(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/12500 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/13 ( ) C12N 15/79 ( ) C12N 5/10 ( ) C07K 16/24 ( ) C07K 16/42 ( ) A61K 39/395 ( ) A61P 37/00 ( ) (54) Kwas nukleinowy, prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza, ssacze przeciwciało anty-il-12 i kompozycje farmaceutyczne oraz ich zastosowania (30) Pierwszeństwo: , US, 60/233, , US, 60/236, , US, 09/920,262 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/10 (73) Uprawniony z patentu: CENTOCOR ORTHO BIOTECH, INC., HORSHAM, US (72) Twórca(y) wynalazku: JILL GILES-KOMAR, DOWNINGTOWN, US DAVID M. KNIGHT, BERWYN, US DAVID PERITT, BALA CYNWYD, US BERNARD SCALLON, COLLEGEVILLE, US DAVID SHEALY, DOWNINGTOWN, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy kwasu nukleinowego kodującego ssacze przeciwciało anty-il-12, prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej taki kwas nukleinowy oraz ssaczego przeciwciała anty-il-12 i kompozycji farmaceutycznych zawierających takie przeciwciało oraz ich zastosowań w diagnostyce, profilaktyce lub leczeniu. Stan techniki Interleukina 12 (IL-12) jest heterodimeryczną cytokiną zawierającą glikozylowane łańcuchy polipeptydowe o wielkości 35 i 40 kd, które są połączone mostkiem disiarczkowym. Cytokina ta jest syntetyzowana i wydzielana przez komórki prezentujące antygen włączając w to komórki dendrytyczne, monocyty, makrofagi, komórki B, komórki Langerhansa i keratynocyty, jak również komórki NK (ang. Natural killer). IL-12 pośredniczy w wielorakich procesach biologicznych i została poznana jako czynnik stymulujący komórki NK (NKSF), czynnik stymulujący komórki T, czynnik dojrzewania cytotoksycznych komórek T i czynnik linii komórek B transformowanych EBV (Curfs, J.H.A.J., i wsp., Clinical Microbiology Reviews, 10: (1997)). Interleukina 12 może wiązać się do receptora IL-12 wyrażanego na błonie plazmatycznej komórek (np. komórek T, komórek NK), zmieniając tym samym (np. inicjując, zapobiegając) procesy biologiczne. Na przykład wiązanie się IL-12 do receptora IL-12 może stymulować proliferację wcześniej aktywowanych komórek T i NK, wzmacniać aktywność cytolityczną cytotoksycznych komórek T (CTL), komórek NK i komórek LAK (komórek cytotoksycznych aktywowanych limfokiną), indukować wytwarzanie interferonu gamma (IFN GAMMA) przez komórki T i komórki NK oraz indukować różnicowanie się naiwnych komórek Th0 w komórki Th1, które produkują IFN GAMMA i IL-2 (Trinchieri, G., Annual Review of Immunology, 13: (1995)). W szczególności IL-12 jest istotna w generowaniu komórek cytolitycznych (np. NK, CTL) i we, wzmacnianiu komórkowej odpowiedzi immunologicznej (np. odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek Th1). Zatem IL-12 jest niezwykle ważna w generowaniu i regulowaniu zarówno odporności ochronnej (np. zwalczanie infekcji), jak i patologicznych odpowiedziach immunologicznych (np. autoimmunizacji) (Hendrzak, J.A. i Brunda, M.J., Laboratory Investigation, 72: (1995)). Skutkiem tego przez manipulowanie biologiczną aktywnością IL-12 in vivo, na przykład za pomocą przeciwciała, można wzmocnić, stłumić lub zapobiec odpowiedzi immunologicznej (np. ochronnej lub patogennej). Przeciwciała ssacze inne niż ludzkie, chimerowe, poliklonalne (np. surowice odpornościowe) i/lub przeciwciała monoklonalne (MAb) i fragmenty (np. produkty cięcia proteolitycznego lub fuzji białkowych) są potencjalnymi czynnikami terapeutycznymi, które są badane w niektórych przypadkach prób leczenia pewnych chorób. Jednakże takie przeciwciała lub fragmenty mogą wywoływać odpowiedź immunologiczną po podaniu ludziom. Skutkiem takiej odpowiedzi immunologicznej może być usuwanie przeciwciał lub fragmentów z krążenia poprzez kompleksowanie przez układ immunologiczny, co czyni powtórne podanie nieprzydatnym w terapii, zmniejszając przez to terapeutyczną korzyść dla pacjenta i ograniczając możliwość powtórnego podania przeciwciała lub fragmentu. Na przykład powtórne podawanie przeciwciał lub fragmentów obejmujących fragmenty pochodzenia innego niż ludzkie może prowadzić do choroby posurowiczej i/lub anafilaksji. W celu uniknięcia tych i innych problemów stosowano wiele podejść, aby zmniejszyć immunogenność takich przeciwciał i ich fragmentów, włączając w to wytwarzanie chimer i humanizację, dobrze znane w tej dziedzinie. Jednakże te i inne podejścia mogą nadal powodować pewną immunogenność przeciwciał i fragmentów, ich niskie powinowactwo, niską zachłanność wiązania lub problemy z hodowlą komórkową, zwiększeniem skali produkcji, wytwarzaniem i/lub niskimi wydajnościami otrzymywania. A zatem, takie przeciwciała lub fragmenty mogą być niewystarczająco przystosowane do produkcji lub zastosowania jako białka terapeutyczne. Skutkiem tego istnieje potrzeba dostarczenia przeciwciał anty-il-12 lub ich fragmentów, które przezwyciężą przynajmniej jeden z tych problemów, jak również udoskonaleń znanych przeciwciał lub ich fragmentów. Streszczenie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy kodujący ssacze przeciwciało anty-il-12 posiadające region zmienny łańcucha ciężkiego o sekwencji SEQ ID NO:7 oraz region zmienny łańcucha lekkiego o sekwencji SEQ ID NO: 8. Korzystnie przeciwciało stanowi przeciwciało ludzkie. Korzystnie przeciwciało ma stałą powinowactwa pomiędzy 1 x 10 9 a 7 x

3 PL B1 3 Przedmiotem wynalazku jest ponadto prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera kwas nukleinowy określony powyżej. Korzystnie kwas nukleinowy koduje ludzkie przeciwciało anty-il-12. Korzystnie przeciwciało ma stałą powinowactwa pomiędzy 1 x 10 9 a 7 x Przedmiotem wynalazku jest także ssacze przeciwciało anty-il-12 posiadające region zmienny łańcucha ciężkiego o sekwencji SEQ ID NO: 7 oraz region zmienny łańcucha lekkiego o sekwencji SEQ ID NO: 8. Korzystnie jest ono przeciwciałem ludzkim. Korzystnie przeciwciało to ma stałą powinowactwa pomiędzy 1 x 10 9 a 7 x Przedmiotem wynalazku jest też przeciwciało określone powyżej do zastosowania w diagnozowaniu lub leczeniu. Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało określone powyżej do zastosowania w leczeniu łuszczycy. Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało określone powyżej do zastosowania w leczeniu łuszczycowego zapalenia stawów, sarkoidozy albo patologii Crohna. Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera: (a) przeciwciało określone powyżej, i (b) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna określona powyżej do zastosowania w diagnozowaniu lub leczeniu. Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna określona powyżej do zastosowania w leczeniu łuszczycy. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna określona powyżej do zastosowania w leczeniu łuszczycowego zapalenia stawów, sarkoidozy albo patologii Crohna. Niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciała anty-il-12 - ludzkie, naczelnych, gryzoni, ssacze, chimerowe, humanizowane i/lub ze zmienioną domeną CDR, jak również kompozycje zawierające przeciwciała anty-il-12, kodujące kwasy nukleinowe, komórki gospodarza, kompozycje farmaceutyczne i ich zastosowania, jak opisano i przedstawiono tutaj w połączeniu w tym co jest znane w stanie techniki. Przeciwciało według wynalazku może nieograniczająco być pochodną przeciwciała ssaczego w tym nieograniczająco ludzkiego, mysiego, króliczego, szczurzego, gryzonia, naczelnego lub ich kombinacją i tym podobnych. Niniejszy opis ujawnia wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające komplementarny lub hybrydyzujący do niego polinukleotyd kodujący przynajmniej jedno anty-idiotypowe przeciwciało IL-12 zawierające przynajmniej jedną specyficzną sekwencję, domenę, część lub wariant. Niniejszy opis ujawnia ponadto rekombinowane wektory zawierające cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące to anty-idiotypowe przeciwciało IL-12, komórki gospodarza zawierające takie kwasy nukleinowe i/lub rekombinowane wektory, jak również sposoby ich wytwarzania i/lub stosowania takich kwasów nukleinowych kodujących przeciwciało anty-idiotypowe, wektorów i/lub komórek gospodarza. Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jeden sposób ekspresji przynajmniej jednego przeciwciała anty-il-12 lub anty-idiotypowego przeciwciała IL-12 w komórce gospodarza obejmujący hodowanie opisanej tu komórki gospodarza w warunkach, w których przynajmniej jedno przeciwciało anty-il-12 ulega ekspresji w wykrywalnych i/lub możliwych do oczyszczenia ilościach. Niniejszy wynalazek dostarcza także przynajmniej jedną kompozycję zawierającą (a) opisane tu wyizolowane przeciwciało i (b) odpowiedni nośnik lub rozcieńczalnik. Nośnik lub rozcieńczalnik opcjonalnie mogą być farmaceutycznie akceptowalne, stosownie do znanych nośników i rozcieńczalników. Kompozycja może opcjonalnie zawierać przynajmniej jeden dalszy składnik, białko lub kompozycję. Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jeden sposób lub kompozycję z przeciwciałem anty-il-12 do podawania w terapeutycznie skutecznej dawce w celu modulowania lub leczenia przynajmniej jednego związanego z IL-12 stanu w komórce, tkance, organie, zwierzęciu lub u pacjenta, przed, po, lub w trakcie występowania tego stanu. Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedną kompozycję, urządzenie i/lub sposób dostarczania terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości przynajmniej jednego przeciwciała anty-il- -12 według niniejszego wynalazku.

4 4 PL B1 Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jeden sposób lub kompozycję z przeciwciałem anty-il-12 do diagnostyki przynajmniej jednego związanego z IL-12 stanu w komórce, tkance, organie, zwierzęciu lub u pacjenta i/lub przed, po lub w trakcie trwania tego stanu. Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedną kompozycję, urządzenie i/lub sposób dostarczania do diagnostyki przynajmniej jednego przeciwciała anty-il-12 według niniejszego wynalazku. Opis figur Fig. 1A i 1B są wykresami pokazującymi zależne od stężenia wiązanie się ludzkich anty-il-12 mab do immobilizowanych ludzkich IL-12. Przeciwciała anty-il-12 zostały seryjnie rozcieńczone w 1% BSA/PBS i inkubowane przez 1 godzinę w 37 C na płytkach pokrytych rhil-12. Płytki zostały dwukrotnie przemyte 0,02% Tween 20 (monolaurynian polioksyetyleno(20)sorbitanu), 0,15 M roztworem soli fizjologicznej, a następnie hybrydyzowane w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z sondą w postaci koziego specyficznego przeciwciała przeciwko ludzkiej IgG kappa o znakowanego peroksydazą chrzanową (HRP). Płytki zostały ponownie przemyte, wywołane substratem o-feny-lenodiaminą (OPD) i została zmierzona gęstość optyczna (OD) każdej studzienki przy 490 nm. Fig. 2: Ścieżki od lewej do prawej na Fig. A i B zawierają ludzkie IL-12, ludzkie IL-12 p40, mysie IL-12 i wybarwiony standard wielkości. Fig. 2A pokazuje wybarwione prążki z całkowitej frakcji białek. Najsilniejsze prążki w każdej ścieżce są to ludzkie IL-12 (75 kd), p40 ludzkiej IL-12 (40 kd) i mysie IL-12 (75kD). Fig. 2B pokazuje filtr Western przygotowany z żelu identycznego do tego pokazanego na Fig. 2A. Filtr został poddany reakcji z C340, potem ze znakowanym HRP kozim przeciwko ludzkiej IgG i specyficznie wykrywał jedynie ludzką IL-12 (monomer i multimery) oraz ludzkie p40 IL-12. Filtr kontrolny (nie pokazany) poddany reakcji z kozim antyludzkim IgG znakowanym HRP nie ujawnił żadnych prążków. Fig. 3: Analiza PCR z etapem odwrotnej transkrypcji ekspresji genu IFNγ w ludzkich PBL traktowanych IL-2, IL-12, IL-2+IL-12 z lub bez przeciwciała anty-il-12 C340, izotypowego przeciwciała kontrolnego Całkowity RNA został poddany odwrotnej transkrypcji, zamplifikowany za pomocą PCR z użyciem starterów specyficznych dla genów. Poziom mrna β-aktyny w każdej próbce został również określony, co służyło jako kontrola jakości i składu mrna. Fig. 4 jest histogramem pokazującym, że ludzkie mab anty-il-12 (C340) hamuje wytwarzanie interferonu γ (IFNγ) przez pozbawione monocytów jednojądrzaste komórki krwi obwodowej CD3+ (PBMC) stymulowane IL-2 plus IL-12. PBMC były hodowane przez pięć godzin w pożywce kontrolnej (bez dodatku cytokin), pożywce z dodatkiem IL-12 (0,1 ng/ml) plus IL-2 (50 IU/ml)(IL-12/IL-2), pożywce kontrolnej zawierającej mab C340 (10 μg/ml) i pożywce IL-12/IL-2 zawierającej mab C340 (10 μg/ml). Wewnątrzkomórkowy IFNγ został zmierzony przez dwubarwne immunobarwienie z CD3- -PE i IFNγ-FITC. Dane pokazane dla jednego dawcy. Fig. 5 jest wykresem pokazującym zależne od dawki zahamowanie wydzielania IFNγ przez stymulowane IL-2 plus IL-12 limfocyty krwi obwodowej w dwóch różnych próbkach ludzkich mab anty-il-12 (C340). Ludzkie PBL (8x10 6 /ml) były hodowane przez 24 godziny z 10 U/ml IL-2, IL-2 plus 400 pg/ml IL-12 lub IL-2 plus IL-12 i mab C340, jak to zostało zaznaczone. Supernatanty z hodowli komórkowych zostały usunięte i testowane na obecność IFNγ za pomocą EIA. Fig. 6 jest histogramem pokazującym zależne od dawki zahamowanie indukowane] przez IL-12 plus IL-2 cytotoksyczności komórek LAK przez ludzkie anty-il-12 mab (C340). Komórki efektorowe LAK (ludzkie PBL, 8x10 6 /ml) były hodowane przez 24 godziny z IL-12 (400 pg/ml) plus IL-2 (10 U/ml) i mab C340 (5000 ng/ml lub 50 ng/ml, jak to zostało zaznaczone). Komórki efektorowe LAK były przemywane i hodowane przez cztery godziny ze znakowanymi 51 Cr komórkami docelowymi Raji przy stosunku komórek efektorowych do docelowych (E:T) 80:1 i oznaczono ilość 51 Cr uwolnionego do pożywki po lizie komórek Raji. Wyniki są wyrażone jako błąd standardowy średniej z trzech zdrowych dawców. Pozytywną kontrolą dla IL-12 (IL-12) są komórki efektorowe inkubowane z IL-12 i bez przeciwciała. Tłem (BKGD) są komórki efektorowe inkubowane bez IL-12 lub przeciwciała. Fig. 7A i 7B są histogramami pokazującymi, że indukowana przez IL-12 plus IL-2 ekspresja CD95 na jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej CD3+ jest hamowana przez ludzkie mab anty- IL-12 (C340). PBMC były hodowane przez 72 godziny w pożywce zawierającej 0,1 ng/ml IL-12 i suboptymalną dawkę IL-2 (50 IU/ml) w obecności lub nieobecności mab C340 (10 μg/ml). Ekspresja CD95 została zmierzona za pomocą cytometrii przepływowej komórek wybarwionych anty-cd95- FITC. Bramkowanie zostało wykonane używając dwubarwnej analizy (CD3 lub CD56-PE względem CD95-FITC) i rozpraszania światła podłużnego względem prostopadłego.

5 PL B1 5 Fig. 8 jest wykresem pokazującym, że rekombinowane ludzkie przeciwciała przeciwko ludzkiej IL-12 (rc340) wiążą się do immobilizowanej IL-12 w sposób, który jest nieodróżnialny od oczyszczonych mab C340. Stężenie rc340 w supernatancie z trzech produkujących rc340 rekombinowanych linii komórkowych zostało określone i supernatanty zostały poddane oszacowaniu wiązania IL-12 w teście ELISA. Płytki zostały pokryte 2 μg/ml ludzkiej IL-12 i inkubowane z mab C340 oczyszczonym z orginalnej hybrydomy (standard) lub z supernatantów z rekombinowanych linii komórkowych. Przeciwciało wiążące IL-12 zostało wykryte używając kozich antyludzkich IgG (łańcuch ciężki + łańcuch lekki) sprzężonych z alkaliczną fosfatazą. Fig. 9A-9C są wykresami pokazującymi kinetykę wzrostu i ilość przeciwciała wydzielanego przez trzy niezależnie wyprowadzone podklony rekombinowanej komórki produkującej rc340 (Fig. 9A, podklon C379B; Fig. 9B, podklon C381A; Fig. 9C, podklon C389A). Komórki rekombinowane zostały wysiane do kolb T75 przy początkowej gęstości 2 x 10 5 komórek/ml w standardowej pożywce. W różnych momentach czasu komórki zostały ponownie zawieszone i określona została liczba żywych komórek i ilość (μg/ml) rc340 w pożywce. Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowane, rekombinowane i/lub syntetyczne przeciwciała przeciwko IL-12 - ludzkie, naczelnych, gryzoni, ssacze, chimerowe, humanizowane lub ze zmienioną domeną CDR, jak również kompozycje i kodujące cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające przynajmniej jeden polinukleotyd kodujący przynajmniej jedno przeciwciało anty-il-12 według wynalazku. Niniejszy opis ujawnia także, między innymi, zastosowanie takich przeciwciał według wynalazku w diagnostycznych i terapeutycznych kompozycjach, sposobach i urządzeniach. Stosowane tutaj terminy przeciwciało przeciwko interleukinie 12", przeciwciało anty-il-12", część przeciwciała anty-il-12" lub fragment przeciwciała anty-il-12" i/lub wariant przeciwciała anty- IL-12" i tym podobne dotyczą dowolnego białka lub peptydu zawierającego cząsteczkę, która składa się przynajmniej z części cząsteczki immunoglobulinowej, takiej jak nieograniczająco region determinujący komplementarność (CDR) ciężkiego lub lekkiego łańcucha lub ligand wiążący jego fragment, region zmienny ciężkiego lub lekkiego łańcucha, region stały ciężkiego lub lekkiego łańcucha, region zrębowy lub dowolny jego fragment lub przynajmniej jeden fragment receptora IL-12 lub białka wiążącego, które może być włączone do przeciwciała według niniejszego wynalazku. Takie przeciwciało może ponadto opcjonalnie oddziaływać ze specyficznym ligandem, w taki sposób, nie będący jednak ograniczeniem, że przeciwciało moduluje, zmniejsza, zwiększa, działa w sposób antagonistyczny, agonistyczny, podnosi, blokuje, hamuje, znosi i/lub interferuje z przynajmniej jedną aktywnością lub wiązaniem IL-12 lub z aktywnością lub wiązaniem receptora IL-12, in vitro, in situ i/lub in vivo. Nieograniczającym przykładem jest odpowiednie przeciwciało anty-il-12, jego specyficzny fragment lub wariant, które może wiązać przynajmniej jedną IL-12 lub jej specyficzne fragmenty, warianty lub domeny. Odpowiednie przeciwciało anty-il-12, jego specyficzny fragment lub wariant, może także w sposób opcjonalny wpływać na przynajmniej jedną aktywność lub funkcję IL-12, jak nie będąca ograniczeniem synteza RNA, DNA lub białka, uwalnianie IL-12, sygnalizacja receptora IL-12, cięcie błonowej IL-12, aktywność IL-12, produkcja i/lub synteza IL-12. Ponadto sugeruje się, aby termin przeciwciało" obejmował przeciwciała, fragmenty po trawieniu, ich specyficzne fragmenty i warianty, włączając w to mimetyki przeciwciał lub obejmował fragmenty przeciwciał, które naśladują strukturę i/lub funkcję przeciwciała lub jego specyficznego fragmentu lub części. Funkcjonalne fragmenty obejmują fragmenty wiążące antygen, które wiążą się do ssaczej IL-12. Na przykład fragmenty zdolne do wiązania IL-12 lub ich części obejmują nieograniczająco fragmenty Fab (np. przez trawienie papaina), Fab' (np. przez trawienie pepsyną i częściową redukcję) i F(ab') 2 (np. przez trawienie pepsyną), facb (np. przez trawienie plazminą), pfc' (np. przez trawienie pepsyną lub trawienie plazminą), Fd (np. przez trawienie pepsyną, częściową redukcję i ponowną agregację), Fv lub scfv (np. przez techniki biologii molekularnej), (zobacz np. Colligan, Immunology, jak wyżej). Takie fragmenty mogą być otrzymane przez cięcie enzymatyczne, przy użyciu technik syntezy lub rekombinacji genetycznej, które są znane w tej dziedzinie i/lub tu opisane. Przeciwciała mogą być otrzymane w postaci różnych form skróconych przy użyciu genów przeciwciał, w których na lewo od naturalnego miejsca końca translacji został wprowadzony jeden lub większa liczba kodonów stop. Na przykład kombinacja genu kodująca fragment F(ab') 2 łańcucha ciężkiego może być tak zaprojektowana, aby zawierać sekwencje DNA kodujące domenę CH 1 i/lub region łączący łańcucha ciężkiego. Różne fragmenty przeciwciał mogą być ze sobą łączone chemicznie przy użyciu klasycznych technik lub mogą być otrzymane jako jeden fragment białkowy przy użyciu technik inżynierii genetycznej.

6 6 PL B1 Stosowany tutaj termin ludzkie przeciwciało" dotyczy przeciwciała, w którym zasadniczo każda część białka (np. CDR, region zrębowy, C L, domeny C H (np. C H 1, C H 2, C H 3), region łączący (V L, V H )) jest zasadniczo nieimmunogenny dla ludzi, z niewielkimi tylko zmianami sekwencji lub odstępstwami. Podobnie przeciwciała oznaczone jako przeciwciała naczelnych (małpa, pawian, szympans, itp.) gryzoni (mysz, szczur, królik, świnka morska, chomik i tym podobne) i innych ssaków wskazują dany gatunek, podrodzaj, rodzaj, podrodzinę i rodzinę. Ponadto, przeciwciała chimerowe zawierają kombinacje powyższych. Takie zmiany lub odstępstwa w sposób opcjonalny i zalecany zatrzymują lub zmniejszają odpowiedź immunologiczną u ludzi lub innych gatunków w porównaniu z przeciwciałami niemodyfikowanymi. Tak więc, ludzkie przeciwciało jest różne od przeciwciała chimerowego lub humanizowanego. Należy podkreślić, że ludzkie przeciwciało może być wytwarzane przez zwierzę inne niż człowiek lub przez komórkę prokariotyczną lub eukariotyczną, która jest zdolna do ekspresji funkcjonalnie zmienionych genów ludzkich immunoglobulin (np. łańcucha ciężkiego i/lub łańcucha lekkiego). Ponadto, jeżeli ludzkie przeciwciało jest przeciwciałem o pojedynczym łańcuchu, może ono zawierać peptyd łączący, który nie występuje w natywnych ludzkich przeciwciałach. Na przykład Fv może zawierać peptyd łączący, taki jak dwie do ośmiu glicyn lub innych reszt aminokwasowych, które łączą region zmienny łańcucha ciężkiego i region zmienny łańcucha lekkiego. Uważa się, że takie peptydy łączące są pochodzenia ludzkiego. Jako przeciwciała monoklonalne mogą być zastosowane również przeciwciała bispecyficzne, heterospecyficzne, heterokoniugatowe lub podobne, zwłaszcza przeciwciała ludzkie lub humanizowane, które posiadają specyficzności wiązania do przynajmniej dwóch różnych antygenów. W tym przypadku, jedna ze specyficzności wiązania dotyczy przynajmniej jednego białka IL-12, inna zaś dowolnego innego antygenu. Sposoby wytwarzania specyficznych przeciwciał są znane w tej dziedzinie. Tradycyjnie, rekombinowana produkcja bispecyficznych przeciwciał opiera się na koekspresji dwóch par immunoglobulinowy łańcuch ciężki-łańcuch lekki, przy czym dwa łańcuchy ciężkie posiadają różne specyficzności (Milstein i Cuello, Nature 305:537 (1983)). Z powodu losowego łączenia się łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobuliny te hybrydomy (kwadromy) produkują potencjalną mieszankę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedna ma właściwą strukturę bispecyficzną. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, które jest zazwyczaj wykonywane przy użyciu chromatografii powinowactwa, jest raczej trudne a wydajności otrzymywania są raczej niskie. Podobne procedury są ujawnione w np. WO 93/08829, patentach USA nr , , , , , , , , , , , , , , , , , , , WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker i wsp., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh i wsp., Methods in Enzymology 121:210 (1986). Przeciwciała anty-il-12 (określane także przeciwciałami IL-12) mogą być w sposób opcjonalny scharakteryzowane przez wysokie powinowactwo wiązania się do IL-12 i w sposób opcjonalny niską toksyczność. W szczególności przeciwciało według niniejszego wynalazku jest szczególnie użyteczne w niniejszym wynalazku, jeżeli jego poszczególne składniki, takie jak region zmienny, region stały, region zrębowy, każdy z osobna lub wszystkie razem w sposób opcjonalny i zalecany posiadają niską immunogenność. Przeciwciała, które mogą być użyte w niniejszym wynalazku są w sposób opcjonalny scharakteryzowane przez ich zdolność do stosowania u pacjentów przez wydłużony okres czasu przy mierzalnej poprawie objawów chorobowych oraz niskiej i/lub akceptowalnej toksyczności. Niska lub akceptowalna immunogenność i/lub wysokie powinowactwo, jak również inne zalecane właściwości, mogą przyczyniać się do osiągnięcia rezultatów terapeutycznych. Niska immunogenność" jest zdefiniowana tutaj jako istotnie wzrastające odpowiedzi HAHA, HACA lub HAMA u mniej niż około 75% lub zwłaszcza mniej niż około 50% leczonych pacjentów i/lub wzrastające niskie miana u leczonych pacjentów (mniejsze niż około 300, zwłaszcza mniejsze niż około 100 w przypadku pomiaru w enzymatycznym teście immunologicznym z podwójnym antygenem) (Elliott i wsp., Lancet 344: (1994). Zastosowanie Wyizolowane kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku mogą być użyte do otrzymania przynajmniej jednego przeciwciała anty-il-12 lub jego specyficznego wariantu, który może być użyty do pomiaru lub wpływu na komórkę, tkankę, organ lub zwierzę (włączając w to ssaki i ludzi), do diagnostyki, monitorowania, modulowania, leczenia, ulżenia cierpieniu, jako pomoc w zapobieganiu skutków lub zmniejszeniu objawów chorobowych przynajmniej jednego stanu chorobowego związanego z IL-12, wybranego nieograniczająco spośród zaburzenia lub choroby immunologicznej, zaburzenia

7 PL B1 7 lub choroby sercowo-naczyniowej, zaburzenia lub choroby infekcyjnej, związanej z nowotworem złośliwym lub neurologicznej lub innego znanego bądź wyszczególnionego stanu związanego z IL-12. Taki sposób może obejmować podawanie skutecznej dawki kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej zawierającej przynajmniej jedno przeciwciało anty-il-12 komórce, tkance, organowi, zwierzęciu lub pacjentowi potrzebującemu takiej modulacji, leczenia, ulżenia w cierpieniu, ochrony lub zmniejszenia objawów, skutków lub mechanizmów. Skuteczna dawka może obejmować ilość od około 0,001 do 500 mg/kg przy podawaniu pojedynczej dawki (np. w postaci jednej dużej dawki), podawaniu wielokrotnym lub ciągłym albo przy podawaniu dawki jednorazowo, wielokrotnie lub ciągle, do osiągnięcia stężenia 0, μg/ml surowicy lub dowolnego innego zakresu lub wartości w nim zawartych jak to zrobiono i oznaczono przy użyciu znanych sposobów, jak tu opisano lub jak jest to znane w tej dziedzinie. Odesłania Wszystkie publikacje lub patenty cytowane tutaj pokazują stan techniki w chwili opracowywania niniejszego wynalazku i/lub dostarczają opisu i realizacji niniejszego wynalazku. Publikacje dotyczą dowolnych naukowych lub patentowych publikacji lub dowolnej innej informacji w formacie medialnym, włączając w to nagrania, format elektroniczny lub postać wydrukowaną. Poniższe odesłania należy wymienić w szczególności: Ausubel i wsp., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY ( ); Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, i wsp., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY ( ); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, ( ). Przeciwciała według niniejszego wynalazku Przynajmniej jedno przeciwciało anty-il-12 według niniejszego wynalazku może być w sposób opcjonalny wytwarzane przez linię komórkową, mieszaną linię komórkową, komórkę unieśmiertelnioną lub klonalną populację komórek unieśmiertelnionych, jak jest to dobrze znane w tej dziedzinie. Zobacz np. Ausubel, i wsp., wyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY ( ); Sambrook, i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, i wsp., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY ( ); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, ( ). Ludzkie przeciwciała, które są specyficzne dla ludzkich białek IL-12 lub ich fragmentów, mogą być wzbudzane przeciwko odpowiedniemu antygenowi immunogennemu, takiemu jak wyizolowany antygen i/lub białko IL-12 lub jego fragment (włączając w to cząsteczki syntetyczne, takie jak syntetyczne peptydy). Inne specyficzne lub ogólnie ssacze przeciwciała mogą być wzbudzane w podobny sposób. Wytwarzanie przeciwciał immunogennych i wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych może być zrealizowane przy użyciu dowolnej dogodnej techniki. W jednym z podejść wytwarzana jest hybrydoma poprzez fuzję odpowiedniej unieśmiertelnionej linii komórkowej (np. linii komórkowej szpiczaka, takiej jak między innymi Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A lub podobnej, lub heteroszpiczaków, ich produktów fuzyjnych lub dowolnej komórki lub fuzji komórkowej z nich wyprowadzonej, lub dowolnej odpowiedniej linii komórkowej znanej w tej dziedzinie. Zobacz np. i podobne z komórkami wytwarzającymi przeciwciała, takimi jak wyizolowane lub sklonowane komórki śledziony, krwi obwodowej, limfy, migdałków lub inne komórki obejmujące komórki układu immunologicznego lub komórki B lub dowolne inne komórki z ekspresją sekwencji stałych lub zmiennych lub zrębowych lub CDR łańcucha ciężkiego lub lekkiego, zarówno w postaci endogennego jak i heterologicznego kwasu nukleinowego, w postaci rekombinowanego lub endogennego, wirusowego, bakteryjnego, pochodzącego z glonów, prokariotycznego, pochodzącego ze zwierząt ziemnowodnych, owadziego, gadziego, rybiego, ssaczego, pochodzącego z gryzoni, zwierząt jednokopytnych, dwukopytnych, koziego, owczego, pochodzącego z naczelnych, eukariotycznego, genomowego DNA, cdna, rdna, mitochondrialnego DNA lub RNA, chloroplastowego DNA lub RNA, hnrna, mrna, trna, jednoniciowego, dwuniciowego, trójniciowego, hybrydyzowanego i tym podobnych lub jako dowolna ich kombinacja. Zobacz np. Ausubel, jak wyżej, i Colligan, Immunology, jak wyżej, rozdział 2.

8 8 PL B1 Komórki produkujące przeciwciała mogą być także uzyskane z krwi obwodowej lub, w sposób bardziej zalecany, ze śledziony lub węzłów chłonnych ludzi lub innych stosownych zwierząt, które zostały zaimmunizowane antygenem będącym przedmiotem zainteresowania. Do ekspresji heterologicznego lub endogennego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało, jego specyficzny fragment lub wariant może zostać użyta dowolna inna odpowiednia komórka gospodarza. Fuzje komórkowe (hybrydomy) lub komórki rekombinowane mogą być wyizolowane przy użyciu selektywnych warunków hodowli lub innych znanych odpowiednich sposobów i klonowane przez rozcieńczenie do pojedynczych komórek lub przez sortowanie komórek lub innymi znanymi sposobami. Komórki, które produkują przeciwciała z pożądaną specyficznością mogą zostać wyselekcjonowane przez zastosowanie odpowiedniego oznaczenia (np. testu ELISA). Zastosować można inne odpowiednie sposoby wytwarzania lub izolacji przeciwciał o wymaganej specyficzności, włączając w to nieograniczająco sposoby służące do selekcji rekombinowanego przeciwciała z biblioteki peptydowej lub biblioteki białek (przykładowo ale nieograniczająco biblioteka bakteriofagów, rybozymów, oligonukleotydów, RNA, cdna lub podobna, biblioteka oparta na prezentacji, np. dostępna w Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; BioInvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. Zobacz np., EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/ (5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); W090/14443; W090/14424; W090/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754; (Scripps); EP (MorphoSys); W095/16027 (BioInvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); USA 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/ (Affymax); W089/06283; EP ; EP ; (Xoma); EP ; PCT/US91/07149 (Ixsys); lub stochastycznie wygenerowanych peptydów lub białek - USA , , , , , , WO 86/05803, EP (Ixsys, obecnie Applied Molecular Evolution (AME), lub które polegają na immunizacji transgenicznych zwierząt (np. myszy SCID, Nguyen i wsp., Microbiol. Immunol. 41: (1997); Sandhu i wsp., Crit. Rev. Biotechnol. 16: (1996); Eren i wsp., Immunol. 93: (1998), jak również pokrewne patenty i zastosowania, w wyniku których można otrzymać różne ludzkie przeciwciała, jak jest to znane w tej dziedzinie i/lub tu opisane. Takie techniki nieograniczająco obejmują prezentację na rybosomie (Hanes i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: (May 1997); Hanes i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: (Nov. 1998)); technologie otrzymywania przeciwciała z pojedynczej komórki (np. sposób selekcji przeciwciała z wybranego limfocytu ("SLAM") (Patent USA Nr , Wen i wsp., J. Immunol. 17: (1987); Babcook i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: (1996)); mikrokropelki żelowe i cytometrię przepływową (Powell i wsp., Biotechnol. 8: (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray i wsp., J. Imm. Meth. 182: (1995); Kennyetal., Bio/Technol. 13: (1995)); selekcję komórek B (Steenbakkers i wsp., Molec. Biol. Reports 19: (1994); Jonak i wsp., Progress Biotech, Tom 5, In vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, wyd., Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988)). Sposoby obróbki lub humanizowania innych niż ludzkie lub ludzkich przeciwciał mogą być także zastosowane i są one dobrze znane w tej dziedzinie. Ogólnie humanizowane lub poddane obróbce przeciwciało posiada jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych ze źródła, które jest inne niż ludzkie, np. nieograniczająco myszy, szczura, królika, naczelnych innych niż człowiek lub innych ssaków. Te ludzkie reszty aminokwasowe często są określane jako reszty importowane", które są zazwyczaj wzięte z importowanej" zmiennej, stałej lub innej domeny znanej ludzkiej sekwencji. Znane ludzki sekwencje Ig są ujawnione np. w mcb.harvard.edu/biolinks/immunology.html.

9 PL B1 9 pathbox.wustl.edu/hcenter/index.html; aximtl.imt.unimarburg.de/rek/aepstart.html; baserv.uci.kun.nl/jraats/linksl.html; imgt.cnusc.fr:8104/; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/ Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), każde włączone tutaj jako odniesienie. Takie importowane sekwencje mogą być użyte do zmniejszenia immunogenności lub zmniejszania, wzmacniania lub modyfikacji wiązania, powinowactwa, szybkości wiązania, szybkości oddysocjowania, zachłanności wiązania, okresu półtrwania lub innej odpowiedniej cechy, jak jest to znane w tej dziedzinie. Ogólnie, część lub całość ludzkich lub innych niż ludzkie sekwencji CDR jest zachowywana, podczas gdy regiony zmienne lub stałe są zastępowane przez aminokwasy występujące w sekwencji ludzkiej lub innej. Przeciwciała w sposób opcjonalny mogą być humanizowane z pozostawieniem silnego powinowactwa do antygenu i innych pożądanych właściwości biologicznych. Aby to osiągnąć, humanizowane przeciwciała mogą być w sposób opcjonalny przygotowane przez proces analizy sekwencji wyjściowych i różnych opracowanych produktów humanizowanych przy użyciu przestrzennych modeli sekwencji wyjściowych i humanizowanych. Modele przestrzenne immunoglobulin są powszechnie dostępne i są znane specjalistom w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe, które obrazują i przedstawiają prawdopodobne przestrzenne struktury konformacyjne wybranych sekwencji immunoglobulin. Przegląd tych przedstawień pozwala na analizę przypuszczalnej roli reszt aminokwasowych w funkcjonowaniu wybranej sekwencji immunoglobulinowej, tj. analizę reszt aminokwasowych, które wpływają na zdolność wybranej sekwencji immunoglobulinowej do wiązania swojego antygenu. W ten sposób reszty aminokwasowe FR mogą być wybrane i połączone z sekwencjami najwyższej zgodności i importowanymi tak, że uzyskana zostaje odpowiednia cecha przeciwciała taka, jak zwiększone powinowactwo do antygenu (antygenów). Ogólnie reszty aminokwasowe CDR są w sposób bezpośredni i najbardziej znaczący zaangażowane we wpływ na wiązanie antygenu. Humanizowanie lub projektowanie przeciwciała według niniejszego wynalazku może być wykonane przy użyciu dowolnego znanego sposobu, takiego jak nieograniczająco opisany w Winter (Jones i wsp., Nature 321:522 (1986); Riechmann i wsp. Nature 332:323 (1988); Verhoeyen i wsp., Science 239:1534 (1988)), Sims i wsp., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:4285 (1992); Presta i wsp., J. Immunol. 151:2623 (1993), patentach USA nr: , , , , , , , , , , , , , , ; , PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; W090/14443, W090/14424, W090/14430, EP Przeciwciało anty-il-12 może być ewentualnie wytworzone przez immunizację zwierzęcia transgenicznego (np. myszy, szczura, chomika, naczelnych innych niż człowiek i tym podobnych) zdolnego do produkcji repertuaru przeciwciał ludzkich, jak tutaj opisano i/lub jak jest to znane w tej

10 10 PL B1 dziedzinie. Komórki, które wytwarzają ludzkie przeciwciało anty-il-12 mogą być wyizolowane z takich zwierząt i unieśmiertelnione przy użyciu stosownych sposobów takich, jak sposoby opisane tutaj. Myszy transgeniczne, które mogą wytarzać repertuar ludzkich przeciwciał, które wiążą się z ludzkimi antygenami, mogą być otrzymane znanymi sposobami (np. nieograniczająco patenty USA nr: , , , , , , i na rzecz Lonberg i wsp.; Jakobovits i wsp. WO 98/50433, Jakobovits i wsp. WO 98/24893, Lonberg i wsp. WO 98/24884, Lonberg i wsp. WO 97/13852, Lonberg i wsp. WO 94/25585, Kucherlapate i wsp. WO 96/34096, Kucherlapate i wsp. EP B1, Kucherlapate i wsp. EP Al, Surani i wsp. Patent USA Nr , Bruggemann i wsp. WO 90/04036, Bruggemann i wsp. EP B1, Lonberg i wsp. EP A2, Lonberg i wsp. GB A, Lonberg i wsp. Nature 368: (1994), Taylor i wsp., Int. Immunol. 6(4) (1994), Green i wsp, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez i wsp., Nature Genetics 15: (1997), Taylor i wsp., Nucleic Acids Research 20(23): (1992), Tuaillon i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 90(8) (1993), Lonberg i wsp., Int Rev Immuzlol 13(l):65-93 (1995) i Fishwald i wsp., Nat Biotechnol 14 (7): (1996). Ogólnie myszy te zawierają przynajmniej jeden transgen zawierający DNA z przynajmniej jednego locus ludzkiej immunoglobuliny, który uległ funkcjonalnej rearanżacji lub który może przejść funkcjonalną rearanżację. Endogenne loci immunoglobulinowe u takiej myszy może być uszkodzone lub usunięte w celu wyeliminowania zdolności zwierzęcia do produkcji przeciwciał przez endogenne geny. Przeszukiwanie przeciwciał w celu znalezienia specyficznego wiązania się do podobnych białek lub fragmentów może być wykonane przy użyciu bibliotek prezentacji peptydów. Sposób ten polega na przeszukiwaniu dużych kolekcji peptydów w celu znalezienia pojedynczych jej członków posiadających pożądaną funkcję lub strukturę. Przeszukiwanie przeciwciałami takich bibliotek prezentacji peptydów jest dobrze znane w tej dziedzinie. Prezentowane sekwencje peptydowe mogą posiadać długość od 3 do 5000 lub więcej aminokwasów, często długość od 5 do 100 aminokwasów i najczęściej długość od około 8 do 25 aminokwasów. Ponadto oprócz sposobów generowania bibliotek peptydowych bezpośrednio sposobami syntezy chemicznej, opisano kilka sposobów z użyciem rekombinowanego DNA. Jeden typ polega na prezentacji sekwencji peptydowej na powierzchni bakteriofaga lub komórki. Każdy bakteriofag lub komórka zawiera sekwencję nukleotydową kodującą poszczególne prezentowane sekwencje peptydowe. Takie sposoby są opisane w publikacjach Patentowych PCT Nr 91/17271, 91/18980, 91/19818, i 93/ Inne systemy wytwarzania bibliotek peptydowych posiadają aspekty zarówno syntezy chemicznej, jak i sposobów rekombinacji DNA. Zobacz publikacje patentowe Nr 92/05258, 92/14843 i 96/ Zobacz także patenty USA Nr i Bibioteki peptydowe, wektory i zestawy do przeszukiwania są komercyjnie dostępne u takich dostawców jak Invitrogen (Carlsbad, CA) i Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Zobacz np. patenty USA nr , , , , , , , , , , na rzecz Enzon; , , , na rzecz Dyax, , , na rzecz Affymax; na rzecz Cambridge Antibody Technologies; na rzecz Genentech, , , , , , na rzecz Xoma, Colligan, jak wyżej; Ausubel, jak wyżej; lub Sambrook, jak wyżej. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być otrzymane przy użyciu przynajmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-il-12, do dostarczenia transgenicznym zwierzętom lub ssakom, takim jak kozy, krowy, konie, owca i tym podobne, które produkują takie przeciwciała w swoim mleku. Takie zwierzęta mogą być otrzymane przy zastosowaniu znanych sposobów. Zobacz np. nieograniczająco patenty USA nr ; ; ; ; ; ; i tym podobne. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być ponadto otrzymane przy użyciu przynajmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-il-12, w celu dostarczenia go transgenicznym roślinom i hodowanym komórkom roślinnym (np. nieograniczająco tytoniu i kukurydzy), które wytwarzają takie przeciwciała, specyficzne fragmenty lub warianty w komórkach lub częściach roślin z nich wyhodowanych. Jako nieograniczający przykład, liście transgenicznego tytoniu z ekspresją rekombinowanych białek zostały z powodzeniem użyte do otrzymania dużych ilości rekombinowanych białek, np. przy użyciu promotora indukowanego. Zobacz np. Cramer i wsp., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: (1999) i odesłania tam cytowane. Także transgeniczna kukurydza została użyta do ekspresji na skalę przemysłową ssaczych białek, których aktywności biologiczne są równoważne z białkami otrzymywanymi w innych systemach rekombinowanych lub oczyszczanymi

11 PL B1 11 ze źródeł naturalnych. Zobacz, np., Hood i wsp., Adv. Exp. Med. Biol. 464: (1999) i referencje tam cytowane. Przeciwciała były także otrzymywane w dużych ilościach z nasion roślin transgenicznych, włączając w to fragmenty przeciwciał, takie jak przeciwciała jednołańcuchowe (scfv's), w tym nasiona tytoniu i bulwy ziemniaka. Zobacz np. Conrad i wsp., Plant Mol. Biol. 38: (1998) i odnośniki tam cytowane. Tak więc, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być także otrzymane przy użyciu transgenicznych roślin według znanych sposobów. Zobacz także np. Fischer i wsp., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: (Oct., 1999), Ma i wsp., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma i wsp., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam i wsp., Biochem. Soc. Trans. 22: (1994) i odesłania tam cytowane. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą wiązać się z ludzką IL-12 w dużym zakresie powinowactwa (K D ). W zalecanym wykonaniu przynajmniej jedno ludzkie mab według niniejszego wynalazku może w sposób opcjonalny wiązać się z ludzkim IL-12 z wysokim powinowactwem. Na przykład, ludzkie mab może wiązać się z ludzką IL-12 z K D równą lub mniejszą niż 10-7 M, taką jak nieograniczająco 0,1-9,9 (lub dowolny zakres lub wartość spośród wymienionych) X 10-7,10-8,10-9, 10-10, 10-11, 10-12, lub dowolny zakres lub wartość spośród wymienionych. Powinowactwo lub zachłanność wiązania przeciwciała względem antygenu może być oznaczona doświadczalnie przy użyciu stosownego sposobu. (Zobacz na przykład Berzofsky, i wsp., "Antibody-Antigen Interactions" w Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman i Company: New York, NY (1992); i sposoby opisane tutaj). Mierzone powinowactwo poszczególnych interakcji przeciwciało-antygen może zmieniać się przy pomiarze w różnych warunkach (np. stężenie soli, ph). Tak więc, pomiary powinowactwa i innych parametrów wiązania antygenu (np. K D, K a, K d ) w sposób zalecany są wykonywane w standaryzowanych roztworach przeciwciała i antygenu, takich jak opisany tutaj bufor. Cząsteczki kwasu nukleinowego Cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku kodująca przynajmniej jedno przeciwciało anty-il-12 może zostać otrzymana przy zastosowaniu sposobów opisanych tutaj lub znanych w tej dziedzinie. Cząsteczki kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku mogą być w postaci RNA, takiego jak mrna, hnrna, trna lub dowolnej innej jego postaci lub w postaci DNA, włączając w to, między innymi cdna, DNA genomowy uzyskany przez klonowanie lub otrzymany na drodze syntezy albo dowolną ich kombinację. DNA może być trójniciowy, dwuniciowy lub jednoniciowy, lub być dowolną ich kombinacją. Dowolny fragment przynajmniej jednej nici DNA lub RNA może być nicią kodującą, znaną także jako nić sensowna lub może być nicią niekodującą, nazywaną także nicią antysensowną. Wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego tu ujawnione mogą obejmować cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające otwartą ramkę odczytu (ORF), opcjonalnie z jednym lub kilkoma intronami, np. nieograniczająco przynajmniej jeden specyficzny fragment przynajmniej jednego regionu CDR, takiego jak CDR1, CDR2 i/lub CDR3 przynajmniej jednego łańcucha ciężkiego (np. SEK ID NR:1-3) lub łańcucha lekkiego (np. SEK ID NR:4-6); cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencję kodującą przeciwciało anty-il-12 lub region zmienny (np. SEK ID NR: 7, 8) oraz cząsteczki kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję nukleotydową zasadniczo inną od tych opisanych powyżej, ale która dzięki zdegenerowaniu kodu genetycznego, nadal koduje przynajmniej jedno przeciwciało anty-il-12 jak opisano tutaj i/lub jest to znane w tej dziedzinie. Oczywiście, kod genetyczny jest dobrze znany w tej dziedzinie. Tak więc, stworzenie takich zdegenerowanych wariantów kwasu nukleinowego, które kodują specyficzne przeciwciała anty-il-12 według niniejszego wynalazku jest rutynową czynnością