(13) B1 (12) OPIS PATENTOW Y (19)PL (11) PL B1. (22) Data zgłoszenia Wzór 1 Wzór 2

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOW Y (19)PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia (51) IntCl6 C07F 9/165 Sposób wytwarzania pochodnych kwasu ditiofosforowego (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 01/94 (4 5) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/97 (73)Uprawniony z patentu: Polska Akademia Nauk, Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych, Łódź, PL (72)Twórcy wynalazku: Wojciech J. Stec, Ksawerów, PL Andrzej Okruszek, Łódź, PL Agnieszka Sierzchała, Łódź, PL Danuta Krajewska, Łódź, PL Magdalena Olesiak, Łódź, PL (74) Pełnomocnik: Brodowska Iwona, "Lex-Pat" Biuro Prawno- Patentowe s.c. PL B1 (57) 1. Sposób w ytw arzania pochodnych kwasu ditiofosforowego, o ogólnym wzorze 1, zwłaszcza w postaci soli, w którym X oznacza grupę alkilową, arylową, alkiloaminową, dialkilo-aminową, tioalkilową, alkoksylową lub aryloksylową, Y oznacza grupę hydroksylową, alkoksylową, fosforanową bądź difosforanową a B jest wybrane z grupy obejmującej nienukleofilowe alkoholany, takie jak tert-butanolan potasowy lub aminy, korzystnie 1-metyloimidazol, 4-dimetyloaminopirydyna, trietyloam ina lub 1,8-diazabicyklo [5.4.0]undec-7-en (DBU), znamienny tym, ze zw iązek 2-tiokso-ditiafosfolanow y o wzorze ogólnym 2, w którym X ma wyżej podane znaczenie, a korzystnie oznacza resztę 3'-0- lub 5'-0-nukleozydylową, poddaje się reakcji z odczynnikiem nukleofilowym o wzorze YH, gdzie Y ma wyżej podane znaczenie, wobec katalizatora zasadowego B, po czym sól związku o wzorze 1, w którym X, Y i B posiadają podane wyżej znaczenie, wydziela się korzystnie przez k ry stalizację bądź m etodam i chromatograficznymi. Wzór 1 Wzór 2

2 Sposób wytwarzania pochodnych kwasu ditiofosforowego Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania pochodnych kwasu ditiofosforowego, o ogólnym wzorze 1, zwłaszcza w postaci soli, w którym X oznacza grupę alkilową, arylową, alkiloaminową, dialkilo-aminową, tioalkilową, alkoksylową lub aryloksyłową, Y oznacza grupę hydroksylową, alkoksylową, fosforanową bądź difosforanową ab jest wybrane z grupy obejmującej nienukleofilowe alkoholany, takie jak tert-butanolan potasowy lub aminy, korzystnie 1 -metyloimidazol, 4-dimetyloaminopirydyna, trietyloamina lub 1,8-diazabicyklo [5.4.0]undec-7-en (DBU), znamienny tym, że związek 2-tiokso-ditiafosfolanowy o wzorze ogólnym 2, w którym X ma wyżej podane znaczenie, a korzystnie oznacza resztę 3'-0- lub 5'-0-nukleozydylową, poddaje się reakcji z odczynnikiem nukleofilowym o wzorze YH, gdzie Y ma wyżej podane znaczenie, wobec katalizatora zasadowego B, po czym sól związku o wzorze 1, w którym X, Y i B posiadają podane wyżej znaczenie, wydziela się korzystnie przez krystalizację bądź metodami chromatograficznymi. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się go w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w acetonitrylu, chlorku metylenu lub N,N-dimetyloformamidzie. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako odczynnik nukleofilowy stosuje się wodę. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako odczynnik nukleofilowy stosuje się sól kwasu fosforowego, korzystnie bis-tri-n-butyloamoniową. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako odczynnik nukleofilowy stosuje się sól kwasu pirofosforowego, korzystnie tris-tetra-n-butyloamoniową. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako odczynnik nukleofilowy stosuje się alkohol, korzystnie zablokowany nukleozyd z wolną grupą 5'-hydroksylową, korzystnie przyłączony do nośnika stałego. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako katalizator B stosuje się nienukleofilowy katalizator wybrany z grupy obejmującej nienukleofilowe alkoholany, korzystnie takie jak tert-butanolan potasowy lub aminy, korzystnie 1-metyloimidazol, 4-dimetyloaminopirydyna, tri-etyloamina lub korzystnie 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU). * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych, kwasu ditiofosforowego o ogólnym wzorze 1, w postaci soli, w którym X oznacza grupę alkilowa, arylową, alkiloaminową, dialkiloaminową, tioalkilową, alkoksylową, aryloksyłową natomiast Y oznacza grupę hydroksylową, alkoksylową, fosforanową bądź difosforanową, a B jest wybrane z grupy obejmującej nienukleofilowe alkoholany, takie jak tert-butanolan potasowy lub aminy, korzystnie 1-metyloimidazol, 4-dimetyloaminopirydyna, trietyloamina lub 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU). Sposób będący przedmiotem wynalazku jest szczególnie przydatny do wytwarzania ditiofosforanowych analogów nukleotydów takich jak: 5'-0-ditiofosforany nukleozydów, 5'-0-1,1 -ditiodifosforany nukleozydów, 5'-0-1,1-ditiotrifosforany nukleozydów oraz 3',5'-ditiofosforanowe analogi di- oraz oligonukleotydów. Proste, 0,0-dialkilowe pochodne kwasu ditiofosforowego otrzymywano dotychczas w reakcji odpowiednich alkoholi z pięciosiarczkiem fosforu (P2-S5), lub w reakcji przyłączenia elementarnej siarki do H-tiofosfonianów dialkilowych (Methoden der Organischen Chemie, Houben-Weyl, wyd. IV. t.xii/2, ).

3 Dotychczas ditiofosforanowe pochodne di- oraz oligonukleotydów otrzymywano w reakcji odpowiednio zablokowanych 3'-0-amidotiofosforanów nukleozydów z grupą 5'-OH innego nukleozydu (lub oligonukleotydu) przyłączonego do nośnika stałego, z następnym usiarczaniem za pomocą roztworu elementarnej siarki (O.Dahl, Sulphur Reporst, 11,1991, 167; W.T.Wiesler i in., Methods in Molecular Biology: Oligonucleotyide Synthesis, Editor: S.Agrawal, Humana Press, Totowa, N.J, 1993, ). Natomiast 5'-0-1,1-ditiotrifosforany nukleozydów otrzymano w reakcji odpowiednich 5'-0-1-tiocyklotrifosforanów nukleozydów z siarczkiem litu (J.Ludw ig, F.Eckstein, J.Org.Chem., 56, 1991, 1777). Znane są własności biologiczne pochodnych kwasu ditiofosforowego - oligo(nukleozydo ditiofosforanów) analogów nukleotydów oraz oligonukleotydów tiofosforanów, jako środków przeciwwirusowych i przeciwnowotworowych (C.A. Stein, J.S.Cohen, "Prosphorothioate Oligodeoksynucleotide analogues", "Oligonukleotides - Antisense Inhibitors of Gene Expression", Edytor J.S.Cohen, Macmillac Press, Londyn, 1989, ; W.S.Marshall, M.H.Caruthers, Phosphorothioate DNA as a Potential Therapeutic Drug", Science, 259, 1993, 1564) oraz przeciwpasożytnicze R.Ramasaney i in., Biohem. and Biophys. Res. Com., 218, 1996, 930). Analogi te są także stosowane jako substnacje modelowe do badania oddziaływań DNA z białkami oraz inhibicji wybranych enzymów wykorzystujących nukleotydy jako substraty bądź kofaktory. Sposób według wynalazku jest procesem uniwersalnym, który może służyć do bezpośredniej syntezy pochodnych kwasu ditiofosforowego o ogólnym wzorze 1. Sposób według wynalazku polega na tym, że związek o ogólnym wzorze 2, w którym X, oznacza grupę alkilową, arylową, alkiloaminową, dialkiloaminową, tioalkilową, alkoksylową lub aryloksylową, korzystnie 5'-0- bądź 3'-0-2-tiokso-1,3,2-ditiafosfolanową pochodną odpowiednio zablokowanego nukleozydu, poddaje się reakcji z odczynnikiem nukleofilowym o wzorze YH, gdzie Y oznacza grupę hyroksylową, alkoksylową, fosforylową bądź difosforanową, wobec katalizatora zasadowego B, a następnie sól związku o wzorze 1, w którym X i Y posiadają podane wyżej znaczenie, wydziela się w znany sposób, korzystnie przez krystalizację bądź metodami chromatograficznymi. Jako odczynnik nukleofilowy YH stosuje się wodę, pierwszo- i drugorzędowy alkohol, korzystnie odpowiednio zablokowany nukleozyd z wolną grupą 5'-hyroksylową, bądź też sól kwasu fosforowego lub pirofosforowego. Jako katalizatory reakcji B, korzystnie stosuje się nienukleofilowe alkoholany, takie jak tert-butanolan potasowy lub aminy takie jak 1-metyloimidazol, 4-dimetyloaminopirydyna, trietyloamina lub korzystnie 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU). Reakcję korzystnie prowadzi się w bezwodnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak acetonitryl, chlorek metylenu, N,N-dimetyloformamid. W przypadku syntezy wiązania internukleotydowego reakcję prowadzi się korzystnie wobec katalizatora na nośniku. W tym przypadku komponent hydroksylowy, YH, np. odpowiednio zablokowany 5'-OH nukleozyd bądź odpowiednio zablokowany 5'-OH oligonukleotyd, jest kowalencyjnie związany od końca 3'- ze stałym nośnikiem za pośrednictwem przedłużonego łańcucha, natomiast kom ponent nukleozydo-3'-0-(2-tiokso)-1,3,2-ditiafosfolanowy jest podawany wraz z katalizatorem zasadowym w roztworze. W ielokrotne powtórzenie reakcji kondensacji z komponentami o wzorze 2 pochodzącymi od różnych nukleozydów, połączone z selektywnym odblokowaniem grupy 5'-hydroksylowej po kolejnym przyłączeniu, prowadzi do otrzymania ditiofosforanowych analogów oligonukleotydów o zaplanowanej sekwencji nukleotydów. Do zabezpieczenia wolnych grup hydroksylowych oraz aminowych występujących w nukleozydowych komponentach o wzorze 2 oraz YH, poza ulegającą kondensacji grupę hydroksylową w YH, stosuje się znane grupy blokujące wykorzystywane w chemii nukleotydów. Odczynniki YH będące fosforanami bądź pirofosforanami stosuje się korzystnie w postaci rozpuszczalnych soli tri- bądź tetraalkiloamoniowych.

4 Sposób według wynalazku opiera się na nieopisanej dotąd w literaturze reakcji nukleofilowego otwarcia pierścienia 2-tiokso-1,3,2-ditiafosfolanowego połączonej z następczą eliminacją siarczku etylenu. Jako substraty wykorzystuje się 2-X-2-tiokso-1,3,2-ditiafosfolany o wzorze ogólnym 2, w którym X oznacza grupę alkilową, arylową, alkiloaminową, dialkiloaminową, tioalkilową, alkilokoksylową, aryloksylową, korzystnie resztę 3'-0- lub 5'-0-nukleozydylową. Sposób według wynalazku ilustrują podane niżej przykłady, nie ograniczające jego zakresu. Przykład I. 5'-0-Ditiofosforan tymidyny. Do roztworu 0,2 mmola 3'-0-acetylotymidyno-5'-0-(2-tiokso)-1,3,2-ditiafosfolanu w 0,5 ml acetonitrylu dodano roztwór 0,1 ml wody oraz 0,2 mmola DBU w 0,5 ml acetonitrylu i pozostawiono na 4 godz. w temp. pokojowej. Do otrzymanego roztworu dodano 2 ml 25% wodnego roztworu amoniaku i mieszano 6 godz. w temp. pokojowej a następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość chromatografowano na kolumnie wypełnionej złożem Sephadex A25 stosując liniowy garadient od 0,1 do 0,5M kwaśnego węglanu trietyloamoniowego oraz detekcję UV przy 260 nm. Frakcje zawierające produkt zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i wysuszono pod próżnią otrzymując produkt w formie bezpostaciowego proszku soli trietyloamoniowej. Wydajność 45%. δ ppm 31P NMR (D2O), 85% H3PO4 jako wzorzec zewnętrzny. Przykład II. Ditiofosforan tymidylo-(3',5')-tymidyny (synteza w roztworze). Do roztworu 0,2 mmola 3'-0-acetylotymidyny oraz 0,2 mmola DBU w 0,5 ml bzw. acetonitrylu dodano roztwór 0,2 mmola 5'-0-(4,4,'-dimetoksytrifenylometylo)-tymidyno-3'-0- (2-tiokso)-1,3,2-ditiafosfolanu w 0,5 ml bzw. acetonitrylu i pozostawiono na 4 godz. w temp. pokojowej. Do otrzymanego roztworu dodano 2 ml 25% wodnego roztworu amoniaku, mieszano 6 godz. w temp. pokojowej, a następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 2 ml 80% wodnego roztworu kwasu octowego, pozostawiono na 1 godz. w temp. pokojowej i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 5 ml wody i chromatografowano na złożu DEAE Sephadex w gradiencie kwaśnego węglanu trietyloamoniowego od 0,1 do 0,5M otrzymując produkt, po wysuszeniu na linii próżniowej, w formie bezpostaciowego proszku. Wydajność 47%. 8ppm (D2O), 85% H3PO4 jako wzorzec zewnętrzny. Przykład III. Ditiofosforan tymidylo-(3',5')-tymidyny (synteza na nośniku). Przez kolumienkę o pojemności 110 (0.1, zabezpieczona z dwóch stron filterkami, zawierającą 1µmol 5'-0-(4,4'-dimetoksytrifenylometylo)-tymidyny związanej przez atom tlenu 3'-0- ze stałym nośnikiem, przepuszczono 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu w ciągu 1 min., przemyto 15 ml acetonitrylu i suszono na linii próżniowej. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 110 µl roztworu zawierającego 10 µmoli 3'-0-acetylotym idyny i 10 µmoli DBU w bzw. acetonitrylu. Reakcję prowadzono przez 10 min. w temp. pokojowej, a następnie kolumienkę przemyto 10 ml acetonitrylu i przepuszczano przez nią w ciągu 1 min. 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu. Po przepłukaniu kolumienki 15 ml acetonitrylu przepuszczano przez nią 2 ml 25% wodnego roztworu amoniaku w ciągu 1 godziny. Roztwór amoniakalny pozostawiono na 6 godz. w temp. pokojowej i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na kolumnie PRP1 Hamilton 300x7 mm w gradiencie 5-20% acetonitryl - 0,1M wodny roztwór kwaśnego węglanu trietyloamoniowego, przepływ 1,5 ml/min. Wydajność 90% (przez pomiar absorpcji w UV). Przykład IV. 5'-0-1,1-Ditiodifosforan adenozyny. Do roztworu 0,5 mmola bzw. fosforanu bis-tri-n-butyloamoniowego oraz 0,5 mmola DBU w 0,5 ml bzw. acetonitrylu dodano roztwór 0,25 mmola 2'-3'-0,0-diacetyloadenozyno-5'-0-(2- tiokso)-1,3,2-ditiafosfolanu w 0,5 ml bzw. acetonitrylu. Mieszano 12 godzin w temp. pokojowej, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w 2 ml 25% wodnego roztworu amoniaku i pozostawiono na 6 godz. w temp. pokojowej. Po zatężeniu surowy produkt oczyszczono przez chromatografię na złożu Sephadex A25 w gradiencie od 0,2 do 0,8M

5 wodnego roztworu kwaśnego węglanu trietyloamoniowego. Wydajność 26%, δ ppm 31P NMR (Pα ), -8,3 (β p); Jαβ 30,4 Hz. Przykład V. 5'-0-1,1-Ditiotrifosforan deoksycytydyny. Do roztworu 0,5 mmola bzw. pirofosforanu tris-tetra-n-butyloamoniowego oraz 0,5 mmola DBU w 0,5 ml bzw. acetonitrylu dodano roztwór 0,25 mmola N4-benzoilo-3'-0-acetylo-2'-deoksycytydyno-5'-0-(2-tiokso)-1,3,2-ditiafosfolanu w 0,5 ml bzw. actonitrylu. Mieszano 12 godz w temp. pokojowej, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w 3 ml 25% wodnego roztworu amoniaku i pozostawiono na 12 godz. w temp. 55 C w szczelnie zakrytym naczyniu. Po zatężeniu surowy produkt oczyszczono przez chromatografię na złożu Sephadex A25 w gradiencie od 0,2 do 1,0M wodnego roztworu kwaśnego węglanu trietyloamoniowego. Wydajność 22%. δppm 31P NMR (Pα ), (P(β), -9.0 (P); Jαβ 33.7 Hz, Jp 18.5 Hz.

6 Wzór 1 Wzór 2 SCHEMAT Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł