osobników starych jest wzrost aktywności transferaz S-glutationowych (Iantomasi i wsp. 1993). To powoduje, że wraz z wiekiem większa pula GSH jest wciągana w procesy detoksykacji i tworzenia glutationowych S-koniugantów. Również w procesie tym jest zużywany GSH. U Rana perezi nie wykazano wyraźnego spadku ilości GSH u osobników starych w porównaniu z młodymi (López-Torres 1993a i b). Prawdopodobnie sytuację taką wywołał fakt, że badano płazy w okresie życia aktywnego i spożywany przez nie pokarm mógł wpłynąć na uzyskane wyniki. W obecnym eksperymencie płazy do badań pochodziły z okresu zimy, nie pobierały więc pokarmu. U tych płazów poza obniżeniem się ilości GSH u osobników dojrzałych stwierdzono również wzrost zawartości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH. Wzrost zawartości GSSG u osobników starych został spowodowany wzrostem ilości RFT generowanych w mitochondriach (Sohal i Allen 1990) i wzrostem tempa utleniania GSH. W takich warunkach zdolność komórek do redukcji GSSG obniża się (Navarro i wsp. 1997). Redukcja GSSG powstającego w reakcji rozkładu H20 2katalizowanego przez GSH-Px dokonuje się przy udziale GSH-Rd z równoczesną konsumpcją NADPH + H+. Wzrastająca konsumpcja NADPH + H+i GSH przy wzroście aktywności GSH-Px, jaką obserwuje się u osobników starych, prowadzi do wzrostu toksyczności a nie detoksykacji (Farber i wsp. 1990). Dochodzi więc do objawów stresu oksydacyjnego, co przejawia się nie tylko akumulacją GSSG, ale również utlenianiem grup tiolowych białek. Ponadto podnoszący się poziom GSSG wzmaga napływ jonów wapnia do cytosolu komórek (Bellomo i wsp. 1982). Jony te powodują lezję (Thor i wsp. 1988), wzrost hydrolizy fosfolipidów i białek (Nicotera i wsp. 1985), spadek syntezy ATP i w rezultacie apoptozę komórek (Madesh i wsp. 1999).

62 Jeżeli GSSG występujący w cytozolu nie jest efektywnie redukowany do GSH to w normalnych warunkach fizjologicznych może być aktywnie transportowany poza komórki, co pozwala na utrzymanie stałego stosunku GSSG/GSH (Kihlstrom 1992). Efektywność tego transportu zależy jednak od dostępności ATP. Ponieważ, jak wcześniej wspomniano, dostępność ATP obniża się z wiekiem, to jednocześnie wzrasta w komórkach akumulacja GSSG (Kondo i wsp. 1995). W mitochondriach komórek starych zwierząt powstaje więcej RJFT niż w komórkach zwierząt młodych. Ponieważ mitochondria nie posiadają zdolności do eksportu GSSG (Reed 1990), to dlatego muszą go redukować in situ. Jeżeli zostanie zaburzona równowaga między ilością generowanych RFT a ich detoksykacją, to dochodzi do zmian w statusie redoks komórki. Zmiany te obniżają aktywności GSH-Rd i spada tempo redukcji GSSG (Stohs i wsp. 1984). W związku ze spadkiem ilości GSH u osobników starych i wzrostem zawartości GSSG, wzrasta także stosunek GSSG/GSH. Wartość tego stosunku jest nie tylko wskaźnikiem ilości generowanych RFT, ale także indeksem wolnorodnikowych uszkodzeń w komórkach (Shahal i wsp. 1991; Clahsen i wsp. 1992; Papp i wsp. 1999). Co ciekawe, wzrost wartości stosunku GSSG/GSH jest skorelowany z postępującym starzeniem się organizmu (Matsuo i wsp. 1992). Sugeruje się, że w sytuacji wzrostu akumulacji wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+, spadku produkcji ATP, przy zahamowaniu recyklingu GSH komórki są kierowane na drogę śmierci apoptycznej (Slater i wsp. 1996). Uzyskane wyniki sugerują, że wraz z wiekiem żab obniża się efektywność antyoksydacyjnej ochrony zależnej od GSH Zawartość GSH wzrasta wraz z temperaturą U R. esculenta L. temperatura ma wyraźny wpływ na metabolizm GSH. Mianowicie u żab pochodzących z temperatury 14 C stwierdzono wzrost zawartości GSH, spadek ilości GSSG oraz spadek wartości stosunku GSSG/GSH w porównaniu z żabami z temperatury 4 C.

63 Tabela 2 Wpływ temperatury na zawartość GSH, GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) żab. Wartości istotnie wzrastają (t), maleją (4) Temperatura M, W, N M, W, N M, W, N GSH GSSG GSSG/GSH 4 C->14 C t t T iii i i i Płazom warunki życia dyktuje temperatura. Gdy jest wysoka ich procesy metaboliczne są intensywne, a obniżają swoje tempo wraz z ochłodzeniem (Abe 1995). Redukcja metabolizmu płazów jest spowodowana przez: - zmianę aktywności enzymów/białek w wyniku postranslacyjnych modyfikacji, fosforylacji białek albo reakcji defosforylacyjnych, - zmianę subkomórkowej lokalizacji enzymów w wyniku innego związania się ze strukturami komórkowymi, - zmianę w regulacji tempa glikolizy, kontrolowaną przez fosfofruktokinazę (Busa i Nuccitelli 1984; Hochachka i Guppy 1987). W dostępnej literaturze większość danych dotyczących wpływu niskiej temperatury na zawartość GSH pochodzi z badań na ssakach. Co ciekawe, uzyskane dane w tych badaniach są rozbieżne. Dla przykładu Ohno i wsp. (1990), Erin i wsp. (1994) oraz Das i wsp. (1997) stwierdzili, że chroniczna ekspozycja na zimno obniża ilość GSH w mózgu i wątrobie. Przeciwnie Ohtsuka i wsp. (1994) wykazywali, że w wyniku stresu zimna wzrasta ilość GSH w erytrocytach człowieka. W jedynych badaniach, które przeprowadzono na R. temporaria L. w okresie odrętwienia zimowego, wykazano wyraźną korelację między niskim poziomem GSH, a obniżoną temperaturą (Dziubek 1987a). Dane te są zgodne z tymi, które uzyskano w obecnym eksperymencie. Niski poziom GSH u żab w temperaturze 4 C jest zapewne spowodowany zahamowaniem aktywności enzymów uczestniczących w syntezie GSH (Ohno i wsp. 1990). W związku z powyższym nasuwa się pytanie, czy tak niski poziom GSH wystarcza płazom do skutecznej ochrony antyoksydacyjnej? Z całą pewnością antyoksydacyjna ochrona komórek i tkanek przez GSH jest powiązana z innymi fizjologicznymi mechanizmami towarzyszącymi odrętwieniu zimowemu. Ta minimalna ilość GSH jaką stwierdza się

64 w czasie zimowania żab jest, jak się wydaje, wystarczająca do skutecznej detoksykacji RFT, które muszą być usunięte i to nie przez anty oksydacyjne enzymy, ponieważ te w niskiej temperaturze są nieaktywne, lecz tylko na drodze nieenzymatycznej przez GSH. Pomimo wszystko mechanizmy odpowiedzialne za utrzymanie odpowiedniego poziomu GSH u płazów w okresie odrętwienia zimowego nie są do końca jasne. Być może, poza zależnością pomiędzy temperaturą a zawartością GSH (Dziubek 1987b), istnieją jeszcze inne zależności. Takie np. zostały stwierdzone w przypadku innego antyoksydanta jakim jest witamina C, której homeostaza u zimujących żółwi w niskich temperaturach jest regulowana nie tylko przez tempo metabolizmu, ale także przez jej wewnątrzkomórkowe stężenie (Wilson i wsp. 1990). Uzyskane dane w obecnym eksperymencie są zgodne z danymi uzyskanymi w badaniach na ssakach, w których wykazano, że komórkowa zawartość GSH obniża się w stresie niskiej temperatury (Vreugdenhil i inni 1991). Jest to zapewne spowodowane nie tylko tym, że obniżona temperatura hamuje aktywność enzymów syntetyzujących GSH (Ohno i wsp. 1990), ale również tym, że zmienia ona fizjologiczne i biochemiczne parametry komórek. Komórki w takiej temperaturze cierpią na brak energii (Zeevalk i wsp. 1997), z tego powodu dochodzi do inaktywacji pomp transbłonowych (Hochachka 1986). W tych warunkach mechanizmy transportu np. aminokwasów wykorzystywanych do syntezy GSH są także ograniczone (Oliver i wsp. 1990; Traystman i wsp. 1991). U ssaków uszkodzenia spowodowane przez wzrost temperatury (43-45 C) są podobne do tych, które wywołują ksenobiotyki, ischemia, reperfuzja, głodzenie, immobilizacja czy hypotermia (Farber 1994; Kedderis 1996). Punktem wyjścia do przyjęcia takiego twierdzenia były badania Skibby i wsp. (1988), w których wykazano znaczne obniżenie się statusu redoks w komórkach wątroby psów i ludzi podczas ekspozycji na hypotermię. Podobne uszkodzenia w komórkach wywołuje stres oksydacyjny (Poli 1993). Stres ten manifestuje się nie tylko znaczną redukcją całkowitej zawartości GSH, ale także wzrostem zawrtości GSSG (Skibba i Gwartney 1997). Podobnie w obecnym eksperymencie wykazano wzrost ilości GSSG i wzrost wartości stosunku GSSG/GSH u żab w niskiej temperaturze. Świadczy to o tym, że niska temperatura jest silnym stresem także dla żab. Wzrost ilości GSSG u żab jest zapewne spowodowany zahamowaniem

65 aktywności GSH-Rd i spadkiem recyklingu GSH. Podobnie zresztą u ssaków, zwierząt stałocieplnych, stres niskiej temperatury powoduje także spadek zawartości GSH i wzrost ilości GSSG, z powodu zahamowania aktywności GSH-Rd i wzrostu ilości generowanych RFT (Siems i wsp. 1994; Teramoto i wsp. 1998). Wskaźnikiem adaptacji ssaków do długotrwałych zmian temperatury otoczenia jest wzrost zawartości GSH w tkankach (Spasie i wsp. 1993). W myśl powyższych założeń można sugerować, że uzyskany wzrost zawartości GSH i równoczesny spadek ilości GSSG oraz obniżenie się wartości stosunku GSSG/GSH u badanych żab w temperaturze 14 C świadczy o ich adaptacji do tej temperatury. Uzyskane dane dotyczące GSH są zgodne z wcześniejszymi wynikami uzyskanymi u R. temporaria L. (Dziubek 1987a,b) Insulina podwyższa zawartość GSH U żab w obniżonej temperaturze wysokiemu poziomowi glukozy w surowicy krwi towarzyszył niski poziom GSH. Podwyższenie temperatury oraz iniekcja insuliny spowodowała spadek poziomu glukozy oraz wzrost zawartości GSH i równoczesne obniżenie ilości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH. Tabela 3 Wpływ insuliny na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (S). Wartości istotnie wzrastają (t), maleją (I), pozostają bez zmian (-) Insulina Temperatura M, W, N, S M, W, N, S GSH 12 h 24 h 4 C 14 C t t t t GSSG 4 C 14 C : : : : GSSG/GSH 4 C 14 C

66 Podobnie u ssaków po iniekcji insuliny obserwowano wzrost syntezy GSH w wątrobie (Lu i wsp. 1990, 1991). U płazów w okresie zimowania obserwuje się wysoki poziom glukozy w porównaniu z okresem życia aktywnego. Dla przykładu u żaby tolerującej zamarzanie Rana sylvatica poziom glukozy w okresie zimy waha się od mm/1 w przeciwieństwie do lata, kiedy osiąga wartości od 3-5 mm/1. Wartości te są o wiele mniejsze, ale również wysokie, u żab nie zamarzających i wahają się od 1-5 mm/1 w zimie i od 0,2-0,5 m M/l w lecie (Storey i Storey 1985). Tak duży wzrost zawartości glukozy hamuje tempo metabolizmu płazów w niskich temperaturach, co ułatwia im przetrwanie (Canty i wsp. 1986; Layne i Romano 1985). U ssaków z cukrzycą wywołaną eksperymentalnie, przez podanie streptozotocyny lub alloksanu, obserwuje się wzrost ilości wodoronadtlenków lipidowych (Armstrong i Al-Awadi 1991). Ich detoksykacja przebiega poprzez glutationowy cykl redoks. Skuteczna redukcja tych wodoronadtlenków zależy od skoordynowanego działania GSH-Px, GSH-Rd i GSH (Meister 1991). Ważnym momentem w tym cyklu jest dostępność GSH i jego ciągła regeneracja z GSSG, przy udziale GSH-Rd oraz NADPH (Beutler 1994). Źródłem NADPH np. w erytrocytach jest cykl pentozowy, a w mięśniach izocytrynowa dehydrogenaza (Carabaza i wsp. 1992; Lawler i wsp. 1993). Na ilość wytwarzanego NADPH ma wpływ koncentracja NADP w komórce, koncentracja dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej i jej aktywność (Tran i wsp. 1995), jak również dostępność glukozy dla komórki. Generalnie od ilości NADPH zależy nie tylko tempo regeneracji GSH (Loven i Oberley 1985; Huang i wsp. 1998), ale także szybkość eliminacji wodoronadtlenków lipidowych z organizmów zwierząt z cukrzycą (Bravi i wsp. 1997). Powyższe dane sugerują pytanie, czy hiperglikemia u płazów w okresie zimowania poza fizjologicznym działaniem nie wywołuje dodatkowo stresu oksydacyjnego, stresu zawsze występującego w cukrzycy ssaków (Kawada 1992). Jeżeli taka sytuacja ma miejsce u płazów, to powinno się to objawiać małą zawartością GSH i stosunkowo duża ilością GSSG i odpowiednio wysoką wartością stosunku GSSG/GSH. I rzeczywiście tak jest, co potwierdzają wyniki uzyskane w obecnym eksperymencie. Produkty przemiany glukozy, tj. fosfodihydroksy-aceton, aldehyd 3-fosfoglicerynowy, a także produkty glikacji ulegają utlenianiu, w wyniku czego powstają rodniki 1-hydroksyalkilowe i RFT (Hayakawa i Ku-

67 zuya 1990). Objawia się to ogólnoustrojowym stresem oksydacyjnym, któremu towarzyszy wzrost dialdehydu maloniowego w osoczu krwi oraz obniżeniem poziomu wewnątrzkomórkowych antyoksydantów, mianowicie askorbinianu oraz GSH (Taniguhi 1990; Wolff 1993; Jiang Z.L., Sato T. 1999). Poza brakiem dostępności glukozy dla komórek jest to druga przyczyna spadku ilości GSH w cukrzycy (Barbagallo i wsp. 1999). Stwierdzony niski poziom GSH u R. esculenta L. w okresie odrętwienia zimowego, w porównaniu z okresem życia aktywnego w lecie (Dziubek 1985), świadczy o tym, że także u badanego gatunku hiperglikemia ma wpływ na zawartość GSH oraz wielkość stresu oksydacyjnego (Reed i Faris 1984). U płazów po okresie odrętwienia zimowego poziom glukozy wyraźnie się obniża w okresie życia aktywnego (Storey i Storey 1985). Świadczy to o tym, że wzrost poziomu glukozy w zimie nie jest bynajmniej spowodowany uszkodzeniem P-komórek trzustki, lecz zahamowaniem syntezy insuliny, w celu zwolnienia tempa metabolizmu płaza, co jest korzystne dla jego przetrwania w niskich temperaturach i przy braku pożywienia (Canty i wsp. 1986). Na wskutek zahamowania metabolizmu, przez podniesiony poziom glukozy, powstaje w komórkach płazów mniej RFT, przez co zmniejsza się utylizacja GSH w procesie detoksykacji tych rodników. Jest to niezwykle ważne przy małej ilości GSH w tym okresie. Niski poziom GSH w niskiej temperaturze jest również spowodowany zahamowaniem syntezy ATP. Oszczędzanie GSH w okresie odrętwienia zimowego żab jest więc koniecznością Ester monoetylowy glutationu podwyższa zawartości GSH Podanie estru monoetylowego glutationu (ester etylowy L-y-glutamylo-L-cysteinyloglicynowy) wywołuje znaczny wzrost zawartości GSH i równoczesny spadek ilości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH u żab w temperaturze 14 C.

68 Tabela 4 Wpływ estru monoetylowego glutationu na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (S). Wartości istotnie wzrastają (T), maleją (4), pozostają bez zmian (-) Ester monoetylowy glutationu Temperatura M, W, N, S M, W, N, S M, W, N, S GSH 6 h 12 h 24 h 4 C 14 C T t t - t - T T - GSSG 4 C 14 C : : : : GSSG/GSH 4 C 14 C Dotychczasowe badania wpływu estrów glutationu na zawartość GSH prowadzono wyłącznie na ssakach. W badaniach tych stwierdzono, że wzrost zawartości GSH zwiększa, a obniżenie zmniejsza oporność komórek na działanie RFT i ksenobiotyków (Sies 1993; Yamasoba i wsp. 1998). Dlatego też próbuje się doświadczalnie wpływać na zmiany zawartości GSH. Okazało się, że ilość GSH w komórkach może być obniżana albo podwyższana przez stosowanie odpowiednich związków chemicznych. I tak np. podanie butioninosulfoksyminy efektywnie blokuje syntezę GSH. Jest to bowiem związek, który selektywnie wiążąc się z aktywnym centrum syntetazy y-glutamylocysteinowej hamuje jej aktywność (Hoffman i wsp. 1987; Jurima-Romet i wsp. 1996). Przeciwnie, podanie y-glutamylocysteiny, disulfidu y-glutamylocysteiny albo y-glutamylocystyny prowadzi do wzrostu zawartości GSH, głównie jednak w nerkach. Te y-glutamyloaminokwasy są transportowane do wnętrza komórek nerek, gdzie są wykorzystywane do syntezy GSH. W pewnych warunkach patologicznych i fizjologicznych ilość GSH obniża się, np. w chorobach metabolicznych, w stresie oksydacyjnym, niewydolności układu immunologicznego podczas infekcji wirusowych, chorobie Parkinsona oraz Alzheimera (Bray Taylor 1993; Stio i wsp. 1993; Favilli i wsp. 1994; Iantomasi i wsp. 1994; Castagna i wsp. 1995). Dlatego w takich sytuacjach podwyższenie poziomu GSH wydaje się celowe.

69 Aby podnieść poziom GSH w organizmie podawano go dożołądkowo (Hagen i wsp. 1990; Aw i wsp. 1991; Witchi i wsp. 1992). Martensson i wsp. (1990) wykazywali jednak, że tak podany GSH, po dostaniu się do krążenia jest rozkładany na aminokwasy składowe, przez błonowy enzym y-glutamylową transpeptydazę i dipeptydazy. Aminokwasy te są następnie wykorzystywane przez komórkę do resyntezy GSH. Jest to jednak bardzo złożony i mało wydajny mechanizm, w którym uczestniczą enzymy cyklu y-glutamylowego (Lash i Putt 1999). Istnieje także możliwość bezpośredniego przenoszenia GSH do wnętrza komórki za pomocą specyficznych transporterów, co jest korzystne ze względu na małe wymagania energetyczne tego transportu. Co ciekawe, te mechanizmy wykorzystujące egzogenny GSH do podniesienia jego poziomu w komórce są niezależne i przebiegają równocześnie (Vincenzini i wsp. 1992). W warunkach fizjologicznych egzogenne podanie glutationu nie prowadzi do wyraźnego wzrostu ilości GSH, gdyż nie jest on bezpośrednio transportowany do wnętrza komórek (Favilli i wsp. 1997). Natomiast korzystny jest fakt, że podczas egzogennego podania GSH obserwuje się w komórkach wzrost stężenia cysteiny (Fukagawa i wsp. 1996). Podanie GSH promuje bowiem wnikanie cysteiny do wnętrza komórek, przez co wzrasta de novo synteza glutationu (Aebi i wsp. 1991). Cysteina pochodząca z rozkładu tak podanego GSH limituje jego wewnątrzkomórkową syntezę. Między innymi dlatego sądzi się, że GSH jest nie tylko formą magazynu cysteiny, ale także jej transporterem do poszczególnych narządów (Tateishi i wsp. 1977). W celu podniesienia wewnątrzkomórkowego stężenia GSH u ssaków podawano także ester monoetylowy glutationu. Po jego podaniu grupa karboksylowa glicyny zostaje zestryfikowana i po estryfikacji ester ten jest efektywnie transportowany do wnętrza komórek, gdzie szybko ulega hydrolizie przez wewnątrzkomórkowe esterazy do glutationu i odpowiedniego alkoholu (Puri i Meister 1983; Kalebic i wsp. 1991; Martensson i Meister 1991). Podanie estru monoetylowego glutationu jest korzystne również i z tego powodu, że komórka w celu jego wykorzystania nie wydatkuje energii, ponieważ wewnątrzkomórkowa hydroliza estru jest egzogeniczna (Meister i Anderson 1984).

70 Podanie estru monoetylowego glutationu nie wywołało istotnych zmian w zawartości GSH u żab w niskiej temperaturze. Temperatura ta zapewne hamuje transport zestryfikowanego estru do wnętrza komórek. Wydaje się to uzasadnione, gdyż właśnie od temperatury zależy aktywność transporterów błonowych, także transporterów GSH (RcGshT i RsGshT) (Lu i wsp. 1996). Niska temperatura z całą pewnością hamuje również aktywności enzymów uczestniczących w syntezie GSH oraz aktywność transpeptydazy y-glutamylowej, enzymu odpowiedzialnego za jego eksport z komórek i obieg w całym organizmie (Nishida 1985). Co ciekawe, w podwyższonej temperaturze w sercu statystycznie istotny wzrost GSH stwierdzono już po 6 godzinach, a w nerkach dopiero po 24 godzinach od momentu podania estru. Sugeruje to, że ester monoetylowy glutationu w pierwszej kolejności wnika do serca, o czym świadczy wzrost zawartości GSH w tym tak ważnym narządzie. Wzrost zawartości GSH w nerkach dopiero po 24 godzinach sugeruje natomiast, że import estru do nerek ma miejsce dopiero po wcześniejszym jego wniknięciu do innych narządów Allopurynol podwyższa zawartość GSH Allopurynol korzystnie wpływa na status GSH u żab w podwyższonej temperaturze. Związek ten w pierwszej kolejności zwiększa zawartość GSH w wątrobie. Tabela 5 Wpływ allopurynolu (Al) na zawartość GSH w nerkach (N), wątrobie (W) i sercu (S). Wartości istotnie wzrastają (t), pozostają bez zmian (-) Temperatura N, W,S N, W,S N, W,S GSH 6 h 12 h 24 h Allopurynol 4 C C - T - t t t... GSSG 4 C C. i. i i i... GSSG/GSH 4 C C i...

71 Niska temperatura otoczenia nie tylko hamuje aktywność metaboliczną, ale także redukuje przepływ krwi w organizmie żab. Dlatego tkanki żab w okresie odrętwienia zimowego są niedotlenione (Bradford 1983). Podobna sytuacja ma miejsce u wiewiórki, u której w okresie hibernacji przepływ krwi jest zredukowany o około 90% (Drew i wsp. 1999). U ssaków w okresie niedotlenienia (ischemii) i ponownego dopływu krwi do tkanek (reperfuzji) generowane są duże ilości RFT (Corral- Debrinski i wsp. 1991). Rodniki te w początkowym okresie indukują antyoksydacyjne systemy komórki, a także związki je zmiatające. Jeżeli jednak przedłuża się okres ischemii, to po następującej po niej reperfuzji obserwuje się wyraźne uszkodzenia oksydacyjne, głównie w wątrobie, nerkach i mięśniu sercowym. Wiadomo, że ilość tych uszkodzeń jest skorelowana z ilością generowanych RFT i aby temu przeciwdziałać podaje się allopurynol (Ferrer i wsp. 1997). Podczas ischemii i reperfuzji, głównie w czasie zawału mięśnia sercowego, a także w narządach przeszczepianych, podczas metabolizmu puryn powstaje hypoksantyna będąca prekursorem ksantyny. Zarówno hypoksantyna jak i ksantyna są substratami oksydazy ksantynowej (OX) (EC ), która utleniana je do kwasu moczowego (Saugstad i Aasen 1980). W reakcji tej dodatkowo powstają RFT (Saugstad 1996) (Schemat 13). Hypksantyna + l/202-> Ksantna +l/202-> Kwas moczowy + 0 2'* Schemat 13. Utlenianie hypoksantyny OX może redukować cząsteczkę tlenu zarówno jedno- (Schemat 14) jak i dwuelektronowo (Schemat 15). W pierwszym przypadku produktem reakcji jest 02'*: 02+ e= 02* Schemat 14. Jednoelektronowa redukcja cząsteczki tlenu w drugim zaś H e + 2H+= H202 Schemat 15. Dwuelektronowa redukcja cząsteczki tlenu

72 To, jaką część tlenu enzym zredukuje jednoelektronowo a jaką dwuelektronowo, zależy od stężenia tlenu w roztworze, od ph, a w mniejszym stopniu także od stężenia substratu. Im wyższe stężenie tlenu i wyższe ph a jednocześnie niższe stężenie substratu, tym większy jest udział jednoelektronowej redukcji tlenu. W dobrze napowietrzonych roztworach ksantyny przy ph 7,8 około 15% elektronów przekazywanych jest przez enzym szlakiem jednoelektronowym. W roztworze substratu o ph 10,0 zrównoważonym z tlenem znajdującym się pod ciśnieniem 1 atmosfery szlakiem jednoelektronowym wędruje 100% elektronów. Hamowanie aktywności enzymu przez inhibitory, np. przez kwas moczowy, zwiększa wytwarzanie (V* w stosunku do H2O2 (Bartosz 1995). Ponieważ allopurynol jest kompetytywnym inhibitorem XO, to przez hamowanie aktywności tego enzymu jednocześnie hamuje generowanie RFT (Kusumoto i wsp. 1995; Dinda i wsp. 1996; Klein i wsp. 1996). Mówi się także o innych niespecyficznych działaniach allopurynolu, mianowicie o tym, że ma on pobudzać enzymy antyoksydacyjne, a nawet bezpośrednio zmiatać RFT (Stewart i wsp. 1985). Pomimo wielu danych doświadczalnych, dokładny mechanizm ochronnego działania allopurynolu ciągle czeka na wyjaśnienie. Dodatkowym czynnikiem sprzyjającym powstawaniu RFT po wznowieniu dopływu tlenu w okresie reperfuzji jest wzrost katabolizmu ATP (Ferrer i wsp. 1997). W wielu doświadczeniach badano skutki reperfuzji i zawsze stwierdzano wzrost aktywności OX i wzrost stężenia produktów katabolizmu ATP. Co więcej, przy obniżonej ilości ATP komórki były bardziej wrażliwe na uszkodzenia wywoływane przez hipoksję (Lash i wsp. 1995). Do reaktywnych zmiataczy RFT zaliczane są związki o różnorakiej budowie i funkcjach. Należą do nich: ceruloplazmina (jest białkiem ostrej fazy i utlenia jony żelazawe do żelazowych i katalizuje reakcje, które nie wytwarzają RFT, a co ważne, reakcje te są konkurencyjne w stosunku do reakcji generujących O2'* i H2O2), cząsteczki zmiatające zawierające grupy tiolowe jak GSH (Rice i wsp. 1995), a-tokoferol (Martin i wsp. 1996), p-karoten (Palozza i wsp. 1995), a także aminokwasy (metionina, cysteina) oraz inne związki, np. mannitol (Becker 1993) czy kwas moczowy. Kwas moczowy ma zmiatać nie tylko *OH, lecz także tlen singletowy (Sanders i wsp. 1999).