dla specjalisty w tej dziedzinie. Zobacz np. Ausubel, i wsp. jak wyżej. Nie stanowiące ograniczenia przykłady wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego obejmują sekwencje SEK ID NR:1-8 odpowiadające nie stanowiącym ograniczenia przykładom kwasu nukleinowego kodującego odpowiednio HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, region zmienny HC i region zmienny LC. Jak tutaj opisano cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, które zawierają kwas nukleinowy kodujący przeciwciało anty-il-12 mogą obejmować, ale nieograniczająco cząsteczki samodzielnie kodujące sekwencję aminokwasową fragmentu przeciwciała; sekwencje kodujące całe przeciwciało lub jego część; sekwencje kodujące przeciwciało, jego fragment lub część, jak również sekwencje dodatkowe, takie jak sekwencja kodująca przynajmniej jeden sygnał liderowy lub białko fuzyjne z lub bez powyżej wspomnianych dodatkowych sekwencji kodujących, takich jak przy-

12 12 PL B1 najmniej jeden intron, razem z dodatkowymi sekwencjami niekodującymi, włączając w to, ale nieograniczająco niekodujące sekwencje 5' i 3', takie jak ulegające transkrypcji, ale nie ulegające translacji sekwencje, które odgrywają rolę w transkrypcji, obróbce mrna, włączając w to wycinanie intronów i sygnały poliadenylacji (na przykład wiązanie rybosomów i stabilność mrna); dodatkową sekwencję kodującą, która koduje dodatkowe aminokwasy, takie jak te, które dostarczają dodatkowych funkcji. Tak więc, sekwencja kodująca przeciwciało może być poddana fuzji z sekwencją znacznikową, taką jak sekwencja kodująca peptyd, który ułatwia oczyszczanie przeciwciała poddanego fuzji zawierającego fragment lub część przeciwciała. Polinukleotydy, które selektywnie hybrydyzują do opisanego tutaj polinukleotydu Niniejszy opis ujawnia wyizolowane kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w warunkach selektywnej hybrydyzacji do ujawnionego tutaj polinukleotydu. Tak więc tego rodzaju polinukleotydy mogą być zastosowane do izolowania, wykrywania i/lub mierzenia ilości kwasów nukleinowych zawierających takie polinukleotydy. Na przykład, polinukleotydy mogą być użyte do identyfikacji, izolacji lub amplifikacji klonów o częściowej lub pełnej długości w zdeponowanej bibliotece. W pewnych wykonaniach polinukleotydy są wyizolowanymi sekwencjami genomowymi lub cdna, lub wręcz przeciwnie, komplementarnymi do cdna z biblioteki ludzkich lub ssaczych kwasów nukleinowych. Zalecane jest by biblioteka cdna zawierała przynajmniej 80% sekwencji o pełnej długości, zwłaszcza 85% lub 90% sekwencji o pełnej długości i w szczególności przynajmniej 95% sekwencji pełnej długości. Biblioteki cdna mogą być normalizowane w celu zwiększenia reprezentacji rzadkich sekwencji. Łagodne lub pośrednie warunki hybrydyzacji są zazwyczaj, ale nie wyłącznie, stosowane do sekwencji mających zmniejszoną identyczność sekwencji w stosunku do sekwencji komplementarnych. Umiarkowane lub restrykcyjne warunki hybrydyzacji mogą być opcjonalnie zastosowane do sekwencji o większej identyczności. Łagodne warunki hybrydyzacji pozwalają na selektywną hybrydyzację sekwencji mających około 70% identyczności i mogą być zastosowane do identyfikacji sekwencji ortologów lub paralogów. Opcjonalnie polinukleotydy będą kodować przynajmniej część przeciwciała kodowanego przez tutaj opisane polinukleotydy. Polinukleotydy obejmują sekwencje kwasów nukleinowych, które mogą być wykorzystane do selektywnej hybrydyzacji do polinukleotydu kodującego przeciwciało według niniejszego wynalazku. Zobacz np. Ausubel, jak wyżej; Colligan, jak wyżej. Konstruowanie kwasów nukleinowych Wyizolowane kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku mogą zostać wytworzone przy użyciu (a) sposobów rekombinacji genetycznej, (b) technik syntezy, (c) technik oczyszczania lub ich kombinacji, jak jest to dobrze znane w tej dziedzinie. Kwasy nukleinowe mogą w sposób dogodny obejmować sekwencje dodatkowe w stosunku do polinukleotydu według niniejszego wynalazku. Na przykład miejsce wielokrotnego klonowania zawierające jedno lub kilka miejsc cięcia dla endonukleaz może być dodane do kwasu nukleinowego w celu ułatwienia izolacji polinukleotydu. Także sekwencje ulegające translacji mogą być dodane w celu ułatwienia izolacji ulegającego translacji polinukleotydu według niniejszego wynalazku. Na przykład znacznik o sekwencji sześciu histydyn dostarcza dogodnego sposobu oczyszczania białek według niniejszego wynalazku. Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku, wyłączając sekwencje kodujące - w sposób opcjonalny jest wektorem, adaptorem lub linkerem do klonowania i/lub ekspresji polinukletotydu według niniejszego wynalazku. Do sekwencji do klonowania i/lub ekspresji mogą być dodane dodatkowe sekwencje w celu optymalizacji ich funkcji w klonowaniu i/lub ekspresji, w celu ułatwienia izolacji polinukleotydu, lub w celu poprawy wprowadzania polinukleotydu do komórki. Zastosowanie wektorów do klonowania, wektorów ekspresyjnych, adaptorów i linkerów jest dobrze znane w tej dziedzinie. (Zobacz np. Ausubel, jak wyżej; lub Sambrook, jak wyżej). Sposoby rekombinacji genetycznej stosowane do konstrukcji kwasów nukleinowych Kompozycje w postaci wyizolowanego kwasu nukleinowego, takiego jak RNA, cdna, genomowy DNA lub dowolnej ich kombinacji, mogą być uzyskane ze źródeł biologicznych przy użyciu szeregu metod klonowania znanych specjalistom w tej dziedzinie. W pewnych wykonaniach, sondy oligonukleotydowe, które hybrydyzują selektywnie w surowych warunkach hybrydyzacji do polinukleotydów według niniejszego wynalazku są stosowane do identyfikacji pożądanej sekwencji w bibliotece cdna lub genomowego DNA. Izolacja RNA i konstrukcja cdna i bibliotek genomowych jest dobrze znana specjalistom w tej dziedzinie. (Zobacz, np. Ausubel, jak wyżej; lub Sambrook, jak wyżej).