(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 R Z E C Z PO SPO L IT A POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 U rząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) IntCl6: C07H 21/04 C07F 9/08 (54) Sposób wytwarzania oligo(nukleozydometanofosfonianów) (73) Uprawniony z patentu: Polska Akademia Nauk, Centrum Badań M olekularnych i M akrom olekularnych, (43) Zgłoszenie ogłoszono: Łódź, PL BUP 23/95 (72) Twórcy wynalazku: Lucyna Woźniak, Łódź, PL Wojciech J. Stec, Ksawerów, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/98 (74) Pełnomocnik: Brodowska Iwona, "LEX-PAT" Biuro Prawno-Patentowe, Spółka z o.o. PL B1 1. Sposób wytwarzania oligo(nukleozydometanofosfonianów) o ogólnym wzorze 1, w którym R i R są takie same lub różne i oznaczają grupy alkoksylowe nukleozydów, korzystnie w pozycjach 5 i 3 z grupami egzoaminowymi zasad purynowych lub pirymidynowych zablokowanymi za pomocą grup zasadolabilnych, korzystnie benzoilowej, izobutyrylowej lub piwaloilowej, a A oznacza grupę alkilową, korzystnie metylową, znamienny tym, że poddaje się reakcji diastereomerycznie czysty ester selenometylowy o ogólnym wzorze 2, w którym A i R mają wyżej podane znaczenie, z alkoholem pierwszorzędowym o ogólnym wzorze 3, w którym R oznacza grupę 5 alkoksylową nukleozydy w obecności odczynnika aktywującego, korzystnie wybranego z grupy obejmującej aminy i sole litu, po czym wyodrębnia się produkt w znany sposób. w z ó r 1 w zór 2 w zó r 3

2 Sposób wytwarzania oligo(nukleozydometanofosfonianów) Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania oligo(nukleozydometanofosfonianów) o ogólnym wzorze 1, w którym R i R są takie same lub różne i oznaczają grupy alkoksylowe nukleozydów, korzystnie w pozycjach 5 i 3 z grupami egzoaminowymi zasad purynowych lub pirymidynowych zablokowanymi za pomocą grup zasadolabilnych, korzystnie benzoilowej, izobutyrylowej lub piwaloilowej, a A oznacza grupę alkilową, korzystnie metylową, znamienny tym, że poddaje się reakcji diastereomerycznie czysty ester selenometylowy o ogólnym wzorze 2, w którym A i R mają wyżej podane znaczenie, z alkoholem pierwszorzędowym o ogólnym wzorze 3, w którym R oznacza grupę 5 alkoksylową nukleozydy w obecności odczynnika aktywującego, korzystnie wybranego z grupy obejmującej aminy i sole litu, po czym wyodrębnia się produkt w znany sposób. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako odczynnik aktywujący stosuje się 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU) lub diizopropyloetyloaminę oraz chlorek litowy lub bromek litowy. * * * Przedmiotem wynalazku jest stereokontrolowana metoda syntezy oligo(nukleozydometanofosfonianów) o ogólnym wzorze 1. Modyfikowane oligonukleotydy, w tym niejonowe metanofosfoniany nukleozydów, wykazują własności przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe (in vitro) i stanowią interesującą grupę potencjalnych chemioterapeutyków nowej generacji, opartych na koncepcji "antisense" (anticode). [P.O.P.Ts o, L. Aurelian, E. Chang, P.S. Miller, Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, 660. (1993), 159]. Modyfikowane oligonukleotydy, w których wiązanie internukleotydowe jest P-chiralne (tiofosforany, metanofosfoniany) różniące się jedynie konfiguracją na atomie fosforu, wykazują szereg różnic we własnościach fizycznych, chemicznych i biologicznych, takich jak np. zróżnicowaną reaktywność w stosunku do nukleaz (tiofosforany) [B.V.L. Polter, B.A. Connolly, F. Eckstein, Biochemistry 22, (1983), 1369; F.R. Bryant, S.J. Benkovic, Biochemistry, 18. (1979). 2825]. Metanofosfoniany nukleozydów są całkowicie odporne na działanie enzymów. Wykazano, że stereoregulame oligo(nukleozydometanofosfoniany) o tej samej sekwencji i przeciwnych konfiguracjach na atomie fosforu mają różne temperatury mnięknięcia (Tm), świadczące o różnej zdolności do tworzenia dupleksów z nicią komplementarną DNA [Z.J. Leśnikowski, M. Jaworska, W.J. Stec, Nucl. Acids Res., 18. (1990). 2109]. Oligonukleotydy zawierające n-chiralnych funkcji internukleotydowych występują w postaci 2 izomerów. Metody chromatograficzne pozwalają jedynie na rozdział izomerów krótkich fragmentów. Istotną rzeczą jest opracowanie nowych stereokontrolowanych metod syntezy dłuższych łańcuchów, pozwalających na syntezę oligomerów o z góry zdefiniowanym sensie chiralności na wszelkich atomach fosforu. Istnieją liczne sposoby zawiązywania wiązania internukleotydowego, prowadzące do modyfikowanych P-chiralnych nukleotydów, w tym szczególnie metanofosfonianowych analogów oligonukleotydów, ale w literaturze podano tylko następujące przykłady reakcji przebiegających stereoselektywnie.