73 Niska zawartość GSH jest indykatorem uszkodzeń poischemicznych (Jackson i Veal 1990). U żaby wodnej w okresie zimowania również stwierdzono małą ilość GSH w porównaniu z okresem lata (Dziubek 1985), co także częściowo może wiązać się z niedotleniem jej tkanek w czasie hibernacji. Również u ssaków w hipoksji stwierdzano obniżenie się ilości GSH (Shan i wsp. 1992). Obniżenie to może być spowodowane spadkiem syntezy NADPH, substratu potrzebnego GSH-Rd w reakcjach redukcji GSSG powstającego w czasie detoksykacji H20 2. Obniżenie zaś syntezy NADPH w hipoksji jest spowodowane spadkiem aktywności oksydazy cytochromowej i zahamowaniem procesu glikolizy ((Tribble i Jones 1990). Na podstawie uzyskanych danych sugeruje się, że allopurynol podnosi efektywność endogennego systemu anty oksydacyjnego u żab. Jest to zapewne spowodowane zarówno zahamowaniem aktywności XO, jak też bezpośrednim zmiataniem RFT przez allopurynol, co w ostateczności prowadzi do oszczędzania GSH płazów OTZ podwyższa zawartość GSH OTZ wywołuje wzrost zawartości GSH tylko u płazów w temperaturze 14 C oraz równoczesny spadek zawartości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH także u nich w temperaturze 4.

74 Wpływ OTZ na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N). Wartości istotnie wzrastają (t), maleją (4), pozostają bez zmian (-) Temperatura M, W, N M, W, N GSH 6 h 24 h OTZ 4 C.. 14 C T t t - GSSG 4 C C GSSG/GSH 4 C I C Tak jak wcześniej wspomniano, status GSH w komórce zależy w głównej mierze od dostępności budujących go substratów, głównie cysteiny. Egzogenne podawanie dużych dawek tego aminokwasu jest jednak niekorzystne, gdyż cysteina w wysokim stężeniu jest toksyczna i szybko się utlenia (Karisen i wsp. 1981). W trakcie jej utleniania są generowane RFT powodujące nekrozę komórek, choroby i w ostateczności śmierć (Meister 1991). W 1981 roku Williamson i Mester po raz pierwszy zaproponowali alternatywny mechanizm dostarczania cysteiny do wnętrza komórek, mianowicie w postaci kwasu L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowego (OTZ). OTZ jest związkiem nietoksycznym i jest transportowany w niezmienionej postaci do komórek, gdzie jest szybko metabolizowany przez oksoprolinazę do cysteiny i C02 (Meister i wsp. 1986; Kaeffer i wsp. 1993; Kalyjian i wsp. 1994). Interesujący jest fakt, że wzrost cysteiny po podaniu OTZ obserwuje się tylko w zdrowych tkankach, nigdy np. nowotworowych. Jest to prawdopodobnie spowodowane tym, że w tkankach nowotworowych jest zahamowana aktywność 5-oksoprolinazy (Rouse i wsp. 1995). W zdrowych tkankach OTZ poza wzrostem zawartości GSH zmniejsza również rozmiary oksydacyjnych uszkodzeń (Williamson i wsp. 1982; Taylor i wsp. 1992). Przekonywująco potwierdziły to badania Coopera i Merrilla (1989), w których wykazano, że OTZ w śledzionie hamuje powstawanie oksydacyjnych uszkodzeń i równocześnie powoduje wzrost ilości GSH.

75 Uzyskane wyniki u badanych żab sugerują podobny mechanizm wpływu OTZ na wzrost zawartości GSH. W przypadku żab wpływ ten jest jednak limitowany niską temperaturą. Interesujące jest niezwykle, że niezależnie od temperatury po podaniu OTZ stwierdzono spadek zawartości GSSG oraz spadek wartości stosunku GSSG/GSH. Wyniki te przemawiają za stosowaniem tego związku w osłonie antyoksydacyjnej, np. w czasie zabiegów radioterapeutycznych (Rouse i wsp. 1995) oraz w mediach, w których przechowuje się narządy w niskich temperaturach Witamina E podwyższa zawartość GSH Witamina E korzystnie wpływa na status GSH u żab. W podwyższonej temperaturze stymuluje wzrost zawartości GSH, natomiast niezależnie od temperatury obniża ilość GSSG i wartość stosunku GSSG/GSH. Tabela 7 Wpływ kwasu witaminy E na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH w wątrobie (W), sercu (S) i nerkach (N). Wartości istotnie wzrastają (t), maleją (T), pozostają bez zmian (-) Temperatura w, s, N W, S, N GSH 12 h 24 h Witamina E 4 C C t t T GSSG.. 4 C i i i - 14 C i i i GSSG/GSH 4 C i i i - i - 14 C i i i W początkowym etapie peroksydacji lipidów powstające toksyczne aldehydy są zmiatane przez witaminę E. Jeżeli mechanizm ten zawodzi to aldehydy te inicjują zmiany w DNA i w guaninie (Nakayama i wsp. 1984). Potwierdzają to badania Summerfielda i Tappela (1984), którzy wykazali, że jeżeli szczury karmiono pokarmem bogatym w wielonienasycone kwasy tłuszczowe, to podawanie dużych dawek witaminy E (30 mg/dobę) chroniło ich wątrobowy DNA przed oksydacyjnymi uszkodzeniami.

76 W badaniach na ssakach wykazano, jak ważny jest odpowiednio wysoki poziom witaminy E w mięśniu sercowym. Jest to uwarunkowane tym, że mięsień ten zawiera lipidy zbudowane z kwasów tłuszczowych 0 najwyższym stopniu nienasycenia. To wyjaśnia dlaczego w przypadku niedoboru witaminy E lipidy serca są bardziej wrażliwe na oksydacyjne uszkodzenia niż lipidy np. mięśni szkieletowych (Klein 1995). Witamina E nie tylko redukuje ilość uszkodzeń powodowanych przez RFT, ale także poprawia pracę serca (Guamieri i wsp. 1978; Halliwell 1wsp. 1992), głównie wtedy, kiedy wiąże się ona z albuminami osocza (Guamieri i wsp. 1982). Wykazano także, że chroni miocyty serca przed szkodliwymi wpływami GSSG, powstającego w wyniku redukcji H20 2 przez GSH-Px (Guamieri i wsp. 1988). Witamina E występuje w błonach komórkowych lub w ich pobliżu, przez co skuteczniej chroni lipidy tych błon przed atakami wolnych rodników, głównie przed lipoperoksydowym rodnikiem (Burton i Ingold 1986), a także przed 02'\ tlenem singletowym (!02) i OH (Fukuzawa i Gębicki 1983). Dzięki temu redukuje oksydacyjne zmiany w błonach, np. miocytów w czasie ischemii i reperfuzji (Massey i Burton 1989). Poprzez udział w zmiataniu #OH witamina E zapobiega również inaktywacji tlenku azotu (*N=0), który jest naczyniowym czynnikiem relaksującym i zmniejsza ryzyko wystąpienia zawału. Co ciekawe, tlenek azotu jest syntetyzowany w komórkach endotelium (Rubanyi i Vanhoutte 1986), w których jest zlokalizowana również witamina E (Kunisaki i wsp. 1992). Podobnie jak w sercu, również w erytrocytach witamina E spełnia ważne funkcje antyoksydacyjne. Błony erytrocytów także są bogate w wielonienasycone kwasy tłuszczowe, a ponadto są stale eksponowane na wysokie ciśnienie parcjalne tlenu. Z tego to powodu są szczególnie wrażliwe na uszkodzenia oksydacyjne. Ponadto zawierają dużą ilość żelaza, które sprzyja powstawaniu RFT. Rodniki te mogą inicjować peroksydację lipidów błon erytrocytów. Braki w poziomie witaminy E są dodatkową przyczyną odkładania się żelaza w tych komórkach. Witamina E w krwi ma zapobiegać względnie łagodzić skutki peroksydacji lipidów obecnych w błonach erytrocytów (Stohrer i wsp. 1997). O ważności witaminy E świadczą także badania Tsudy i wsp. (1994), którzy wykazali, że jeżeli w osoczu występuje mało witaminy E i selenu, to 11-krotnie wzrasta śmiertelność ludzi z powodu nowotworów. Jest to prawdopodobnie spowodowane tym, że witamina E redukuje produkcję

77 N-nitrozowych pochodnych z nitratów i amidów, które indukują rozwój nowotworów, np. piersi, śledziony, żołądka, trzustki, odbytu i pęcherza moczowego. Są to jednak tylko sugestie, gdyż do tej pory nie znamy dokładnego mechanizm przeciwnowotworowego działania witaminy E. Jedno jest pewne, że spożywanie karotenoidów i witaminy E wyraźnie obniża ryzyko choroby nowotworowej (Steinmetz i Potter 1991). Witamina E wchodzi w interakcje z witaminą C i P-karotenem. Interakcje te nie są tak dobrze udokumentowane jak między witaminą E i witaminą C (Pappalardo i wsp. 1996). Interakcje między tymi ostatnimi są bardzo ważne, ponieważ witamina C jest niezwykle ważnym antyoksydantem mózgu (Rice i wsp. 1995). Pomimo skąpych danych, przyjmuje się jednak, że wszystkie witaminy współdziałają ze sobą, są zmiataczami wolnych rodników oraz tłumią peroksydację lipidów (Niki i wsp. 1995). Nie ma też wielu danych literaturowych dotyczących wpływu witaminy E na zmiany statusu GSH. Przypuszcza się tylko, że GSH w reakcjach detoksykacyjnych współdziała z witaminą E (Agar i wsp. 1999). Podczas tych interakcji obniża się tempo peroksydacji lipidów w błonach biologicznych, a witamina E jest utleniana. Jest ona jednak na powrót regenerowana, przez tzw. czynnik zależny od GSH (vitamin E regeneration factor). Dlatego między innymi przy niedoborze GSH, ilość witaminy E szybko się obniża i wzrasta ilość reaktywnych substancji kwasu tiobarbiturowego, będącego indeksem oksydacyjnych uszkodzeń komórki (Hall i wsp. 1998). Na podstawie danych uzyskanych w obecnym eksperymencie można sugerować, że witamina E współdziała z GSH i wspomaga jego funkcje antyoksydacyjne. W tym współdziałaniu najważniejsze jest to, że niezależnie od temperatury obniża ilość GSSG i wartość stosunku GSSG/GSH. Na tej podstawie można sądzić, że jest również niezwykle ważna w redukcji GSSG do GSH UVA (365 nm) obniża zawartość GSH Promieniowanie UVA w dawce 4,305 W/cm2 oraz 8,610 W/cm2wywołuje u żab spadek zawartości GSH oraz wzrost ilości GSSG, a także wartości stosunku GSSG/GSH po 12 godzinach od ekspozycji. W przypadku nerek po 24 godzinach zaobserwowano wzrost ilości GSH.

78 Wpływ UVA na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i skórze (Sk.). Wartości istotnie wzrastają (t), maleją (>1), pozostają bez zmian (-) Czas ekspozycji M, W, N, Sk. M, W, N, Sk. GSH 12 h 24 h UVA 70 min Jr Jr 'I' - - t - (14 C) 140 min. l i i i - - t - GSSG 70 min. t t t t min. t t t t.... GSSG/GSH 70 min. t t t t min. t t t t.... Stwierdzony spadek ilości GSH sugeruje, że endogenny GSH uczestniczy w ochronie płaza przed promieniowaniem UVA. Podobną sytuację obserwowano u ssaków, u których pod wpływem UV obniżała się ilość GSH i wzrastała wrażliwość komórek skóry (Hanada i wsp. 1991; Shindo i wsp. 1993). Do początku lat 80. sądzono, że naświetlanie skóry ultrafioletem A ( nm) nie jest szkodliwe i dlatego stosowano ten typ promieniowania w fototerapii. Okazało się jednak, że promieniowanie to, podobnie jak promieniowanie UVB i UVC, wywołuje reakcje fotochemiczne: utlenianie, redukcję, rozkład i polimeryzację. Co więcej, jest absorbowane przez kwasy nukleinowe, zaburza przemianę materii w komórce i przy dłuższej ekspozycji powoduje jej zniszczenie. Dzieje się tak dlatego, że UVA pokonuje barierę naskórka i przenika w głębsze warstwy skóry (Leccia i wsp. 1998). W początkowym okresie ekspozycji organizmu na promieniowanie UVA obserwuje się najpierw reakcje zapalne, natomiast przy jej przedłużaniu dochodzi do powstawania nowotworów skóry. Sądzi się, że przyczyną tego jest generowanie przez UVA dużych ilości RFT (Tyrrell i Keyse 1990). W 1982 r. Parrish i wsp. wykazali, że UVA wywołuje erytremę skóry i uszkadza jej naczynia włosowate. Co więcej, UVA może działać synergistycznie z ostrymi i chronicznymi efektami UVB (Forbes 1986). Obecnie wiadomo, że UVA uszkadza komórkowy DNA, a uszkodzenia te są wyraźnie różne od tych indukowanych przez UVB. UVA poza tworze

79 niem lezji DNA dodatkowo indukuje powstawanie dimerów pirymidynowych (Ortwerth i wsp. 1998). Robert i wsp. (1996) wykazali również wyraźny wpływ UVA na mutagenezę komórek. Ten typ promieniowania przyspiesza również procesy starzenia się (Bissett i wsp. 1989), powoduje destrukcję białek w soczewce oka, co prowadzi do katarakty (Linetsky i wsp. 1996) i fotodestrukcję białkowych grup -SH, a także destrukcję histydyny, cysteiny i tryptofanu (Ortwerth i wsp. 1995). Utlenianie tych aminokwasów i grup -SH jest bezpośrednio spowodowane przez RFT, które obok dimerów pirymidynowych są typowymi fotoproduktami prowadzącymi do objawów fotodestrukcyjnych (Bhuyan i wsp. 1992). RFT powstające w wyniku działania UVA indukują również w różnych typach komórek apoptozę, głównie jednak w keranocytach epidermy (Godar 1996). Kohno i wsp. (1996) potwierdzili, że apoptoza keranocytów jest ściśle zależna od ilości generowanych RFT i od wydolności komórkowych systemów antyoksydacyjnych, głównie jednak od ilości GSH. Tyrrell i Pidoux już w 1986 r. wykazali ścisłą ilościową korelację między zawartością GSH a wrażliwością na promieniowanie UVA. Autorzy ci stwierdzili, że obniżenie poziomu GSH prowadzi do indukcji transkrypcji i wzrostu poziomu hemowej oksygenazy 1. Stwierdzono również, że poziom tego białka zawsze wzrasta po ekspozycji na UVA (Keyse i Tyrrell 1989; Lautier i wsp. 1992). Protekcyjna rola GSH ma polegać na zmiataniu RFT (*OH, '02 i 02'* ) powstających pod wpływem UVA (Applegate i Frenk 1995; Linetsky i Ortwerth 1995; Niggli i Applegate 1997) i na jego udziale jako kofaktora dla enzymów ochronnych - GSH-Px, transhydrogenaz i GSH-Tr (Meister 1983). Spadek poziomu GSH jest spowodowany działaniem 02'*na GSH-Px, sam GSH i katalazę. Zostało udokumentowane, że nawet milimolama koncentracja 02'* hamuje aktywność tych enzymów i obniża poziom GSH (Pigeolet i wsp. 1990). Jeżeli aktywność enzymów antyoksydacyjnych i GSH obniży się znacznie, to podnosi się poziom H202, który z kolei hamuje aktywność SOD (Roberts i wsp. 1991), w wyniku czego załamują się podstawowe anty oksydacyjne mechanizmy komórki. Bezpośrednie działanie 02'* generowanego pod wpływem UVA na GSH przy zahamowaniu aktywności enzymów antyoksydacyjnych wywołuje reakcję łańcuchową, prowadzącą do powstawania GSSG oraz mieszanych dwusiarczków (Winterboum i Metodieva 1994).

80 Przy przedłużającej się ekspozycji na promieniowanie UVA powstające RFT hamują także aktywność Na+, K+-ATP-azy. Obniżenie aktywności ATP-azy jest głównie spowodowane przez 02'\ co po raz pierwszy zaobserwowali Varma i wsp. (1979) i jest skorelowane z poziomem lipoperoksydacji. Prowadzi to do zmiany integralności błon i zaburzeń w przepuszczalności jonów K+i Na+, co w konsekwencji zaburza jonową homeostazę komórki (Jamme i wsp. 1995). W ostateczności sprzyja to powstawaniu schorzeń skóry przypisywanych promieniowaniu UVA, a także apoptozie komórek. Interesujący jest zaobserwowany w obecnym eksperymencie spadek zawartości GSH i wzrost ilości GSSG również w innych narządach poza skórą, a także wzrost zawartości GSH w nerkach, po 24 godzinach od ekspozycji. Być może, że w pierwszym przypadku jest to spowodowane wzmożeniem importu GSH z innych narządów do skóry, która jest w pierwszej kolejności penetrowana przez UVA. Podobnie wzrost zawartości GSH po 24 godzinach w nerkach może być spowodowany również wzrostem jego importu z innych narządów. Taki bezpośredni wzrost GSH po ustąpieniu stresu obserwowano w hepatocytach u szczurów (Tsuboi 1999) i w hodowlach atrocytów myszy (Xu i wsp. 1999) Etanol obniża zawartość GSH Etanol obniża ilości GSH oraz niezależnie od temperatury wywołuje wzrost zawartości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH. Tabela 9 Wpływ etanolu (Et.) na zawartość GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N). Wartości istotnie wzrastają (t), maleją (4), pozostają bez zmian (-) Temperatura M, W, N M, w, N GSH 12h 24h Etanol 4 C C GSSG 4 C t t t 14 C t t t t t t GSSG/GSH 4 C t T t t 14 C t t t t t t

81 Etanol jest jednym ze związków chemicznych zaburzających antyoksydacyjną równowagę w komórkach. Sugeruje się, że wywołuje wzrost akumulacji tłuszczów w wątrobie, którą można zahamować przez podanie antyoksydantów. Sugestię tę potwierdzono, wykazując wzrost peroksydacji lipidów w homogenatach wątroby po doustnym podaniu etanolu. W związku z tym przyjmuje się, że etanol względnie jego metabolity działają jako prooksydanty i redukują poziom komórkowych antyoksydantów (Soczyński i Schuessler 1998). Przeciwnego zdania byli Hashimoto i Recknagel (1968), którzy stwierdzili, że podanie pojedynczej dawki etanolu nie powoduje w mikrosomach wątroby szczurów wzrostu poziomu lipidów. W jeszcze innych badaniach wykazano, że nawet po długotrwałym podawaniu etanolu nie obserwuje się wzrostu ilości reaktywnych substancji kwasu tiobarbiturowego (Reid i Slater 1977; Torrielli i wsp. 1978). Z powodu tych sprzecznych danych długo kwestionowano wpływ etanolu na indukcję peroksydacji lipidów. Jednak rozwój nowoczesnych metod analitycznych pozwolił wykazać, że podczas metabolizmu etanolu wzrasta w wątrobie tempo peroksydacji lipidów. Co więcej, udało się wykazać, że etanol pobudza w wątrobie szczura produkcję H2O2, 02 i *OH (Bautista i Spitzer 1992). Podanie etanolu obniża wartość stosunku NAD7NADH, w wyniku czego następuje wzrost przepływu elektronów wzdłuż mitochondrialnego łańcucha oddechowego (Kurose i wsp. 1996). W wyniku tego duża ilość elektronów opuszcza łańcuch oddechowy i jednoelektronowo redukuje tlen do 02'\ Objawia się to nie tylko oksydacyjnymi uszkodzeniami mitochondriów, ale także wzrostem utylizacji GSH (Garcia-Ruiz i wsp. 1994), co powoduje spadek jego zawartości, a także wzrost ilości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH. Poza cytozolem GSH występuje w znacznych ilościach również w mitochondriach. Mitochondrialny GSH pochodzi z syntezy de novo i z eksportu z cytozolu (Femandez-Checa i wsp. 1993a, 1997). Etanol hamuje ten transport, przez co mitochondria są szczególnie wrażliwe na stres oksydacyjny i oksydacyjne uszkodzenia (Garcia-Ruiz i wsp. 1995). Powstający produkt utleniania etanolu, acetylaldehyd obniża również zawartość GSH. Promuje on konwersję dehydrogenazy ksantynowej do oksydazy ksantynowej, enzymu utleniającego hypoksantynę do ksantyny i kwasu moczowego. W reakcji tej generowane sąrft (Kato i wsp. 1990;

82 Arai i wsp. 1998). Sytuacja taka wzmaga tempo utylizacji GSH i wzrost zawartości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH. Ma to także miejsce u badanych żab po podaniu etanolu. Podobnie jak u ssaków, także u płazów po podaniu etanolu stwierdzono spadek zawartości GSH (Devi i wsp. 1996). Mechanizm tego spadku upatruje się w powstawaniu adduktów pomiędzy acetylaldehydem a GSH. Dane uzyskane przez Kurose i innych (1996) sugerują jednak coś przeciwnego, a mianowicie, że etanol powoduje wzrost zawartości GSH. Sądzę, że rozbieżności te mogą być spowodowane podawanymi dawkami etanolu, wpływami pokarmu czy zmianami okołodobowymi. Uzyskane dane wyraźnie potwierdzają, że etanol wywołuje w organizmie żab silny stres oksydacyjny objawiający się spadkiem zawartości GSH oraz wzrostem ilości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH.

83 Podsumowanie i wnioski Podczas odrętwienia zimowego żab w niskiej temperaturze (4 C) zawartość GSH w mózgu, wątrobie, nerkach i sercu jest znikoma, a wzrasta po przeniesieniu żab do temperatury wyższej (14 C). Podobne zjawisko może zachodzić w naturze wiosną, podczas rozpoczynania życia aktywnego. W temperaturze eksperymentalnie podwyższonej do 14 C zawartość GSH dodatkowo wzrasta po podaniu insuliny, estru monoetylowego glutationu, allopurynolu, OTZ i witaminy E. W badanych przypadkach wzrostowi GSH zawsze towarzyszył spadek ilości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH. Zjawisko to nie występuje u żab w temperaturze 4 C, za wyjątkiem obniżenia zawartości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH po podaniu OTZ i witaminy E. U Rana esculenta L. temperatura jest ważnym czynnikiem środowiskowym limitującym zawartość GSH. Od niej zależy również czas budzenia się żab ze snu zimowego i rozpoczęcie godów. Wzrost zawartości GSH wywołany wzrostem temperatury otoczenia ma znaczenie przystosowawcze i jest związany z wysokim stopniem metabolizmu żaby i nasilenia ich czynności życiowych w okresie budzenia się. W narządach tych wzrasta ilość generowanych RFT, co stwarza zagrożenie wystąpienia stresu oksydacyjnego. Wykazany w niniejszej pracy równoległy wzrost zawartości GSH przeciwdziała temu zjawisku. W niniejszej pracy wykazano, że w okresie odrętwienia zimowego u R. esculenta L. w badanych narządach (mózg, wątroba, nerki, serce i skóra) (Tabela 10): - zawartość GSH jest odwrotnie proporcjonalne do zawartości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH, - zawartość GSH maleje z wiekiem, - zawartość GSH wzrasta wraz z temperaturą, - insulina, ester monoetylowy glutationu, allopurynol, OTZ i witamina E podwyższają zawartość GSH w temperaturze 14 C, lecz nie w 4 C, - UVA obniża zawartości GSH, - insulina, ester monoetylowy glutationu oraz allopurynol wywołują spadek zawartości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH w temperaturze 14 C,

84 - OTZ oraz witamina E wywołują spadek zawartości GSSG oraz spadek wartości stosunku GSSG/GSH w temperaturze 4 i 14 C, - etanol obniża zawartość GSH oraz wywołuje wzrost ilości GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH w temperaturze 4 i 14 C. Tabela 10 Ogólne tendencje zmian w zawartości GSH, GSSG i wartości stosunku GSSG/GSH u żab w okresie odrętwienia zimowego trzymanych w temperaturze 14 C. Wartości wzrastają (t), maleją (i) GSH GSSG GSSG/GSH Młodociane-»Doj rzałe 1 t t 4 C - 14 C t 4 1 Insulina t 4 4 Ester monoetylowy glutationu t 4 4 Allopurynol t 4 4 OTZ t 4 Witamina E t 4 4 UVA 4 t t Etanol 4 t t

85 Streszczenie Celem badań było określenie wpływu wieku, temperatury, insuliny, estru monoetylowego glutationu, allopurynolu, kwasu L-2-oksotiazol-idyno-4-karboksylowego, witaminy E, promieniowania UVA i etanolu na metabolizm glutationu u R. esculenta L. w okresie odrętwienia zimowego (grudzień, styczeń). Przeprowadzono 9 doświadczeń na 420 dojrzałych i 20 młodocianych samcach żaby wodnej {Rana esculenta L.). Zawartość GSH oraz GSSG oznaczano w mózgu, wątrobie, nerkach, sercu i skórze żab, natomiast glukozę w osoczu krwi. Stwierdzono, że wraz z wiekiem istnieje ujemna korelacja między zawartością GSH i GSSG. Podwyższona temperatura wywołuje efekt odwrotny. Po iniekcji insuliny wykazano wyraźny spadek ilości glukozy w surowicy krwi i równoczesny wzrost zawartości GSH. Podobne zmiany odnośnie zawartości GSH stwierdzono po podaniu estru monoetylowego glutationu. Równie korzystnie na metabolizm GSH wpływa prekursor cysteiny kwas L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowy oraz witamina E. Związki te są szczególnie interesujące, ponieważ niezależnie od temperatury obniżają zawartość GSSG i wartość stosunku GSSG/GSH, stosunku będącego wskaźnikiem wielkości stresu oksydacyjnego. Naświetlanie żab UVA spowodowało statystycznie istotny spadek ilości GSH i równoczesny wzrost zawartości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH. Dane te sugerują istotną rolę GSH w ochronie żab przed tego typu promieniowaniem. Podobnie jak promieniowanie UVA również etanol wywołał silny stres oksydacyjny, którego miarą był wzrost ilości GSSG i wzrost wartości stosunku GSSG/GSH. Generalnie wykazano, że u płazów w okresie odrętwienia zimowego zawartość GSH i GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH jest zmienna i zależy od wieku żab, temperatury, iniekcji insuliny, dostępności substratów budujących cząsteczkę GSH (estru monoetylowego glutationu, OTZ), antyoksydantów (allopurynolu, witaminy E) oraz czynników indukujących generowanie RFT (UVA, etanolu).

86 Literatura Abe A.S Estivation in South American amphibians and reptiles. Brazilian J. Med. Biol. Res. 28: Aebi S., Assereto R., Lauterburg B.H High-dose intravenous glutathione in man. Pharmacokinetics and effects on cyst(e)ine in plasma and urine. Eur. J. Clin. Invest. 21: Agar E., Bosnak M., Amanvermez R., Demir S., Ayildiz M., Celik C The effect of ethanol on lipid peroxidation and glutathione level in the brain stem of rat. Neuro- Report 10: Allen R.G., Venkatraj V.S Oxidants and antioxidants in development and differentiation. J. Nutr. 122: Applegate L.A., Frenk E Cellular defence mechanism of the skin against oxidant stress and in particular UVA radiation. Eur. J. Dermatol. 5: Arai T., Mori H., Ishi H., Adachi T., Endo N., Mahino K., Mori K Oxypurinol, a xanthine oxidase inhibitor and a superoxide scavenger, did not attenuate ischemic neuronal, damage in gerbil. Life Science. 63: Armstrong D., Al-Awadi F Lipid peroxidation and retinopathy in streptozocininduced diabetes. Free Radical Biol. Med. 11: Atmaca M., Fry J.R Adenosine-mediated inhibition of glutathione synthesis in rat isolated hepatocytes. Biochem. Pharm. 52: Aucoin M.M., Barhoumi R., Kochevar D.T., Granger H.J., Burghardt R.C Oxidative injury of coronary venylar endothelial cells depletes intracellular glutathione and induces HSP 70 mrna. Am. J. Physiol. 268: H1651-H1658. Aw T.Y., Wierzbicka G.T., Jones D.P Oral glutathione increases tissue glutathione in vivo. Chem-Biol. Interact. 80: Barbagallo M., Dominguez L.J., Tagliamonte M.R., Resnick L.M., Paolisso G Effect of glutathione on red blood cell intracellular magnesium. Relation to glucose metabolism. Hypertension. 34: Barja de Quiroga C., Perez-Campo R., López-Torres M Antioxidant defenses and peroxidation in liver and brain of aged rats. Biochem. J. 272: Barreau E., Brossas J.Y., Courtois Y., Treton J.A Accumulation of mitochondrial DNA deletions in human retina during aging. Invest. Ophthalm. Vis. Science 37: Bart A., Haenen G.R Regulation of lipid peroxidation by glutathione and lipoic acid: involvement of liver microsomal vitamin E free radical reductase. Adv. Exp. Med. Biol. 264:

87 Bartosz G Metabolizm glutationu (Glutathione metabolism). Postępy Biochemii 39(1): Bartosz G Druga twarz tlenu. PWN. Warszawa. Bautista A.P., Spitzer J.J Acute ethanol intoxication stimulates superoxide anion production by in situ perfused rat liver. Hepatology 15: Becker B.F Towards the physiological function of uric acid. Free Radical Biol. Med. 14: Bellomo G., Jewell S.A., Thor H., Orrenius S Regulation of intracellular calcium compartmentation: Studies with isolated hepatocytes and t-butyl hydroperoxide. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79: Benzi G., Curti D., Marzatico F., Pastoris O. 1991a. Age-related acute depletion of cerebral glutathione by per oxidative stress. J. Neurosci. Res. 29: Benzi G., Pastoris O., Gorini A., Marzatico F., Villa R.F., Curti D. 1991b. Influence of aging on the acute depletion or reduced glutathione induced by electrophilic agents. Neurobiol. Aging 12: Bernhard M.C., Junker E., Hettinger A., Lauterburg B Time course of total cysteine, glutathione and homocysteine in plasma of patients with chronic hepatitis C treated with interferon-a with and without supplementation with N-acetylcysteine. J. Hepatology 28: Beutler E G6PD deficiency. Blood 84: Bhuyan K.C., Bhuyan D.K., Santos O., Podos S.M Antioxidant and anticatarogenic effects of topical captopril in diquat-induced cataract in rabbits. Free Radical Biol. Med. 12: Bier H., Hoffmann T., Eickelmann P., Hafher D Chemosensitivity of head and neck squamous carcinoma cell lines as not primarily correlated with glutathione level but is modified by glutathione depletion. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122: Bissett D.L., Hillegrand G.G., Hannon D.P The hairless mouse as a model of skin photoaging: its use to evaluate photoprotective materials. Photodermatology 6: Boda D., Nemeth I., Pinter S Surface tension, glutathione content and redox ratio of the tracheal aspirate fluid of premature infants with IRDS. Biol. Neonate. 74: Bradford D.F Winterkill, oxygen relations, and energy metabolism of a submerged dormant amphibian, Rana muscosa. Ecology 64: Bradshaw T.P., McMillan D.C., Crouch R.K., Jollow D.J Formation of free radicals and protein mixed disulfides in rat red cells exposed to dapsone hydroxylamine. Free Radical Biol. Med. 22:

88 Bravi M.C., Pietrangeli P., Laurenti O., Basili S., Cassone-Faldetta M., Ferri C., De Mattia G Polyol pathway activation and glutathione redox status in non-insulindependent diabetic patients. Metab. 10: Bray T.M., Taylor C.G Tissue glutathione, nutrition, and oxidative stress. Canadian J. Physiol. Pharmacol. 71: Burgunder J.M., Lauterburg B.H Decreased production of glutathione in patients with cirrhosis. Eur. J. Clin. Invest. 17: Burton G.W., Ingold K.U Vitamin E: application of the principles of physical organic chemistry to the exploration of its structure and function. Appl. Chem. Res. 19: Busa W.B., Nuccitelli R Metabolic regulation via intracellular ph. Am. J. Physiol. 246: R409-R438. Canty A., Driedzic W.R., Storey K.B Freeze tolerance of isolated ventricle strips of the wood frog, Rana sylvatica. Cryo. Letters. 7: Carabaza A., Ciuad C.J., Baque S., Guinovart J.J Glucose has to be phosphorylated to activate glycogen synthase, but not to inactive glycogen phosphorylase in hepatocytes. FEBS Let. 296: Castagna A., Le Grazie C., Accordini A., Giulidori P., Cavalli G., Bottiglieri T., Lazzarin A Cerebrospinal fluid S-adenosylmethionine (SAMe) and glutathione concentrations in HIV infection; effect of parenteral treatment with SAMe. Neurology 45: Celli A., Que F.G., Gores G.J., Larusso N.F Glutathione depletion is associated with decreased Bcl-2 expression and increased apoptosis in cholangiocytes. Am. J. Physiol. 275: Christon R., Haloui R.B., Durand G Dietary polyunsaturated fatty acids and aging modulate glutathione-related antioxidants in rat liver. J. Nutr. 125 : Clahsen P.C., Moison R.M.W., Holtzer C.A.J., Berger H.M Recycling of glutathione during oxidative stress in erythrocytes of the newborn. Ped. Res. 32: Cooper Jr., Merrill W.W Modulation of endoperoxide product levels and cyclophosphamide-induced injury by glutathione repletion. J. App. Phys. 67: Corral-Debrinski M., Shoflher J.M., Lott M.T., Kanter K., Wallace D.C Hypoxia is associated with mitochondrial DNA damage and gene induction: implications for cardiac disease. JAMA. 266: Cross C.E., Motchnik P.A., Bruener B.A., Jones D.A., Kaur H., Ames B.N Oxidative damage to plasma constituents by ozone. FEBS Lett. 298: Das D., Bandyopadhyay D., Bhattacharjee M., Banerjee R.K Hydroxyl radical is the major causative factor in stress-induced gastric alceration. Free Rad. Biol. Med. 23: 8-18.

89 Denu J.M., Tanner K.G Specific and reversible inactivation of protein tyrosine phosphates by hydrogen peroxide: evidence for a sulfenic acid intermediate and implications for redox regulation. Biochemistry 37: Deoliveira I.M.V., Deangelis R.C Differential effects of protein restriction on gamma - glutamyltranspeptidase (EC ) activity in young and mature rats. Brąz. J. Med. Biol. Res. 29: Devi B.G., Schenker S., Mazloum B., Henderson G.I Ethanol-induced oxidative stress and enzymatic defenses in cultured fetal rat hepatocytes. Alcohol 13: Di Monte D.A., Sandy M.S., DeLanney L.E., Jewell S.A., Chan P., Irwin I., Langston J.W Age-dependent changes in mitochondrial energy production in striatum and cerebellum of the monkey brain. Neurodegeneration 2: Dinda P.K., Kosser P., Beck L.I., Buell M.G Role of xantine oxidase-derived oxidants and leukocytes in ethanol-induced jejunal mucosal injury. Digest. Diseases Scien. 12: Draw K.L., Osborne P.G., Frerichs K.U., Hu Y., Koren R.E., Hallenbeck J.M., Rice M.E Ascorbate and glutathione regulation in hibernating ground squirrels. Brain Res. 851: 1-2. Dziubek K Różnice w zawartości glutationu w wybranych narządach Rana temporaria (L.) i Rana esculenta L. Kieleckie Studia Biologiczne 2. Fizjologiczne i Genetyczne Mechanizmy Adaptacji. Materiały z III Sympozjum Fizjologii Zwierząt. Cedzyna koło Kielc maja pp Dziubek K. 1987a. Glutathione metabolism in selected organs of Rana temporaria (L.) in annual cycle and under different stresses. Part I. Dehydration effects. Acta Biol. Cracov. ser. Zool. 29: Dziubek K. 1987b. Glutathione metabolism in selected organs o/rana temporaria (L.) in annual cycle and under different stresses. Part II. Starvation and temperature effects. Acta Biol. Cracov. ser. Zool. 29: Dziubek K. 1987c. Glutathione metabolism in selected organs of Rana temporaria L. in annual cycle and different stresses. Part III. In developing oocytes. Acta Biol. Cracov. ser. Zoo.29: Dziubek K Glutathione metabolism in selected organs o/rana temporaria L. in annual cycle and under different stresses. Part IV. In the testes. Acta Biol. Cracov. ser. Zool. 30: Dziubek K Wpływ wodoronadtlenku t-butylu (TBHP) oraz witaminy E na zawartość glutationu zredukowanego (GSH) i utlenionego (GSSG) u Rana esculenta L. Materiały VI Sympozjum Molecular and physiological aspects of regulatory processes of the organism. Kraków 3, 4 i 5 czerwiec 1997, pp

90 Dziubek K. 1998a. Wpływ czynników chemicznych i fizycznych na zawartość glutationu zredukowanego (GSH) i utlenionego (GSSG) w niektórych narządach Rana esculenta L. w okresie zimowania. Wydawnictwo Naukowe WSP, pp Dziubek K. 1998b. Influence of melatonin on the level of glutathione in Rana esculenta L. Materiały VII sympozjum Molecular and physiological aspects of regulatory processes of the organism. Kraków 9 i 10 czerwiec 1998, pp Dziubek K. 1999a. Influence of acetaminophen administration on the level of glutathione concentration in liver during the winter of Rana esculenta L. Materiały VIII Sympozjum Molecular and physiological aspects of regulatory processes of the organism. Kraków 7 i 8 czerwiec 1999, pp Dziubek K. 1999b. Effect of naproxen on the level of glutathione in Rana esculenta L. Proceedings from International Scientific Conference. Banska Bystrica 7-8 September 1999, pp Dziubek K. 1999c. Effect of exposure to cold on the glutathione kinetics in Rana esculenta L. Proceedings from International Scientific Conference. Banska Bystrica 7-8 September 1999, pp Dziubek K. 1999d. Decreases in GSH content in brain Rana esculenta L. after heat shock. Proceedings from International Scientific Conference. Banska Bystrica 7-8 September 1999, pp Ellman G.L Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 82: Enninge I.C., Groenendijk R.T.L., Filon A.R., van Zeeland A.A., Simons J.W.I.M The wavelength dependence of UV - induced pyrimidine dimer formation, cell killing and mutation induction in human diploid skin fibroblasts. Carcinogenesis 7: Erin N., Yegen B.C., Oktay S The role of 5-HT3 receptors in the anti-ulcer effect of calcitonin. Gen. Pharmacol. 25: Farber J.L Mechanisms of cell injury by activated oxygen species. Environ. Health Perspect. 102 (Supl. 10): Farber J.L., Kyle M., Coleman J.B Biology of disease. Mechanisms of cell injury by activated oxygen species. Lab. Invest. 62: Farooqui M.H.Y., Day W.W., Zamorano O.M Glutathione and lipid peroxidation in the aging rat. Comp. Biochem. Physiol. 88B: Favilli F., Iantomasi T., Marraccini P., Stio M., Lunghi B., Treves C., Vincenzini M.T Relationship between age and GSH metabolism in synaptosomes of rat cerebral cortex. Neurobiol. Aging 15: Favilli F., Marraccini P., Iantomasi T., Vincenzini M.T Effect of orally administered glutathione on glutathione levels in some organs of rats: role of specific transporters. Brit. J. Nutr. 78:

91 Femśndez-Checa J.C., Takeshi H., Tsukamoto H., Kaplowitz N. 1993a. Mitochondrial glutathione depletion and alcoholic liver disease. Alcohol 10: Femśndez-Checa J.C., Yi Y.R., Garicia-Ruiz C., Knezic Z., Tahara S.M., Kaplowitz N. 1993b. Expression of rat liver sinusoidal and canalicular GSH transport system in xenopus laevis oocytes. J. Biol. Chem. 268: Fern ndez-checa J.C., Kaplowitz N., Garcia-Ruiz C., Colell A., Miranda M., Mari M.? Ardide E., Morales A GSH transport in mitochondria: Defense against TNFinduced oxidative stress and alcohol-induced defect. Am. J. Physiol. 273: Ferrer J.V., Ariceta J., Guerrero D., Gomis T., Larrea M.M., Balćn E., Lera J.M Allopurinol and N-acetylcysteine avoid 60% of intestinal necrosis in an ischemiareperfusion experimental model. Transpl. Proceed. 30: Fisz M Rachunek prawdopodobieństwa i statystyka matematyczna. PWN. Warszawa. Forbes P.D Relative effectiveness of UVA and UVB for photocarcinogenesis. In: The biological effects of UVA radiation (F. Urbach, R.W. Gange eds.). New York: Praeger Publishers, USA. Fukagawa N.K., Ajami A.M., Young V.R Plasma methionine and cysteine kinetics in response to an intravenous glutathione infusion in adult humans. Am. J. Physiol. 270: E209-E213. Fukuzawa K., Gębicki J.M Oxidation of a-tocopherol in micelles and liposomes by the hydroxyl, perhydroxyl and superoxide free radicals. Arch. Biochem. Biophys. 226: Garcia de la Asuncion J., Milian A., Pla R., Bruseghini L., Esteras A., Pallardo F.V., Sastre J., Vifla J Mitochondrial glutathione oxidation correlates with ageassociated oxidative damage to mitochondrial DNA. FASEB J. 10: Garcia-Ruiz C., Morales A., Ballesta A., Rodćs J., Kaplowitz N., Fem&ndez-Checa J.C Effect of chronic ethanol feeding on glutathione and functional integrity of mitochondrion periportal and perivenous rat hepatocytes. J. Clin. Invest Garcia-Ruiz C., Morales A., Colell A., Ballerta A., Rodćs J., Kaplowitz N., Femśndez- Checa J.C Feeding S-adenosyl-L-methionine attenuates both ethanol-induced depletion of mitochondrial glutathione and mitochondrial dysfunction in periportal and perivenous rat hepatocytes. Hepatology 21: Gille G., Sigler K Oxidative stress and living cells. Folia Microbiol. 40: Godar D.E Preprogrammed and programmed cell death mechanisms of apoptosis : UV-induced immediate and delayed apoptosis. Photochem. Photobiol. 63: Grigg J., Barber A., Silverman M Bronchoalveolar lavage fluid glutathione in intubated premature infants. Arch. Dis. Child. 69: Guamieri C., Ferrari R., Visioli O Effect of a-tocopherol on hypoxic perfused and reoxygenated rabbit heart muscle. J. Mol. Cell Cardiol. 10:

92 Guamieri C., Flamigni F., Rossoni Caldarera C Myocardial mitochondrial functions in a-tocopherol-deficient and refed rabbits. Adv. Myocardiol. 3: Guamieri C., Muscari C., Farticelli A Role of antioxidants in hypoxia-reoxygenation injury in the heart and in cardiac myocytes. In: Oxygen Radicals in the Pathophysiology ofhesrt Disease. (P.K. Signal ed.), pp Kluwer Academic Publishers. Hagen T.M., Wierzbicka G.T., Sillau A.H., Bowman B.B., Jones D.P Bioavailability of dietary glutathione: Effect on plasma concentration. Am. J. Physiol G524-G529. Hall N.C., Carney J.M., Cheng M.S., Butterfield D.A Ischemia, reperfusioninduced changes in membrane proteins and lipids of gerbil cortical synaptosomes. Neroscience 64: Halliwell B How to characterize a biological antioxidant. Free Radical Res. Comm. 9: Halliwell B., Gutteridge J.M.C Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford: Clarendon Press, pp Halliwell B., Gutteridge J.M.C., Crass C.E Free radicals, antioxidants and human disease: where are now? J. Lab. Clin. Med. 119: Hanada K., Gande R.W., Connor M.J Effect of glutathione depletion on sunburn cell formation in the hairless mouse. J. Invest. Dermatol. 96: Hanigan M.H., Frierson H.G. Jr., Brown J.E., Lovell M.A., Taylor P.T Human ovarian tumors express gamma-glutamyl transpeptidase. Cancer Res. 54: Harris E.D Regulation of antioxidant enzymes. FASB J. 6: Hashimoto S., Recknagel R.O No chemical evidence of hepatic lipid peroxidation in acute ethanol toxicity. Exp. Mol. Pathol. 8: Hayakawa M., Kuzuya F Free radicals and diabetes mellitus. Nippon Ronen Igakkai Zasshi 27(2): Heales S.J.R., Davies S.E.C., Bates T.E., Clark J.B Depletion of brain glutathione is accompanied by impaired mitochondrial function and decreased N-acetl-aspartate concentrations. Neurochem. Res. 20: Hermes-Lima M., Storey K.B Relationship between anoxia exposure and antioxidant status in the frog Rana pipiens. Am. J. Physiol. 27: R918-R925. Hermes-Lima M., Storey K.B Role of antioxidant defenses in the tolerance of severe dehydration by anurans. The case of the leopard frog Rana pipiens. Mol. Cell Biochem. 189: Hiragama K., Yasutake A Free radicals and trace elements. J. Trace Elements Exp. Med. 11: Ho Y.F., Guenthner T.M Uptake and biosynthesis of glutathione by isolated hepatic nuclei. Toxicologist 14: 178.

93 Hochachka P.W., Guppy M Metabolic Arrest and the Control of Biological Time, pp Cambridge: Harvard University Press. Hochachka P.W Defense strategies against hypoxia and hypothermia. Science 231: Hochwald S.N., Harrison L.E., Rose D.M., Anderson M., Burt M.E y-glutamyl transpeptidase mediation of tumor glutathione utilization in vivo. J. Nat. Cancer Inst. 88: Hoffman D.W., Whitworth C.A., Jones K.L., Rybak L.P Nutritional status, glutathione levels, and ototoxicity of loop diuretics and aminoglycoside antibiotics. Hear. Res. 31: Hogg N., Singh R.J., Kalyanaraman B The role of glutathione in the transport and catabolism of nitric oxide. FEBS Letters 382: Huang C.S., He W., Meister A., Anderson M.E Amino acid sequence of rat kidney glutathione synthetase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: Huang Ch.S., Sung Y.Ch., Huang M.J., Yang Ch.S., Shei W.S., Tang T.K Content of reduced glutathione and consequences in recipients of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficient red blood cells. Am. J. Hematol. 57: Hwang C., Sinskey A.J The role of oxidation-reduction potential in monitoring growth of cultured mammalian cells. In: Production of Biologicals from Animal Cells in Culture (R.E. Spier, J.B. Griffiths and B. Meignier eds.), pp Halley Court, Oxford, UK. Iantomasi T., Favilli F., Marraccini P., Stio M., Treves C., Quatrome A., Capaccioli S., Vincenzini M.T Age and GSH metabolism in rat cerebral cortex, as related to oxidative and energy parameters. Mech. Ageing Dev. 70: Iantomasi T., Marracini P., Favilli F., Vincenzini M.T., Ferretti P., Tonelli F Glutathione metabolism in Crohn s disease. Biochem. Med. Metab. Biol. 53: Ishikawa T., Sies H Glutathione as an antioxidant: toxicological aspects. In: Glutathione: Chemical, Biochemical, and Medical Aspects (D. Dolphin, R. Poulson, and C. Avramovic eds.), Vol. 3B, pp Wiley, New York. Jackson R.M., Veal C.F Effect of hypoxia and reoxygenation on lung glutathione system. Am. J. Physiol. 259: H518-H524. Jamai A., Tommasini R., Martinoia E., Delrot S Characterization of glutathione uptake in Broad bean leaft protoplasts. Plant. Physiol. 111: Jamme I., Petit E., Divoux D., Gerbi A., Maixent J.M., Nouvelot A Modulation of mouse cerebral Na\ AT - ATPase activity by oxygen free radicals. NeuroReport 7: Jevtovic-Todorovic V., Guenthner T.M Sensitivity of human melanoma cells to mephalan cytotoxicity by adriamycin and carmustine. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 117:

94 Ji L., Exercise and oxidative stress: role of cellular antioxidant systems. In: Exercise and Sport Science Reviews.Vol. 23. J. Holloszy (ed.). Baltimore: Williams Wilkins, pp Jiang Z.L., Sato T Rise in plasma oxidized glutathione by experimental hypoglycemia. Tohoku J. Exp. Med. 187: Jones D.P., Brown L.A., Sternberg P Variability in glutathione-dependent detoxication in vivo and its relevance to detoxication of chemical mixtures. Toxicology 105: Jurima-Romet M., Abbott F.S., Tang W., Huang H.S., Whitehouse L.W Cytotoxicity of unsaturated metabolites of valproic acid and protection by vitamins C and E in glutathione-depleted rat hepatocytes. Toxicology 112: Kaeffer N., Pett J., Dieu B., Heckeetsweiler B., Lemand J.F., Rose F., Goldberg D., Lerebours E L-2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid as a cysteine precursor in acute experimental sepsis in rats: effects on tissue glutathione and cysteine levels. First European Workshop on Glutathione. France. Kalebic T., Kinter A., Poli G., Anderson M.E., Meister A., Fauci A.S Suppression of human immunodeficiency virus expression in chronically infected monocytic cells by_glutathione, glutathione ester, and N-acetylcysteine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: Kalyian R.C., Skowron G., Emgushov R., Chance M., Spell S.A., Borum P.R., Webb L.S., Mayer K.H., Jackson J.B., Yen-Lieberman B., Story K.O., Rowe W.B., Thompson K., Goldberg D., Trimbo S., Lederman M.M A phase l/ll trial of intravenous L-2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid (procysteine) in asymptomatic HIV-infected subjects. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7: 369. Kannan R., Yi J.R., Tang D., Li Y., Zlokovitz B.V., Kaplowitz N Evidence for the existence of a sodium-dependent glutathione (GSH) transporter. Expression of bovine brain capillary mrna and size fractions in Xenopus laevis oocytes and dissociation from y-glutamyltranspeptidasse and facilitative GSH transposes. J. Biol. Chem. 271: Kannan R., Mittur A., Bao Y., Tsusuo T., Kaplowitz N GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodiumdependent GSH transporter. J. Neurochem. 73: Kato S., Kawase T., Alderman J., Inatori N., Lieber C.S Role of xanthine oxidase in ethanol-induced lipid peroxidation. Gastroenterology 98: Kawada J New hypotheses for the mechanisms of streptozotocin and alloxan inducing diabetes mellitus. Toxicology 111: Kedderis G.L Biochemical basis of hepatocellular injury. Toxicol. Pathol. 4: Kevelaitis E., Niels C., Nyborg B., Menasche P Protective effect of reduced glutathione on endothelial function of coronary arteries subjected to prolonged cold storage. Transplantation 64:

95 Keyse S.M., Tyrrell R.M Heme oxygenase is the major 32-kDa stress protein induced in human skin fibroblasts by UVA radiation, hydrogen peroxide and sodium arsenite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: Kihlstrom M.T Lipid peroxidation capacities in the myocardium of endurancetrained rats and mice in vitro. Acta Physiol. Scand. 146: Klein H.H Vitamin E cannot protect myocardium against oxidative damage. Cardiovasc. Res. 30: Klein A.S., Joh J.W., Rangan U., Wang D., Bulkley G.B Allopurinol: discrimination of antioxidant from enzyme inhibitory activities. Free Radical Biol. Med. 21: Kohno T., Yamada Y., Hata T., Mori H., Yamamura M., Tomonaga M Urata Y., Goto S., Kondo T Relation of oxidative stress and glutathione synthesis to CD95 (Fas/APO-1) - mediated apoptosis of adult T cell leukemia cells. J. Immunol. 156: Kondo T., Dale G.L., Beutler E Glutathione: Thiol transport from human red blood cells. Methods Enzymol. 252: Kretzschmar M., Reinhardt D., Schlechtweg J. 1991a. Glutathione homeostasis in rats chronically treated with ethanol: evidence for a increased hepatic GSH. Export in vivo. Exp. Toxic. Pathol. 44: Kretzschmar M., Machnik G., Oesterle D. 1991b. Gamma-glutamyltranspeptidase (GGT) in experimental liver cirrhosis induced by thioacetamide: a biochemical and histochemical study. Exp. Pathol. 43: Kruman I., Bruce-Keller A.J., Bredsen D., Waeg G., Mattson M.P Evidence that 4-hydroxynonenal mediates oxidative stress-induced neuronal apoptosis. J. Neurosci. 17: Kunisaki M., Umeda F., Inoguchi T Vitamin E binds to specific binding sites and anhances prostacyclin production by culture aortic endothelial cells. Thromb. Haemost. 68: Kurose I., Higuchi H., Kato S., Miura S., Ishi H Ethanol-induced oxidative stress in the liver. Alcohol. Clin. Exp. Res. 20: 77A-85A. Kusumoto K., Morimoto T., Minor Th., Uchino J., Isselhard W Allopurinol effects in rat liver transplantation on recovery of energy metabolism and free radicalinduced damage. Eur. Surg. Res. 27: Lang C.A., Naryshkin S., Schneider D.L., Miles B.J., Lindeman R.D Low blood glutathione levels in healty aging adults. Lab. Clin. Med. 120: Lapshina E.A., Bartosz G Nitrite-induced export of glutathione disulfide from erythrocytes. Biochem. Mol. Biol. Internat. 37: Lash L.H Biochemical and functional characterization of mitochondria from renal proximal tubular (PT) and distal tubular (DT) cells. Pharmacologist. 35: 148.

96 Lash L.H., Tokarz J.J., Chen Z.F., Pedrosi B.M., Woods E.B ATP depletion by iodoacetate and cyanide in renal distal tubular cells. J. Pharm. Exp. Ther. 276: Lash L.H., Putt D.A Renal cellular transport of exogenous glutathione: heterogeneity at physiological and pharmacological concentrations. Biochem. Pharmacol. 58: Lautier D., Luscher P., Tyrrell R.M Endogenous glutathione levels modulate both constitutive and UVA radiation/hydrogen peroxide inducible expression of the human heme oxygenase gene. Carcinogenesis 13: Layne J.R., Romano M.A Critical thermal minima of Hyla chrysoscelis, Hyla cinerea, Hyla gratiosa and natural hybrids H. cinerea x H. gratiosa. Herpetologica 41: Leccia M.T., Richard M.J., Crisci J.F., Beani J.C UV-A cytotoxicity and antioxidant defence in keratinocytes and fibroblasts. Eur. J. Dermatol. 8: Leeuwenburgh C., Ji L.L Glutathione and glutathione ethyl ester supplementation of mice after glutathione homeostasis during exercise. J. Nutr. 128: Lemasters J.J., Thurman R.G Reperjusion injury after liver preservation for transplantation. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37: Linetsky M., Ortwerth B.J The generation of hydrogen peroxide by the UVA radiation of a human lens proteins. Photochem. Photobiol. 62: Linetsky M., James H.L., Ortwerth B.J The generation of superoxide anion by the UVA irradiation of human lens proteins. Exp. Eye Res. 63: López-Torres M., Perez-Campo R., Rojas C., Cadenas S., Barja G. 1993a. Simultaneous induction of SOD, glutathione reductase, GSH, and ascorbate in liver and kidney correlates with survival during aging. Free Radical Biol. Med. 15: López-Torres M., Perez-Campo R., Fernandez A., Barba C., Barja de Quiroga G. 1993b. Brain glutathione reductase induction increases early survival and decreases lipofuscin accumulation in aging frogs. J. Neurosci. Res. 34: Loven D.P., Oberley L.W Free radicals, insulin action and diabetes. In: Superoxide Dismutase. (L.W. Oberley, ed), pp Disease State. Boca Raton, FL, CRC. Lu S.C., Garcia-Ruiz C., Kuhlenkamp J., Ookhtens M., Salas-Prato M., Kaplowitz N Hormonal regulation of glutathione efflux. J. Biol. Chem. 265: Lu S.C., Kuhlenkamp J., Garcia-Ruiz C., Kaplowitz N Hormone-mediated downregulation of hepatic glutathione synthesis in the rat. J. Clin. Invest. 88: Lu S.C., Sun W.M., Yi J., Ookhtens M., Sze G., Kaplowitz N Role of two recently cloned rat liver GSH transporters in the ubiquitous transport of GSH in mammalian cells. J. Clin. Invest. 97:

97 Madesh M, Anup R., Benard O., Balasubramanian K..A Apoptosis in the monkey small intestinal epithelium: structural and functional alterations in the mitochondria. Free Radical Biol. Med. 26: Martensson J., Jain A., Meister A Glutathione is required for intestinal function. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: Martensson J., Meister A Glutathione deficiency decreases tissue ascorbate levels in newborn rats: ascorbate spares glutathione and protects. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: Martensson J., Han J., Griffith O.W., Meister A Glutathione ester delays the onset of scurvy in ascornate-deficient guinea pigs. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: Martin A., Wu D., Bauer W., Meydani S.N., Blumberg J.B., Meydani M Effect of vitamin E on human aortic endothelial cell responses to oxidative injury. Free Radical Biol. Med. 21: Maser R.L., Magenheimer B.S., Calvert J.P Mouse plasma glutathione peroxidase. cdna sequence analysis and renal proximal tubular expression and secretion. J. Biol. Chem. 269: Massey K.D., Burton K.P a-tocopherol attenuates myocardial membrane-related alteration resulting from ischemia and reperfusion. Am. J. Physiol. 256: HI Matsumoto S., Teshigawara M., Tsuboi S., Ohmori S Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples using acrylonitrile as a thiol-blocking reagent. Analyt. Science 12: 1-9. Matsuo M., Gomi F., Dooley M.M Age-related alterations in antioxidant capacity and lipid peroxidation in brain, liver, and lung homogenates of normal and vitamin E-deficient rats. Mech. Ageing Dev.64: McKeman T.B., Woods E.B., Lash L.H Uptake of glutathione by renal cortical mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 288: Meister A Biochemistry of glutathione. In: Metabolism of Sulfur Compounds, Metabolic Pathways (D.M. Greenberg, ed.), Vol. 7, pp Academic Press, New York. Meister A Transport and metabolism of glutathione and gamma-glutamyl amino acids. Biochem. Soc. Trans. 11: Meister A The fall and rise of cellular glutathione levels: enzyme-based approaches. Curr. Top. Cell. Reg. 26: Meister A Metabolism and function of glutathione. Coenzymes and cofactors. In: Glutathione, Chemical, Biochemical, and Medicine Aspects, Part A (D. Dolphin, O. Avramovic, R. Poulson, eds.), vol. Ill, pp , John Wiley Sons, New York, NY. Meister A Glutathione deficiency produced by inhibition of its synthesis and its reversal: applications in research and therapy. Pharmacol. Ther. 51:

98 Meister A Glutathione metabolism. Methods Enzymol. 251: 3-7. Meister A., Anderson M., Hwang O Intracellular cysteine and glutathione delivery system. J. Am. Coll. Nutr. 5: Meister A., Anderson M.E Glutathione. Annu. Rev. Biochem. 52: Mihm S., Ennen J., Pessara V., Kurth R., Drogę W Inhibition of HIV-1 replication and NF-KB activity by cysteine and cysteine derivatives. AIDS 5: Nakayama T., Kodama M., Nagata C Free radical formation in DNA by lipid peroxidation. Agric. Biol. Chem. 48: Navarro J., Obrandor J., Pellicer J.A., Asensi M.A., Vifta J., Estrela J.M Blood glutathione as an index of radiation-induced oxidative stress in mice and humans. Free Radical Biol. Med. 22: Nemeth I., Boda D Blood glutathione redox ratio as a parameter of oxidative stress in premature infants with IRDS. Free Radical Biol. Med. 16: Niki E., Noguchi N., Tsuchihashi H., Gotoh N Interaction among vitamin C, vitamin E, and ft-carotene. Am. J. Clin. Nutr. 62 (Suppl): 1322S-1326S. Nicotera P., Moore M., Mirabelli F., Bellomo G., Orrenius S Inhibition of hepatocyte plasma membrane Ca2+-ATPase activity by menadione metabolism and its restoration by thiol. FEBS Lett. 181: Niggli H.J., Applegatew L.A Glutathione response after UVA irradiation in mitotic and postmitotic human skin fibroblasts and keratinocytes. Photochem. Photobiol. 65(4): Nishida K., Ohta Y., Ishiguro I Glycine facilitates y-glutamylcysteinylethyl estermediated increase in liver glutathione level. Eur. J. Pharm. 333: Nokata K., Kawase M., Ogino S., Kinoshita C., Murata H., Sakaue T., Ogata K., Ohmori S Effects of age on levels of cysteine, glutathione and related enzyme activities in livers of mice and rats and attempt to replenish hepatic glutathione level of mouse with cysteine derivatives. Mech. Ageing Develop. 90: O Connor E., Devesa A., Garcia C., Puertes I.R., Pellin A., Vina J.R Biosynthesis and maintenname of GSH in primary astrocyte cultures: role of L-cysteine and ascorbate. Brain. Res. 680: Ohno H., Gasa S., Habara Y., Kuroshima A., Sato Y., Miyazawa N., Taniguchi N Effects of exercise stress and cold stress on glutathione and y-glutamyl transferase in rat liver. Biohim. Biophys. Acta 1033: Ohtsuka Y., Yabunaka N., Fujisawa H., Watanabe I., Agishi Y Effect of thermal stress on glutathione metabolism in human erythrocytes. Eur. J. Appl. Physiol. 68: Oikawa K., Ohkohchi N., Endoh T., Seya K., Satomi S., Mori S Leakage of superoxide radicals from mitochondrial electron transport system after cold ischemia in liver grafts. Transplant. Proceed. 28:

99 Oliver C.N., Starke-Reed P.E., Stadtman E.R., Liu G.J., Carney J.M., Floyd R.A Oxidative damage to brain proteins, loss of glutamine synthetase activity, and production of free radicals during ischemia/reperfusion-induced injury to gerbil brain. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: Onaran I., ózaydin A., GUltepe M., Sultuybek G Transport of glutathione conjugate in erythrocytes from aged subjects and susceptibility to oxidative stress following inhibition of the glutathione S-conjugate pump. Mech. Age Develop. 103: Ortwerth B.J., Linetsky M.D., Olsen P.R Ascorbic acid glycation of lens proteins produces UVA sensitizer similar to those in human lens. Photochem. Photobiol. 62: Ortwerth B.J., Coots A., James H.L., Linetsky M UVA irradiation of human lens proteins produces residual oxidation of ascorbic acid even in the presence of high levels of glutathione, fach. Biochem. Biophys. 351: Oya Y., Yamamoto K The biological activity of hydrogen peroxide. IV. Enhancement of its elastogenic actions by coadministration of L-histidine. Mutat. Res. 198: Palamara A.T., Garaci E., Rotilio G., Ciriolo M.R., Casabianca A., Fratemale A., Rossi L., Schiavano G.F., Chiarantini L., Magnani M Inhibition of murine AIDS by reduced glutathione. AIDS Res. Human Retrovir. 12: Palozza P., Calviello G., Bartoli G.M Prooxidant activity f$-carotene under 100% oxygen pressure in rat liver microsomes. Free Radical Biol. Med. 19(6): Pan P.R., Perez-Polo R Role of nerve growth factor in oxidant homeostasis; glutathione metabolism. J. Neurochem. 61: Paolicchi A., Tongiani R., Tonarelli P., Comporti M., Pompei la A Gamma-glutamyl transpeptidase-dependent lipid peroxidation in isolated hepatocytes and Hep G2 hepatoma cells. Free Radical Biol. Med. 22: Papp A., Nemeth I., Karg E., Papp E Glutathione status in retinopathy of prematurity. Free Radical Biol. Med. 27: Pappalardo G., Guadalaxara A., Maiani G., Illomei G., Trifero M., Frattaroli F.M., Mobarhan S Antioxidant agents and colorectal carcinogenesis: role of fj-carotene. vitamin E and vitamin C. Tumori 82: Parrish J.A., Jaenicke K.F., Anderson R.R Erythrema and melanogenesis action spectra of normal human skin. Photochem. Photobiol. 36: Pigeolet E., Corbisier P., Houbion A Glutathione peroxidase, superoxide dismutase and catalase inactivation by peroxides and oxygen derived free radicals. Mech. Ageing Dev. 51: Poli G Liver damage due to free radicals. British Med. Bull. 49: Potter D.W.STran T.B Rates of ethyl acrylate binding to glutathione and protein. Toxicol. Lett. 62:

100 Puri R.N., Meister A Transport of glutathione as y-glutamylcysteinylglycyl ester into liver and kidney. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: Rathbun W.B., Murray D.L Age-related cysteine uptake as rate limiting in glutathione synthesis and half life in the cultured human lens. Exp. Eye Res. 53: Reed D.J., Farris M.W Glutathione depletion and susceptibility. Pharmac. Rev. 36: 25S-33S. Reed D Glutathione: toxicological implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 30: Reid A.B., Slater T.B Some effects of ethanol in vivo and in vitro on lipid peroxidation. Biochem. Soc. Trans. 5: Reunenbery H., Brunold C Significance of glutathione metabolism in plants under stress. Prog. Bot. 35: Rice M.E., Lee E.J.K., Choy Y.Y High levels of ascorbic acid, not glutathione, in CNS of anoxia-tolerant reptiles contrasted with levels in anoxia-intolerant species. J. Neurochem. 64: Richman P.G., Meister A Regulation of y-glutamylcysteine synthetase by nonallosteric feedback inhibition by glutathione. J. Biol. Chem. 250: Robert C., Muel B., Benoit L., Dubertret L., Sarasin A., Stary A Cell survival and shuttle vector mutagenesis induced by ultraviolet A and ultraviolet B radiation in a human cell line. J. Invest. Dermatol. 106: Roberts V.A., Fisher C.L., Redford S.M Mechanism and atomic structure of superoxide dismutase. Free Radical Res. Commun : 269. Rodriguez J.V., Maprin M.E., Mediavilla M.G., Guibert E.E Glutathione movements during cold preservation of rat hepatocytes. Cryobiology 36: Rosenblat M., Aviram M Macrophage glutathione content and glutathione peroxidase activity are inversely related to cell-mediated oxidation of LDL: In vitro and in vivo studies. Free Radical Biol. Med. 24: Roum J.H., Buhl R., McElvaney N.G., Borok Z., Crystal R.G Systemic deficiency of glutathione in cystic fibrosis. J. Appl. Physiol. 75: Rouse K., Nwokedi E., Woodliff J.E., Epstein J., Klimberg V.S Glutamine enhances selectivity of chemotherapy through changes in glutathione metabolism. Ann. Surg. 221:420. Rubanyi G.M., Vanhoutte P.M Superoxide anions and hyperoxia inactivate endothelium-derived relaxing factor. Am. J. Physiol. 250: H822-H827. Sagara J., Makino N., Bannai S Glutathione efflux cultured astrocytes. J. Neurochem. 66: Sanders K.A., Huecksteadt T., Xu P., Sturrock A.B., Hoidal J.R Regulation of oxidant production in acute lung injury. CHEST 116: 56S-61S.

101 Saran M., Bors W Direct and indirect measurements of oxygen radicals. Klin. Wochenschr. 69: Sastre J., Pallardó F.V., Vifta J Glutathione, oxidative stress and aging. Age 19: Saugstad O.D Mechanisms of tissue injury by oxygen radicals: implications for neonatal disease. Acta Pediatr. 85: 1-4. Saugstad O.D., Aasen A.O Plasma hypoxanthine levels as a prognostic aid of tissue hypoxia. Eur. Surg. Res. 12: Schnellmann R.G Renal mitochondrial glutathione transport. Life Science 49: Schnellmann R.G., Gilchrist S.M., Mandel L.J Intracellular distribution and depletion of glutathione in rabbit renal proximal tubules. Kidney Int. 34: Schoffher J.M., Voljavec A.S., Dixon J., Kaufman A., Wallace D.C., Mitch W.E Renal amino acid transport in adult with oxidative phosphorylation diseases. Kidney Int. 47: Schubert J., Wilmer J.W Does hydrogen peroxide exist free" in biological systems? Free Radicical Biol. Med. 11: Shahal Y., Bauminger E.R., Zmora E., Katz M., Mazor D., Horn S., Meyerstein N Oxidative stress in newborn erythrocytes. Ped. Res. 29: Shan X., Aw T.Y., Smith E.R., Ingelman-Sundberg M., Mannervik B., Iyanagi T., Jones D.P Effect of chronic hypoxia on detoxication enzymes in rat liver. Biochem. Pharmacol. 43: Shaw C.A., Pasqualotto B.A., Curry K Glutathione-induced sodium currents in neocortex. Neuro. Report 7: Shelly C., Lu M.D Regulation of hepatic glutathione synthesis. Seminars in Liver Disease. 18: Shimizu T., Iwanaga M., Yasunaga A., Urata Y., Goto S., Shibata S., Kondo T Protective role of glutathione synthesis on radiation induced DNA damage in rabbit brain. Cell. Mol.. Neurobiol. 78: Shindo Y., Witt E., Packer L Antioxidant defense mechanisms in murine epidermis and dermis and their responses to ultraviolet light. J. Invest. Dermatol. 100: Siems W.G., Van Kunk F.J.G.M., Maass R., Brenke R Uric acid and glutathione levels during short-term whole body cold exposure. Free Radical Biol. Med. 16: Sies H Oxidative stress: from basic research to clinical application. Am. J. Med. 91(3): Sies H Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem 215: Sies H Glutathione and its role in cellular functions. Free Rad. Biol. Med. 27:

102 Skibba J.L., Gwartney E.A Liver hyperthermia and oxidative stress: role of iron and aldehyde production. Int. J. Hyperthermia. 13: Skibba J.L., Powers R.H., Stadnika A., Kalbfleisch J.H The effect of hyperthermia on conversion of rat hepatic xanthine dehydrogenase to xantine oxidase. Biochem. Pharmacol. 37: Slater A.F.G., Stefan C., Nobel I., Vandendobbelsteen D.J., Orrenius S Intracellular redox changes during apoptosis. Cell Death Diff. 3: Smith C.V., Jones D.P., Guenthner T.M., Lash L.H., Lauterburg B.H Compartmentation of glutathione: implications for the study of toxicity and disease. Toxicol. Applied. Pharm. 140: Snoke J.E., Bloch K Formation and utilization of y-glutamyl-cysteine in glutathione synthesis. J. Biol. Chem. 199: Soczyński M., Schuessler H Effect of ethanol and formate radicals on erythrocyte membrane proteins. Int. J. Radiat. 2: Sohal R.S., Allen R.C Oxidative stress as a causal factor in differentiation and aging: a unifying hypothesis. Exp. Gerontol. 25: Spasić M.B., Saićić Z.S., Buzadzić B., Korać B.,Blagojević D., Petrović V.M Effect of long term exposure to cold on the antioxidant defense system in the rat. Free Radical Biol. Med. 15: Sprietsma J.E Cysteine, glutathione (GSH) and zinc and copper ions together are effective, natural, intracellular inhibitors of (AIDS) viruses. Med. Hypotheses 52: Staal F.J.T, Roederer M., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A Intracellular thiols regulate activation of nuclear factor KB and transcription of human immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: Staal F.J.T., Anderson M.T., Staal G.E.J., Herzenberg L.A., Gitler C., Henzenberg L.A Redox regulation of signal transduction: tyrosine phosphorylation and calcium influx. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: Staal F.J.T., Roederer M., Raju P.A., Anderson M.T., Ela S.W., Herzenberg L.A Antioxidants inhibit stimulation of HIV transcription. Aids Res. Hum. Retrovir. 9: Steinmetz K.A., Potter J.D Vegetables, fruit and cancer. I. Epidemiology. Cancer Causes and Control 2: Stenzel J.D., Welty S.E., Benzick A.E., Smith E.O., Smith C.V., Hansen T.N Hyperoxic lung injury in Fischer-344 and Sprague-Dawley rats in vivo. Free Radicical Biol. Med. 14: Sternberg P.Jr., Davidson P.C., Jones D.P., Hagen T.M., Reed R.L., Drews-Botsch C Protection of retinal pigment epithelium from oxidative injury by glutathione and precursors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34:

103 Stewart J.R., Crute S.L., Loughlin V Prevention of free radical induced myocardial reperfusion injury with allopurinol. J. Thorac Cardiovasc. Surg. 90: Stio M., Iantomasi T., Favilli F., Marraccini P., Lunghi B., Vincenzini M.T., Treves C Glutathione metabolism in heart and liver of aging rat. Biochem. Cell Biol. 72: Stohrer M, Eichinger A., Sch lach ter M., Stangassinger M Protective effect of vitamin E in a rat model of focal cerebral ischemia. Z. Naturforsch. 53C: Stohs S.J., El-Rashidy F.H., Lawson T., Kobayashi R.H., Wulf B.G., Potter J.E Changes in glutathione metabolizing enzymes as a junction of age of donor. Age 7: 3-7. Storey J.M., Storey K.B Freeze tolerance in the grey tree frog, Hyla versicolor. Canadian J. Zool. 63: Summerfield F.W., Tappel A.L Effects of dietary polyunsaturated fats and vitamin E on aging andperaxidative damage to DNA. Arch. Biochem. Biophys. 233: Sundaresan M., Yu Z.X., Ferrans V.J., Irani K., Finkel T Requirement of generation ofhj02 for plateled-derived growth factor signal transduction. Science 270: Taniguhi N Superoxide dismutases: significances in aging, diabetes, ischemia and cancer. Rinsho Byori 38: Tateishi N., Higashi T., Naruse A., Nakashima K., Shiozaki H Sakamoto Y Rat liver glutathione: possible role as a reservoir of cysteine. J. Nutr. 107: Taylor C.G., Bauman P.F., Sikorski B., Bray T.M Elevation of lung glutathione by oral supplementation of L-2-oxothiazolidine-4-carboxylate protects against oxygen toxicity in protein-energy malnourished rats. FASEB J. 6: Teramoto S., Fukuchi Y., Vejima Y., Teramoto K., Orimo H Age-related changes in antioxidant scren of distal lung in mice. Lung 172: Teramoto S Uejima Y., Kitahara S., Ito H., Ouchi Y Effect of wholy body cold stress on glutathione metabolism in young and old mice. J. Clin. Biochem. Nutr. 24: Thor H., Mirabelli F., Salis A., Cohen G.M., Bellomo G., Orrenius S Alterations in hepatocyte cytoskeleton caused by redox cycling and alkylating quinones. Arch. Biochem. Biophys. 266: Torrielli M.V., Gabriel L., Dianzani M.U Ethanol-induced hepatotoxicity; experimental observations on the role of lipid peroxidation. J. Pathol. 126: Tran L.T., Miki T., Kamakura M., łzawa S., Tsujimoto Y., Miyabe S., Inoue Y., Kimura A Oxidative stress response in yeast: Induction of glucose-6-phosphate dehydrogenase by lipid hydroperoxide in Hansenula mrakii. J. Ferment. Bioengi. 80: Traystman R.J., Kirsch J.R., Koehler R.C., Oxygen radical mechanisms of brain injury following ischemia and reperfusion. J. Appl. Physiol. 71:

104 Tribble D.L., Jones D.P Oxygen dependence of oxidative stress. Rate of NADPH supply for maintaining the GSH pool during hypoxia. Biochem. Pharmacol. 39: Tsuboi S Elevation of glutathione level in rat hepatocytes by hepatocyte growth factor via induction of y-glutamylcysteine synthetase. J. Biochem. 126: Tsuda H., UeharaN., Iwahori Y., Asamoto M., Ligo M., Nagao M., Matsumoto K., Ito M., Hirono I Chemopreventine effects of P-carotene, a-tocopherol and five naturally occuring antioxidants on initiation of hepatocarcinogenesis by 2-amino- 3-methylimidazo[4,5-f]quinoline in the rat. J. Cancer Res. 85: Tyrrell R.M., Pidoux M Endogenous glutathione protects human skin fibroblasts against the cytotoxic action of UVB, UVA and near-visible radiation. Photochem. Photobiol. 44: Tyrrell R.M., Keyse S.M New trends in photobiology. The interactions of UV-A radiation with cultured cells. J. Photochem. Photobiol. 4: Varma S.D., Kumar S., Richards R.D Light induced damage to ocular lens cation pump. Prevention by vitamin C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: Vincenzini M.T., Favilli F., Iantomasi T Intestinal uptake and transmembrane transport systems of intact GSH: characterisctics and possible biological role. Biochim. Biophys. Acta 113: Vlachaki M.T., Meyn R.E Astro research fellowship: the role of bcl-2 and glutathione in an antioxidant pathway to prevent radiation-induced apoptosis. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 42: Vreudenhil P.K., Belzer F.O., Southard J.H Effect of cold storage on tissue and cellular glutathione. Cryobiology. 28: Williamson J.M., Meister A Stimulation of hepatic glutathione formation by administration of L-2-oxothiazolidine-4-carboxylate, a 5-oxo-L-prolinase substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 936. Williamson J.M., Boettcher B., Meister A Intracellular cysteine delivery system that protects against toxicity by promoting glutathione synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: Wilson J.X., Jaworski E.M., Kulaga A., Dixon S.J Substrate regulation of ascorbate transport activity in astrocytes. Neurochem. Res. 15: Winnicki S., Wagner W Zastosowanie analizy serii w badaniach etologicznych zwierząt gospodarskich. Acta. Akad. Agric: Tech. Olstenensis. Zoot. 2: Winterboum C.C., Metodiewa D The reaction of superoxide with reduced glutathione. Arch. Biochem. Biophys. 314: Wolff S.P Diabetes mellitus and free radicals. Free radicals, transition metals and oxidative stress in the aetiology of diabetes mellitus and complications. Br. Med. Bull. 49:

105 Xu L., Koumenis I.L., Tilly J.L., Giffard R.G Overexpression of bcl-xj protects astrocytes from glucose deprivation and is associated with higher glutathione, ferritin, and iron levels. Anesthesiology 91: Yamasaki I., Piette L.H EPR spin trapping study on the oxidizing species formed in the reaction of the ferrous ion with hydrogen peroxide. J. Am. Chem. Soc. 113: Yamasoba T., Harris C, Shoji F., Lee R.J. Nuttall A., Miller J.M Influence of intense sound exposure on glutathione synthesis in the cochlea. Brain Res. 804: Yi J.R., Lu S., Femandez-Checa J.C., Kaplowitz N Expression cloning of a rat hepatic reduced glutathione transporter with canalicular characteristics. J. Clin. Invest. 93: Yi J.R., Lu S., Femandez-Checa J.C., Kaplowitz N Expression cloning of of the cdna for a polypeptide associated with rat hepatic sinusoidal reduced glutathione transport: characteristics and comparison with the canalicular transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: Zeevalk G.D., Bernard L.P., Sinha C., Ehrhart J., Nicklas W.J Excitotoxicity and oxidative stress during inhibition of energy metabolism. Dev. Neurosci. 20: Zimniak P., Awasthi Y.C ATP-dependent transport systems for organic anions. Hepathology 17: Zlokovic B.V., Mackic J.B., McComb J.G., Weiss M.H., Kaplowitz N., Kannan R Evidence for transcapillary transport of reduced glutathione in vascular perfused guinea-pig brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: Zoeren-Grobben D., Lindeman J.H.N., Houdkamp E., Moison R.M.W., Wijnen J.T., Berger H.M Markers of oxidative stress and antioxidant activity in plasma and erythrocytes in neonatal respiratory distress syndrome. Acta Pediatr. 86:

106

107

108 I55N IS6N Akademia Pedagogiczna im. Komisji Edukacji Narodowej w Krakowie Prace Monograficzne nr 237