3 Metoda polegająca na reakcji grupy 5 -hydroksylowej nukleozydu, aktywowanej za pomocą odczynnika Grignarda, chlorku t-butylomagnezowego, z rozdzielonymi na diastereoizomery estrami p-nitrofenylowymi metanofosfonianów nuldeozydów: [Z.J. Leśnikowski, M. Jaworska, W.J. Stec, Nucl. Acids Res., 16. (1988) ]. 2. Synteza metanofosfonianów dinukleozydów z wykorzystaniem metylodichlorofosfiny jako odczynnika fosfitylującego w niskich temperaturach, w reakcji z grupą 3 -hydroksylową nukleozydu w pierwszym etapie reakcji i grupą 5 -hydroksylową w drugim etapie reakcji. Metoda ta prowadzi do preferencyjnego (w stopniu zależnym od użytych nukleozydów i warunków) powstania izomeru Rp [T. Loschner, J. Engels, Tetrahedron Lett., 30. (1989) 5587; J. W. Engels, T. Loschner, A. Frauendorf, Nucleosides & Nucleotides, 10. (1991) 347]. 3. Synteza 5 -tiono(5 -seleno)5 -deoksy pochodnych, metanotio(seleno)fosfonianów i tio(seleno)fosforanów nukleozydów, z wykorzystaniem rozdzielonych na diastereoizomery odpowiednio tio- i selenokwasów, alkilowanych przy użyciu 5 -chlorowco-5 -deoksynukleozydów [A.V. Lebedev, J.P. Rife, H.W. Seligsohn, G.R. Wenzinger, E. Wickstrom, Tetrahedron Lett., 31. (1990) 855; L. Woźniak, W.J. Stec, International Conference NAMA, Cancun, 1993; L. Woźniak, WJ. Stec, M. Sochacki, H. Mitsuya, S. Kageyama, Bioorg. & Medical Chem. Letters, 4. (1994) 1033]. Sposób wytwarzania estrów o wzorze ogólnym 1, w którym R i R są takie same lub różne i oznaczają grupy alkoksylowe nukleozydów w pozycjach 5 i 3, z grupami egzoaminowymi zasad purynowych lub pirymidynowych zablokowanymi za pomocą grup zasadolabilnych, korzystnie benzoilowej, izobutyrylowej lub piwaloilowej, a A oznacza grupę alkilową, korzystnie metylową, polega według wynalazku na tym, że poddaje się reakcji diastereomerycznie czysty ester selenometylowy o ogólnym wzorze 2, w którym A i R mają wyżej dane znaczenie, z alkoholem pierwszorzędowym o ogólnym wzorze 3, w którym R oznacza grupę 5 alkoksylową nukleozydu, w obecności odczynnika aktywującego, korzystnie wybranego z grupy obejmującej aminy i sole litu, po czym wyodrębnia się produkt w znany sposób. Sposób według wynalazku prowadzi się w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w pirydynie lub acetonitrylu. W sposobie według wynalazku jako odczynnik aktywujący, korzystnie stosuje się 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU), diizopropyloetyloaminę, chlorek litowy lub bromek litowy. W sposobie według wynalazku jako diastereomerycznie czysty ester selenometylowy o ogólnym wzorze 2, w którym A i R mają wyżej podane znaczenie, a Me oznacza metyl, stosuje się ester otrzymany w reakcji alkilowania za pomocą jodku metylu odpowiednich soli sodowych kwasów metanoselenofosfonowych zablokowanych nukleozydów. Synteza stosowanych w sposobie według wynalazku monomerów wzorze ogólnym 2 przebiega z dużą wydajnością. Również rozdzielanie tych monomerów na czyste P-enancjomery, metodami chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym przebiega z dużą łatwością. Są one monomerami trwałymi chemicznie i stereochemicznie. Proces zawiązywania wiązania estrowego jest katalizowany w celu uzyskania produktu o wzorze 1. Wykorzystanie rozdzielonych na diastereoizomery substratów o ogólnym wzorze 2 umożliwia otrzymanie diastereoizomerycznie czystych produktów o wzorze 1 z dużą wydajnością. Sposób według wynalazku opiera się na reakcji podstawienia nukleofilowego przy atomie fosforu w metyloselenofosfonianach nukleozydów o ogólnym 2, za pomocą grupy 5 -hydroksylowej nukleozydu alkoholu o ogólnym wzorze 3, w obecności aktywatora wybranego z grupy obejmującej aminy, korzystnie 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU)

4 lub diizopropyloetyloamina oraz chlorek litowy lub bromek litowy. Produkty reakcji wyodrębnia się w znany sposób. Poniżej podano przykłady wykonania wynalazku nie ograniczające jego zakresu. Przykład I. Synteza (Rp)-3 -metanofosfonianu 5-0-DMT-tymidylo(3,5 )- 3-0-acetylotymidyny Do roztworu 5-0-DMT-tymidylo-3-0-[Se-metylometanoselenofosfonianu] (wolniej wymywany diastereoizomer "SLOW", g, 0.5 mmol, 31P NMR: ppm, Jp-se = 430 Hz; MS FAB-[m/z]-698,700,701) i 3-0-acetylotymidyny (0.71 g, 0.25 mmol) w suchej pirydynie, dodano nasycony roztwór chlorku litu w pirydynie (2.5 ml) oraz roztwór DBU w pirydynie (3:7 v/v, 1 ml). Po pół godzinie roztwór reakcyjny rozcieńczono chloroformem i otrzymaną mieszaninę ekstrahowano 2 razy za pomocą buforu fosforanowego (ph 7). Warstwę organiczną suszono za pomocą MgSO4. Po zatężeniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem produkt oczyszczano metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując gradient chloroform-etanol (0-3%) jako eluent. Wydajność: 92%, 31 P NMR: ppm., 1H NMR (CDCl3: 1.61 ppm, 1.54 ppm (3H, d, P-CH3), J2P-H = Hz. Produkt poddano deproteksji i w pełni odblokowany porównano z wzorcem otrzymanym na drodze niezależnej. Przykład II. Synteza (Sp)-3 -metanofosfonianu 5-0-DMT-tymidylo(3,5 )-3-0-acetylotymidyny Substraty: (FAST) 5'-O-DMT-tymidylo-3'-O-[Se-metylo- metanoseleno- fosfonian] (3 1P NMR : ppm, Jp-se=428Hz) 3'-O-acetylotymidyna W ydajność: 88% 31P NMR :33.14 ppm (CDCl3); MS FAB-[m/z]-887, 1HNMR : 1.60 ppm, 1.54 ppm (3H,d,P-CH3), J2P-H=17.59H z. Przykład III. Synteza (Rp)-3 -metanofosfonianu N6-benzoilo-5-0-DMT-0-2 -deoksyadenozylo (3,5 )-N6-benzoilo-3-0-acetylo-2 -deoksyadenozyny Substraty: (SLOW) N6-benzoilo-5'-O-DMT-deoksyadenoiio 3'-O-[Se-metylo-m etanoselenofosfonian] (3 1 P NMR : ppm, Jp-Se = 432Hz, MS FAB-[m/z]-809, 812, 813) i N6-benzoilo-3 -O-acetylo-L -deoksyadenozyna W ydajność: 40% 31P NMR :32.51 ppm (CDCl3); 1H NMR (DMSO-d6) : 11.32(2H,s,NH), 6.63, 6.65(2H,m,1-H), 3.79 (6H,d,OCH3), 2.17(3H,s,CH3CO), 1.62,1.57 (3H,s,P-CH3,JPCH= Hz). FAB-MS [M-H]: i

5 Przykład IV. Synteza (Sp)-3 -metanofosfonianu N6-benzoilo-5-0-DMT-0-2 -deoksyadenozylo(3,5 ) -N6-benzoilo-3 -acetylo-2 -deoksyadenozyny Substraty: (FAST) N6-benzoilo-5'-O-DMT-deoksyadenoilo 3'-O-[Se- metylometanoselenofosfonian] (31P NMR:49.79 ppm, JP-Se= 430Hz, MS FAB-[m/z]-809, 812, 813) i N6-benzoilo- 3 -O-acetylo-2 deoksyadenozyna W ydajność: 45% 31P NMR : ppm (CDCl3); 1H NMR (DMSO-d6) : (2H,s,NH), 6.65, 6.47 (2H,m,1'-H), 3.79 (6H,d,OCH3), 2.18 (3H,s,CH3CO), 1.65, 1.60 (3H,s,P-CH3,JPCH=17.61 Hz). FAB-MS [M-H]: Przykład V. Synteza (Sp)-3 -metanofosfonianu 5 -DMT-0-tymidylo(3,5 )-N4- izobutyrylo-3-0-acetylo-2 -deoksyguanozyny Substraty: (FAST) 5'-O-DMT-O-tymidylo-3'-[Se-metylometanoseleno- fosfonian] (31P NMR : ppm, JP-Se = 428Hz, MSFAB-[m/z]-647, 699, 700) N4-izobutyrylo-3'-O-acetylo-2'-deoksyguanozyna. W ydajność: 93% 31P NMR : ppm (CDCl3); NMR (DMSO-d6) : 11.73, 11.5 (2H,2s,NH), (2H,1'-H), 3.82 (6H,s,OCH3), 2.16 (3H,s,CH3CO), 1.66, 1.60 (3H,P-CH3,JPCH= Hz). MS FAB- [M-H]: 983,984. i

6 Wzór 1 Wzór 2 Wzór 3 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł