(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US98/15423 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US98/15423 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO99/05280 PCT Gazette nr 05/99 (51) Int.Cl. C12N 15/24 ( ) C07K 14/54 ( ) C07K 16/24 ( ) C12Q 1/68 ( ) (54) Izolowany i rekombinowany polinukleotyd, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu antygenowego, sposób wykrywania polinukleotydu, zestawy do wykrywania polinukleotydu, związek wiążący i sposób jego zastosowania, zasadniczo czysty albo izolowany polipeptyd antygenowy, sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo komórek hodowli tkankowej, rekombinowane przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen oraz sterylna kompozycja (30) Pierwszeństwo: ,US,08/900,905 (73) Uprawniony z patentu: SCHERING CORPORATION,Kenilworth,US (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 21/00 (72) Twórca(y) wynalazku: J.Fernando Bazan,Menlo Park,US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/08 (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o. PL B1 (57) 1. Izolowany i rekombinowany polinukleotyd kodujący antygenowy polipeptyd obejmujący: a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 2; b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 4; albo c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr Sposób wykrywania polinukleotydu określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie polinukleotydu z sondą, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z przynajmniej 25 sąsiadującymi nukleotydami: a) części kodującej z Id. Sekw. nr 1; albo b) części kodującej z Id. Sekw. nr 3; z wytworzeniem dupleksu, przy czym wykrycie dupleksu wskazuje na obecność polinukleotydu. 13. Sposób zastosowania związku wiążącego określonego w zastrz. 11, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie związku wiążącego z próbką biologiczną zawierającą antygen, przy czym kontaktowanie powoduje wytworzenie kompleksu związku wiążącego i antygenu.

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest izolowany i rekombinowany polinukleotyd, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu antygenowego, sposób wykrywania polinukleotydu, zestawy do wykrywania polinukleotydu, związek wiążący i sposób jego zastosowania, zasadniczo czysty albo izolowany polipeptyd antygenowy, sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo komórek hodowli tkankowej, rekombinowane przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen oraz sterylna kompozycja. Wynalazek dotyczy w ogólności rozwiązań związanych z białkami, które działają kontrolując biologię i fizjologię komórek ssaków, np. komórek układu odpornościowego ssaków. W szczególności niniejszym ujawnione zostały geny, białka, przeciwciała i pokrewne antygeny przydatnych, np. w regulowaniu aktywacji, rozwoju, różnicowania i działania różnych rodzajów komórek, w tym komórek krwiotwórczych. Technologia rekombinowanego DNA dotyczy zasadniczo techniki integracji informacji genetycznej ze źródła donorowego do wektorów, w celu dalszego przetwarzania, na przykład przez wprowadzanie do organizmu gospodarza, przy czym przenoszona informacja genetyczna jest kopiowana i/lub wyrażana w nowym środowisku. Zwykle, informacja genetyczna występuje w postaci komplementarnego DNA (cdna) pochodzącego z matrycowego RNA (mrna) kodującego pożądany produkt białkowy. Nośnikiem często jest plazmid o zdolności włączania cdna do dalszej replikacji w organizmie gospodarza, zaś w niektórych przypadkach, zasadniczo do kontrolowania ekspresji cdna i kierowania syntezą kodowanego produktu w organizmie gospodarza. Od pewnego czasu wiadomo, że reakcja odpornościowa ssaków oparta jest na szeregu złożonych oddziaływań komórkowych, określanych jako sieć odpornościowa. Ostatnie badania dostarczyły nowych informacji dotyczących wewnętrznego działania tej sieci. O ile pozostaje oczywiste, że większość tej reakcji toczy się wokół oddziaływań limfocytów, makrofagów, granulocytów i innych komórek, immunolodzy współcześnie twierdzą, że białka rozpuszczalne, znane jako limfokiny, cytokiny albo monokiny, odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu tych oddziaływań komórkowych. Tak więc, istnieje istotne zainteresowanie izolacją, charakteryzacją i mechanizmami działania czynników modulujących komórki, których poznanie powinno doprowadzić do znacznego postępu w diagnostyce i terapii licznych zaburzeń, np. chorób układu odpornościowego. Niektóre z tych czynników są krwiotwórczymi czynnikami wzrostowymi, np. czynnik pobudzający kolonie granulocytów (G-CSF). Patrz, Thompson (1994; red.) The Cytokine Handbook (wyd. 2) Academic Press, San Diego; Metcalf i Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, Cambridge University Press; i Aggarwal i Gutterman (1991) Human cytokines; Blackwell Publ. Limfokiny pośredniczą w aktywności komórek w różny sposób. Wykazano, że podtrzymują proliferację, wzrost i różnicowanie pluripotencjalnych krwiotwórczych komórek macierzystych w kierunku wielu linii progenitorowych obejmujących różnorodne linie komórkowe, tworzących złożony układ odpornościowy. Właściwe i zrównoważone oddziaływanie pomiędzy składnikami komórkowymi są konieczne do prawidłowej reakcji odpornościowej. Różne linie komórkowe często reagują w różny sposób gdy limfokiny podawane są w połączeniu z innymi czynnikami. Linie komórkowe szczególnie istotne dla odpowiedzi odpornościowej obejmują dwie klasy limfocytów: limfocyty B, które wytwarzają i wydzielają immunoglobuliny (białka posiadające zdolność rozpoznawania i wiązania ciał obcych w celu ich usunięcia) oraz limfocyty T różnych podtypów, które wydzielają limfokiny i indukują albo hamują limfocyty B i inne komórki (w tym inne limfocyty T) tworzące sieć odpornościową. Limfocyty te oddziałują z wieloma innymi rodzajami komórek. Inną istotną linią komórek są komórki tuczne (których nie zidentyfikowano u wszystkich gatunków ssaków), które są komórkami tkanki łącznej, zawierającymi ziarnistości, umiejscowionymi proksymalnie do naczyń włosowatych w organizmie człowieka. Stwierdzono, że komórki te występują ze szczególną gęstością w płucach, skórze i przewodzie pokarmowym oraz moczowo-płciowym. Komórki tuczne odgrywają kluczową w zaburzeniach o typie alergicznym, szczególnie w anafilaksji w następujący sposób: gdy wybrane antygeny usieciują jedną z klas immunoglobulin związanych z receptorami na powierzchni komórek tucznych, komórka tuczna ulega degranulacji i uwalnia mediatory, np. histaminę, serotoninę, heparynę i prostaglandyny, które wywołują reakcję alergiczną, np. anafilaksję. Badania nad lepszym zrozumieniem i leczeniem różnych zaburzeń immunologicznych są hamowane przez generalną niemożliwość utrzymania komórek układu odpornościowego in vitro. Immu-

3 PL B1 3 nolodzy ujawnili, że hodowanie tych komórek można uzyskać przez zastosowanie nadsączy limfocytów T i innych komórek, które zawierają różne czynniki wzrostowe, w tym wiele limfokin. Z powyższego wynika, że ujawnienie i opracowanie nowych limfokin np. pokrewnych z G-CSF i/lub IL-6 może przyczynić się do powstania nowych terapii wielu stanów degeneracyjnych albo nieprawidłowych, które bezpośrednio albo pośrednio dotyczą układu odpornościowego i/lub komórek krwiotwórczych. W szczególności, ujawnienie i opracowanie limfokin, które zwiększają albo nasilają korzystną aktywność znanych limfokin, powinno być szczególnie korzystne. Niniejszym opisane zostały nowe kompozycje interleukin i substancji pokrewnych oraz sposoby ich zastosowania. Wynalazek dotyczy interleukiny-b30 (IL-B30) ssaków, np. gryzoni, psów, kotów, naczelnych i jej aktywności biologicznej. Niniejszym ujawnione zostały kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy i sposoby ich wytwarzania i zastosowania. Opisane poniżej kwasy nukleinowe są scharakteryzowane częściowo przez homologię z załączonymi tu klonowanymi sekwencjami komplementarnego DNA (cdna) i/lub testy funkcjonalne aktywności wobec czynnika wzrostowego albo cytokiny, np. G-CSF (patrz, Nogata (1994), Thompson (red.) The Cytokine Handbook, wyd. 2, Academic Press, San Diego) i/lub IL-6 (patrz Hirano (1994), tamże), które są zastosowane wobec polipeptydów kodowanych zazwyczaj przez te kwasy nukleinowe. Ujawnione zostały również sposoby modulowania albo włączania się w zależną od czynników wzrostowych kontrolę fizjologii albo reakcji odpornościowej. Wynalazek jest oparty, częściowo, na ujawnieniu nowej sekwencji cytokiny wykazującej istotne podobieństwo sekwencji i budowy z G-CSF i IL-6. W szczególności, przedstawiony został gen naczelnych, np. człowieka, kodujący białko, którego wielkość postaci dojrzałej wynosi około 168 aminokwasów, oraz sekwencje świni i gryzoni, np. myszy. Funkcjonalne odpowiedniki wykazujące istotną homologię sekwencji dostępne są z innych gatunków ssaków, np. bydła, koni i szczurów, oraz gatunków innych niż ssaki. Opisano niniejszym zasadniczo czyste albo rekombinowane białko IL-B30 wykazujące przynajmniej około 85% identyczności sekwencji na długości przynajmniej 12 aminokwasów o Id. Sekw. nr 2; naturalną sekwencję IL-B30 o Id. Sekw. nr 2; oraz białko fuzyjne obejmujące sekwencję IL-B30. Homologia opisanego tu białka może wynosić przynajmniej około 90% identyczności na odcinku o długości przynajmniej około 9 aminokwasów; przynajmniej około 80% identyczności na odcinku o długości przynajmniej około 17 aminokwasów; przynajmniej około 70% identyczności na odcinku o długości przynajmniej około 25 aminokwasów. IL-B30 obejmuje dojrzałą sekwencję przedstawioną w Tabeli 1 albo może wykazywać wzorzec modyfikacji potranslacyjnej różny od naturalnej IL-B30. Opisane tu białko albo peptyd pochodzi od zwierzęcia stałocieplnego, wybranego z grupy obejmującej ssaki, w tym naczelne; obejmuje przynajmniej jeden segment polipeptydowy o Id. Sekw. nr 2; wykazuje wiele części wykazujących wyżej wskazany procent identyczności do wyżej wskazanej sekwencji; jest naturalną odmianą alleliczną IL-B30; ma długość przynajmniej około 30 aminokwasów; wykazuje przynajmniej dwa nienakładające się epitopy, które są swoiste dla IL-B30 ssaków; wykazuje identyczność sekwencji wynoszącą przynajmniej około 90% na długości przynajmniej około 20 aminokwasów z IL-B30 ssaków; jest glikozylowane; ma ciężar cząsteczkowy wynoszący przynajmniej 10 kda z naturalną glikozylacją; jest polipeptydem syntetycznym; jest przyłączone do podłoża stałego; jest sprzęgnięte z inną cząsteczką chemiczną; jest podstawione w 5 albo w mniejszej liczbie miejsc; albo jest odmianą delecyjną albo insercyjną sekwencji naturalnej. Opisano niniejszym kompozycję obejmującą: sterylne białko albo peptyd IL-B30; albo białko albo peptyd IL-B30 i nośnik, przy czym nośnikiem jest woda lub roztwór wodny obejmujący roztwór soli i/lub bufor; kompozycja jest sformułowana do podawania doustnego, doodbytniczego, donosowego, miejscowego albo pozajelitowego. Opisane tu białko fuzyjne może wykazywać: sekwencję dojrzałego białka przedstawioną w Tabeli 1; znacznik umożliwiający wykrywanie albo oczyszczanie, w tym FLAG, His6 albo segment Ig; i/lub sekwencję innej cytokiny albo chemokiny. Opisano niniejszym również zestawy obejmujące białko albo polipeptyd IL-B30, przy czym obejmują one przedział z białkiem albo polipeptydem; i/lub instrukcję stosowania albo wykorzystania reagentów w zestawie. Opisany tu związek wiążący może mieć miejsce wiązania z przeciwciała, które swoiście wiąże się z naturalnym białkiem IL-B30, przy czym IL-B30 jest białkiem ssaka; związek wiążący jest fragmentem Fv, Fab albo Fab 2 ; związek wiążący jest sprzęgnięty z inną resztą chemiczną; a przeciwciało: jest wytworzone przeciwko sekwencji peptydowej dojrzałego polipeptydu przedstawionej w Tabeli 1; jest wytworzone przeciwko dojrzałej IL-B30; jest wytworzone przeciwko oczyszczonej IL-B30 gryzoni;

4 4 PL B1 jest selekcjonowane immunologicznie; jest przeciwciałem poliklonalnym; wiąże się z denaturowaną IL-B30; wykazuje Kd o wartości przynajmniej 30 μm; jest połączone z substratem stałym, w tym perełką albo membraną z tworzywa sztucznego; jest w sterylnej kompozycji; albo jest znakowane w wykrywalny sposób, w tym znacznikiem radioaktywnym albo fluorescencyjnym. Zestawy zawierające związki wiążące obejmują przedział zawierający związek wiążący; i/lub instrukcję stosowania albo wykorzystania reagentów w zestawie. Często zestawem można przeprowadzić analizę jakościową albo ilościową. Kompozycje będą obejmowały: sterylny związek wiążący; albo związek wiążący i nośnik, przy czym nośnikiem jest woda lub roztwór wodny obejmujący roztwór soli i/lub bufor, kompozycja jest sformułowana do podawania doustnego, doodbytniczego, donosowego, miejscowego albo pozajelitowego. Opisane poniżej kwasy nukleinowe obejmują izolowany albo rekombinowany kwas nukleinowy kodujący białko IL-B30 albo peptyd albo białko fuzyjne, przy czym: białko IL-B30 pochodzi od ssaka; i/lub kwas nukleinowy: koduje sekwencję peptydu antygenowego przedstawioną w Tabeli 1; koduje wiele sekwencji peptydu antygenowego przedstawionych w Tabeli 1; wykazuje przynajmniej około 80% identyczność z naturalnym cdna kodującym segment; jest wektorem ekspresyjnym; dalej obejmuje początek replikacji; pochodzi ze źródła naturalnego; obejmuje wykrywalny znacznik; obejmuje syntetyczną sekwencję nukleotydową; jest mniejszy niż 6 kb; korzystnie mniejszy niż 3 kb; pochodzi od ssaka, w tym od naczelnego; obejmuje naturalną sekwencję kodującą pełnej długości; jest sondą hybrydyzacyjną dla genu kodującego IL-B30; albo jest starterem PCR, produktem PCR albo starterem mutagennym. Możliwe jest również otrzymanie komórki, tkanki albo narządu obejmującego taki kwas nukleinowy; korzystnie komórka jest: komórką prokariotyczną; komórką eukariotyczną; komórką bakteryjną; komórką drożdżową; komórką owada; komórką ssaka; komórką myszy; komórką naczelnego albo komórką ludzką. Opisano niniejszym również zestawy, które zawierają taki kwas nukleinowy, przy czym obejmują one przedział zawierający kwas nukleinowy; przedział ponadto zawierający białko IL-B30 albo polipeptyd; i/lub instrukcje zastosowania albo wykorzystania reagentów w zestawie. Zwykle, zestaw umożliwia przeprowadzenie analizy jakościowej albo ilościowej. Kwas nukleinowy: hybrydyzuje w warunkach płukania 30 C i mniej niż 2 M sól, albo 45 C i/lub 500 mm sól, albo 55 C i/lub 150 mm sól z Id. Sekw. nr 1; albo wykazuje przynajmniej około 85% identyczności i/lub ciąg wynosi przynajmniej około 30 nukleotydów albo wykazuje przynajmniej około 90% identyczność i/lub ciąg wynosi przynajmniej około 55 nukleotydów; albo wykazuje przynajmniej 95% i/lub ciąg wynosi przynajmniej 75 nukleotydów z IL-B30 naczelnych. Przedstawiony został również sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo hodowli tkankowej obejmujący kontaktowanie komórki z agonistą albo antagonistą IL-B30 ssaka. Sposób może polegać na: kontaktowaniu w kombinacji z agonistą albo antagonistą G-CSF i/lub IL-6; albo kontaktowaniu z antagonistą, w tym kompozycją wiążącą obejmującą miejsce wiążące przeciwciała, które swoiście wiąże się z IL-B30. W szczególności przedmiotem wynalazku jest izolowany i rekombinowany polinukleotyd kodujący antygenowy polipeptyd obejmujący: a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 2; b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 4; albo c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 5. Korzystnie polinukleotyd według wynalazku koduje dojrzały polipeptyd o: a) Id. Sekw. nr 2; albo b) Id. Sekw. nr 4. Również korzystnie polinukleotyd według wynalazku hybrydyzuje w 55 C, mniej niż 500 mm soli i 50% formamidzie z: a) częścią kodującą o Id. Sekw. nr 1; albo b) częścią kodującą o Id. Sekw. nr 3. Korzystniej polinukleotyd według wynalazku obejmuje: a) przynajmniej 35 sąsiadujących nukleotydów części kodującej o Id. Sekw. nr 1; albo b) przynajmniej 35 sąsiadujących nukleotydów części kodującej o Id. Sekw. nr 3. Przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresyjny obejmujący polinukleotyd według wynalazku oraz komórka gospodarza zawierająca ten wektor ekspresyjny, w tym komórka eukariotyczna. Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania polipeptydu antygenowego obejmującego ekspresję rekombinowanego polinukleotydu według wynalazku.

5 PL B1 5 Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania polinukleotydu według wynalazku obejmujący kontaktowanie polinukleotydu z sondą, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z przynajmniej 25 sąsiadującymi nukleotydami: a) części kodującej z Id. Sekw. nr 1; albo b) części kodującej z Id. Sekw. nr 3; z wytworzeniem dupleksu, przy czym wykrycie dupleksu wskazuje na obecność polinukleotydu. Przedmiotem wynalazku jest ponadto zestaw do wykrywania polinukleotydu według wynalazku obejmujący przedział zawierający sondę, która hybrydyzuje w ostrych warunkach tworząc dupleks z przynajmniej 17 sąsiadującymi nukleotydami polinukleotydu według wynalazku. Korzystnie, sonda jest znakowana w sposób wykrywalny. Następnie przedmiotem wynalazku jest związek wiążący, który obejmuje miejsce wiążące przeciwciała, które swoiście wiąże się z: a) przynajmniej 17 sąsiadującymi aminokwasami z Id. Sekw. nr 2; b) przynajmniej 17 sąsiadującymi aminokwasami z Id. Sekw. nr 4; albo c) przynajmniej 17 sąsiadującymi aminokwasami z Id. Sekw. nr 5. Korzystnie miejsce wiążące przeciwciała jest: i) swoiście immunoreaktywne z polipeptydem o Id. Sekw. nr 2; ii) swoiście immunoreaktywne z polipeptydem o Id. Sekw. nr 4; iii) swoiście immunoreaktywne z polipeptydem o Id. Sekw. Nr 5; iv) wywołane przeciwko oczyszczonemu albo wytworzonemu rekombinacyjne białku ludzkiej IL-B30; v) wywołane przeciwko oczyszczonemu albo wytworzonemu rekombinacyjne białku mysiej IL-B30; vi) w przeciwciele monoklonalnym, Fab albo F(ab)2; lub związek wiążący jest: i) cząsteczką przeciwciała; ii) poliklonalną surowicą odpornościową; iii) znakowany w sposób wykrywalny; iv) sterylny; lub v) w kompozycji buforowanej. Przedmiotem wynalazku jest też sposób zastosowania związku wiążącego według wynalazku, który obejmuje kontaktowanie związku wiążącego z próbką biologiczną zawierającą antygen, przy czym kontaktowanie powoduje wytworzenie kompleksu związku wiążącego i antygenu. Korzystnie próbka biologiczna pochodzi od człowieka, a związek wiążący jest przeciwciałem. Wynalazek dotyczy też zestawu do wykrywania, który obejmuje związek wiążący według, oraz: a) materiały instruujące o stosowaniu związku wiążącego w celu wykrywania; lub b) przedział zapewniający oddzielenie związku wiążącego. Przedmiotem wynalazku jest także zasadniczo czysty albo izolowany polipeptyd antygenowy, który wiąże się z kompozycją wiążącą według wynalazku i ponadto obejmuje: a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów z Id. Sekw. nr 2; b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów z Id. Sekw. nr 4; albo c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów Id. Sekw. nr 5. Korzystnie polipeptyd według wynalazku a) obejmuje przynajmniej fragment o co najmniej 25 sąsiadujących resztach aminokwasowych z białka IL-B30 naczelnych; b) obejmuje przynajmniej fragment o co najmniej 25 sąsiadujących resztach aminokwasowych z białka IL-B30 gryzoni; c) jest rozpuszczalnym polipeptydem; d) jest znakowany w sposób wykrywalny; e) jest w sterylnej kompozycji; f) jest w buforowanej kompozycji; g) wiąże się z receptorem powierzchniowym komórki; h) jest wytworzony rekombinacyjnie; lub i) ma sekwencję polipeptydu występującego naturalnie. Korzystniej polipeptyd według wynalazku obejmuje: a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów z Id. Sekw. nr 2; b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów Id. Sekw. nr 4; lub c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów Id. Sekw. nr 5.

6 6 PL B1 Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polipeptyd, obejmujący reszty z Id. Sekw. nr 2 oraz izolowany polipeptyd obejmujący reszty z Id. Sekw. nr 4. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo komórek hodowli tkankowej obejmujący kontaktowanie komórki z agonistą albo antagonistą IL-B30 ssaków. Korzystnie w sposobie tym: a) kontaktowanie przebiega w kombinacji z agonistą albo antagonistą G-CSF i/lub IL-6; albo b) kontaktowanie następuje z antagonistą, w tym z kompozycją wiążącą obejmującą miejsce wiążące przeciwciała, które swoiście wiąże się z IL-B30. Również korzystnie sposób według wynalazku obejmuje kontaktowanie komórki z antagonistą IL-B30 albo kontaktowanie komórki z agonistą IL-B30. Wynalazek dotyczy również rekombinowanego przeciwciała albo jego fragmentu wiążącego antygen, które wiążą się z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2. Korzystnie fragment wiążący antygen według wynalazku jest wybrany spośród fragmentu Fab i fragmentu Fab2. Przedmiotem wynalazku jest ponadto rekombinowane przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen wiążące się z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 4. Ponadto wynalazek dotyczy sterylnej kompozycji obejmującej rekombinowane przeciwciało albo fragment wiążący antygen według wynalazku. Szczegółowy opis korzystnych postaci wykonania I. Ogólnie Opisane zostały niniejszym sekwencje aminokwasowe i sekwencje DNA kodujące różne białka ssaków, które są cytokinami, np. które są cząsteczkami wydzielniczymi, które pośredniczą w przekazaniu sygnału pomiędzy komórkami odpornościowymi albo innymi komórkami. Patrz, Paul (1994) Fundamental Immunology (wyd. 3) Raven Press, NY. Cytokiny pełnej długości i fragmenty albo antagoniści przydatni są w fizjologicznym modulowaniu komórek wyrażających receptor. Możliwe jest, że IL-B30 wywiera efekt hamujący albo pobudzający na komórki krwiotwórcze, w tym, np. komórki limfoidalne, takie jak limfocyty T, limfocyty B, naturalne komórki niszczące (NK), makrofagi, komórki dendrytyczne, progenitorowe komórki krwiotworzenia itp. Białka będą również przydatne jako antygeny, np. immunogeny, do wywoływania przeciwciał przeciwko różnym epitopom na białku, zarówno epitopom liniowym jak i konformacyjnym. cdna kodujący IL-B30 zidentyfikowano w ludzkiej linii komórkowej. Cząsteczkę oznaczono hu- IL-B30. Zidentyfikowano również pokrewny gen kodujący sekwencję świńską. Opisano również sekwencję, np. mysią. Ludzki gen koduje niewielką, rozpuszczalną cząsteczkę białka przypominającego cytokinę, wielkości około 168 aminokwasów. Sekwencja sygnałowa wynosi prawdopodobnie 21 reszt i zaczyna się od Met do około Ala. Patrz, Tabela 1 i Id. Sekw. nr 1 i 2. IL-B30 wykazuje motywy strukturalne charakterystyczne dla członków rodziny cytokin o długim łańcuchu. Patrz, np. IL-B30, G-CSF i IL-6, sekwencje dostępne z GenBank. Patrz, Tabela 2.

7 PL B1 7 T a b e l a 1: Kwas nukleinowy (Id. Sekw. Nr 1) kodujący IL-B30 naczelnych, np. człowieka. Sekwencja aminokwasowa po translacji Id. Sekw. Nr 2.

8 8 PL B1 sekwencja kodująca: IL-B30 gryzonia, np. myszy (Id. Sekw. nr 3 i 4):

9 PL B1 9 T a b e l a 2: Porównanie różnych postaci wykonania IL-6 i G-CSF względem IL-B30. Ludzką IL-B30 jest Id. Sekw. nr 2; mysią IL-B30 jest Id. Sekw. nr 4; świńską IL-B30 jest Id. Sekw. nr 5; bydlęcym G-CSF jest Id. Sekw. nr 6; kocim G-CSF jest Id. Sekw. nr 7; ludzkim G-CSF jest Id. Sekw. nr 8; mysim G-CSF jest Id. Sekw. nr 9; IL-6 wydry jest Id. Sekw. nr 10; kocią IL-6 jest Id. Sekw. nr 11; ludzką IL-6 jest Id. Sekw. nr 12; IL-6 owcy jest Id. Sekw. nr 13; mysią IL-6 jest Id. Sekw. nr 14; kurzym MGF jest Id. Sekw. nr 15; i wirusową IL-6 KSHV, wirusa herpes mięsaka Kaposiego jest Id. Sekw. nr 16.

10 10 PL B1 Homologia strukturalna IL-B30 z pokrewnymi białkami cytokin sugeruje pokrewne funkcje tej cząsteczki. IL-B30 jest cytokiną o długim łańcuchu wykazująca podobieństwo sekwencji z IL-6 i G-CSF. Agonista IL-B30, albo antagonista, może również działać jako antagonista funkcjonalny albo antagonista receptora, który np. blokuje wiązanie IL-6 albo G-SCF z ich receptorami albo pośredniczy w odwrotnym działaniu. Tak więc, IL-B30 albo jej antagoniści może być przydatna w leczeniu nieprawidłowych stanów, w tym zaburzeń odporności, np. niedoborów limfocytów T, przewlekłych stanów zapalnych albo odrzucania tkanek, albo w chorobach kardiologicznych i neurofizjologicznych. Naturalne antygeny są zdolne do pośredniczenia w różnych reakcjach biochemicznych, które prowadzą do reakcji biologicznych albo fizjologicznych komórek docelowych. Niniejszym scharakteryzowano rozwiązania w odniesieniu do człowieka, ale w naturze istnieją odpowiedniki u innych naczelnych albo innych gatunków. Dodatkowe sekwencje białek innych gatunków ssaków powinny być również dostępne, np. naczelnych, psowatych, kotowatych i gryzoni. Patrz niżej. Poniższy opis dotyczy ludzkiej IL-B30, ale może być zastosowany w pokrewnych postaciach wykonania dla innych gatunków. II. Oczyszczona IL-B30 Sekwencja aminokwasowa ludzkiej IL-B30 jest przedstawiona jako Id. Sekw. nr 2. Naturalnie występujące kwasy nukleinowe, które kodują białko można izolować standardowymi procedurami stosując dostarczone sekwencje, np. techniką PCR albo przez hybrydyzację. Te sekwencje aminokwasowe, od końca aminowego do karboksylowego, są istotne w dostarczaniu informacji o sekwencji dla cytokin umożliwiając rozróżnienie antygenu białkowego od innych białek oraz egzemplifikując liczne warianty. Ponadto, sekwencje peptydowe umożliwiają wytworzenie peptydów w celu wytworzenia przeciwciał, które rozpoznają takie segmenty, zaś sekwencje nukleotydowe umożliwiają wytworzenie sond oligonukleotydowych, co stanowi strategie wykrywania albo izolacji, np. klonowania genów kodujących takie sekwencje. W znaczeniu tu zastosowanym, określenie ludzka rozpuszczalna IL-B30, kiedy stosowana w kontekście białek, powinna obejmować białko o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej rozpuszczalnemu polipeptydowi o Id. Sekw. nr 2, albo jego istotnym fragmentom. Korzystne wykonania obejmują wiele różnych, np. nie nakładających się, segmentów o konkretnej długości. Zwykle, wiele oznacza przynajmniej dwa, częściej przynajmniej trzy, zaś najczęściej 5, 7 albo jeszcze więcej. Pod-

11 PL B1 11 czas gdy podana jest minimalna długość, odpowiedniejsza może być sekwencja dłuższa, różnej długości np. jedna długości 7, zaś druga długości 12. Składniki wiążące, np. przeciwciała, zwykle wiążą IL-B30 z wysokim powinowactwem, np. przynajmniej około 100 nm, zwykle lepszym niż około 30 nm, korzystnie lepszym niż około 10 nm, zaś najkorzystniej lepszym niż około 3 nm. Białkowe odpowiedniki spotykane są u gatunków ssaków innych niż człowiek, np. innych naczelnych, kopytnych albo gryzoni. Gatunki inne niż ssaki powinny również posiadać geny i białka pokrewne strukturalnie albo funkcjonalnie, np. ptaki albo płazy. Określenie polipeptyd w znaczeniu tu zastosowanym obejmuje istotny fragment albo segment, i obejmuje ciąg reszt aminokwasowych długości przynajmniej 8 aminokwasów, zasadniczo przynajmniej około 12 aminokwasów, zwykle przynajmniej około 16 aminokwasów, korzystnie przynajmniej około 20 aminokwasów, zaś w szczególnie korzystnych wykonaniach przynajmniej około 30 aminokwasów albo więcej, np. 35, 40, 45, 50, itp. Fragmenty takie mogą mieć końce w zasadniczo każdej pozycji, np. mogą rozpoczynać się resztą 1, 2, 3 itp. i kończyć się np. w pozycji 150, 149, 148 itp., we wszystkich praktycznie kombinacjach. Szczególnie interesujące są polipeptydy, których końce odpowiadają granicom domen strukturalnych, np. helis A, B, C i/lub D. Patrz, Tabela 1. Określenie kompozycja wiążąca w znaczeniu tu zastosowanym dotyczy cząsteczek, które wiążą swoiście IL-B30, np. w oddziaływaniu typu antygen-przeciwciało. Swoistość może być mniej lub bardziej specyficzna, np. swoista dla konkretnego wykonania albo do grupy pokrewnych wykonań np. naczelnych, gryzoni itp. Obejmuje również związki, np. białka, które swoiście wiążą się z IL-B30, w tym przez naturalnie istotne fizjologicznie oddziaływania białko-białko, kowalencyjne i niekowalencyjne. Cząsteczką może być polimer, albo reagent chemiczny. Analog funkcjonalny może być białkiem z modyfikacjami strukturalnymi albo może być cząsteczką, które posiada kształt molekularny oddziałujący z odpowiednimi determinantami wiązania. Związki mogą służyć jako agoniści albo antagoniści wiązania receptora, patrz, np. Goodman i in., (red.) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (wyd. współczesne), Pergamon Press. Zasadniczo czyste, np. w kontekście białek, oznacza zwykle, że białko jest wolne od innych zanieczyszczających białek, kwasów nukleinowych albo innych składników biologicznych pochodzących z organizmu będącego źródłem. Czystość można ocenić standardowymi sposobami, zwykle ciężarem, i zazwyczaj powinna ona wynosić przynajmniej około 40%, ogólnie przynajmniej około 50%, często przynajmniej około 60%, zwykle przynajmniej około 80%, korzystnie przynajmniej około 90%, zaś w najkorzystniejszych wykonaniach przynajmniej około 95%. Zwykle dodaje się również nośniki albo zaróbki. Rozpuszczalność polipeptydu albo fragmentu zależy od środowiska i polipeptydu. Wiele parametrów wpływa na rozpuszczalność białek, w tym temperatura, środowisko elektrolitowe, wielkość i charakterystyka molekularna polipeptydu oraz rodzaj rozpuszczalnika. Zwykle, temperatury przy których stosuje się polipeptyd zawierają się w zakresie od około 4 C do około 65 C. Zwykle temperatura stosowania jest wyższa niż około 18 C. Dla celów diagnostycznych, temperatura będzie wynosić około temperatury pokojowej albo cieplejsza, ale niższa niż temperatura denaturacji składników testu. Dla celów terapeutycznych temperatura będzie zwykle temperaturą ciała, zwykle około 37 C dla ludzi i myszy, jednakże w pewnych konkretnych sytuacjach temperatura może być podwyższona albo obniżona in situ albo in vitro. Wielkość i struktura polipeptydu powinna zasadniczo być w stanie stabilnym i zwykle nie w stanie denaturacji. Polipeptyd może być połączony z innymi polipeptydami w struktury czwartorzędowe, np. w celu zapewnienia rozpuszczalności albo połączony z lipidami albo detergentami. Rozpuszczalnik i elektrolity zwykle będą w buforze zgodnym biologicznie, i zbliżać się będą do wodnego środowiska fizjologicznego. Zwykle, rozpuszczalnik będzie miał ph obojętne, zwykle od około 5 do 10, zaś korzystnie około 7,5. W niektórych przypadkach można dodać jeden albo wiele detergentów, zwykle łagodnie denaturujących, np. CHS (hemibursztynian cholesterylu) albo CHAPS (sulfonian (3-[3-cholamidopropylo]-dimetyloamonio)-1-propanu) albo w stężeniu na tyle niskim, że unika się istotnego zniszczenia właściwości strukturalnych albo fizjologicznych białka. W innych warunkach, można zastosować silny detergent w celu wywołania istotnej denaturacji. III. Warianty fizyczne Wynalazek obejmuje również białka albo peptydy o zasadniczej identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową antygenu IL-B30. Odmiany obejmują odmiany gatunkowe, polimorficzne i alleliczne.

12 12 PL B1 Homologia sekwencji aminokwasowej albo identyczność sekwencji określa się przez optymalizację przyporządkowania reszt, jeżeli to konieczne wprowadzając przerwy. Patrz, również Needlham i in., (1970) J. Mol. Biol. 48: ; Sankoff i in., (1983) Rozdział Pierwszy w Time Warps, String Edits and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; i pakiety oprogramowania z IntelliGenetics, Mountain View, CA; i University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madisom, WI. Identyczność sekwencji ulega zmianie przy uwzględnieniu zastąpień konserwatywnych jako dopasowań. Zastąpienia konserwatywne zwykle obejmują zastąpienia w następujących grupach: glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; oraz fenyloalanina, tyrozyna. Zakonserwowanie może dotyczyć cech biologicznych, funkcjonalnych albo strukturalnych. Homologiczne sekwencje aminokwasowe zwykle obejmują naturalne odmiany polimorficzne albo alleliczne oraz międzygatunkowe odmiany sekwencji białka. Typowe homologiczne białka albo peptydy mają od % identyczności (jeżeli wprowadzone są przerwy) do % identyczności (jeżeli włączone są zastąpienia konserwatywne) z sekwencją aminokwasową IL-B30. Identyczność wynosić powinna przynajmniej około 35%, ogólnie przynajmniej około 40%, często przynajmniej około 50%, zwykle przynajmniej około 60%, zazwyczaj przynajmniej około 70%; korzystnie przynajmniej około 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej około 90%. Izolowany DNA IL-B30 można łatwo modyfikować przez zastępowanie nukleotydów, delecje nukleotydów, insercje i inwersje krótkich ciągów nukleotydowych. Modyfikacje te powinny spowodować powstanie nowych sekwencji DNA, które kodują te antygeny, ich pochodne albo białka o podobnej aktywności fizjologicznej, immunogennej, antygenowej albo innej aktywności funkcjonalnej. Modyfikowane sekwencje można zastosować do wytworzenia zmutowanych antygenów albo w celu zwiększenia ekspresji. Zwiększona ekspresja może obejmować amplifikację genu, wzrost transkrypcji, zwiększoną translację albo inne mechanizmy. Określenie zmutowana IL-B30 obejmuje polipeptyd podpadający pod definicję identyczności sekwencji IL-B30 jak podana wyżej, ale posiadający sekwencję aminokwasową, która się różni od IL-B30 normalnie spotykanej w naturze, czy to z powodu delecji, zastąpienia albo insercji. Obejmuje to ogólnie białka o istotnej identyczności z białkiem o Id. Sekw. nr 2, i posiadające wspólne z nim różne aktywności biologiczne, np. antygenowość albo immunogennosc, zaś w korzystnych wykonaniach zawiera większość ujawnionej naturalnej sekwencji pełnej długości. Sekwencje pełnej długości są zwykle korzystne, jakkolwiek wersje okrojone są również przydatne, podobnie, najbardziej pożądane są geny i białka spotykane w naturze. Podobne pojęcie dotyczy różnych białek IL-B30, szczególnie tych spotykanych u różnych zwierząt ciepłokrwistych, np. ssaków albo ptaków. Opisy te generalnie dotyczą wszystkich białek IL-B30 i nie ograniczają się do omówionego tu konkretnego przykładu naczelnych. Mutagenezę IL-B30 można również przeprowadzić przez wytworzenie insercji albo delecji aminokwasowej. W celu osiągnięcia końcowego konstruktu można przeprowadzić zastąpienia, delecje, insercje albo dowolną ich kombinację. Insercje obejmują fuzje na końcu aminowym albo karboksylowym. W docelowym kodonie można przeprowadzić losową mutagenezę, zaś wyrażonego mutanta można badać przesiewowe w kierunku pożądanej aktywności. Sposoby wytwarzania mutacji zastąpieniem w określonym miejscu DNA o znanej sekwencji są dobrze znane w stanie techniki, np. mutageneza starterem M13 albo technika mutagenezy reakcją łańcuchową polimerazy (PCR). Patrz, Sambrook i in., (1989); Ausubel i in., (1987 i suplementy); oraz Kunkel i in., (1987) Met. Enzymol. 154: Korzystne wykonania obejmują np. pojedyncze, podwójne, trzykrotne, pięciokrotne, siedmiokrotne itp., korzystnie konserwatywne zastąpienie na poziomie nukleotydowym albo aminokwasowym. Korzystnie, zastąpienia będą omijały konserwowane cysteiny i często będą w miejscach odległych od strukturalnych domen helikalnych. Odmiany takie mogą być przydatne do wytworzenia swoistych przeciwciał i często będą miały wspólnych wiele albo wszystkie właściwości biologiczne. Niniejszym opisane zostały również białka rekombinowane, np. heterologiczne białka fuzyjne, wykorzystujące segmenty tych białek. Heterologiczne białko fuzyjne jest fuzją białek albo segmentów, które w naturze nie są połączone w ten sposób. Podobna koncepcja dotyczy sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego. Oprócz tego, nowe konstrukty można wytworzyć przez połączenia podobnych funkcjonalnie domen z innych białek. Przykładowo, segmenty wiążące cel albo inne można wymienić pomiędzy różnymi nowymi polipeptami albo fragmentami fuzyjnymi. Patrz, Cunningham i in., (1989) Science 243: ; O'Dowd i in., (1988) J. Biol. Chem. 263:

13 PL B1 13 Metoda amidynofosforanowa, opisana przez Beaucage i Carruthers (1981) Tetra. Lett. 22: , powinna wytworzyć odpowiednie syntetyczne fragmenty DNA. Dwuniciowy fragment można często otrzymać przez syntezę komplementarnej nici i połączenie ich ze sobą w odpowiednich warunkach albo przez dodanie komplementarnej nici przy użyciu polimerazy DNA z odpowiednią sekwencją startera, np. techniką PCR. Analizę strukturalną można zastosować wobec genu, porównując z rodziną cytokin IL-6. Rodzina ta obejmuje, np. IL-6, IL-11, IL-12, G-CSF, LIF, OSM, CNTF i Ob. Przyrównanie sekwencji IL-B30 człowieka, świni i myszy z innymi członkami rodziny IL-6 powinno umożliwić określenie cech strukturalnych. W szczególności, arkusza-β i helisy-α można określić stosując np. program RASMOL, patrz, Bazan i in., (1996) Nature 379: 591; Lodi i in., (1994) Science 263: ; Sayle i Milner-White (1995) TIBS 20: i Gronenberg i in., (1991) Protein Engineering 4: Korzystne reszty dla zastąpień obejmują reszty eksponowane na powierzchnię, które powinny oddziaływać z receptorem. Inne reszty, które powinny zachowywać funkcję powinny być zastąpieniami konserwatywnymi, szczególnie w położeniu odległym od reszt eksponowanych na powierzchnię. IV. Odmiany funkcjonalne Blokowanie reakcji fizjologicznej IL-B30 może wyniknąć z kompetycyjnego zahamowania wiązania liganda z receptorem. Testy in vitro według wynalazku powinny wykorzystywać izolowane białko, rozpuszczalne fragmenty obejmujące segmenty wiążące receptor tych białek albo fragmenty przyłączone do podłoża stałego. Testy te powinny również umożliwić diagnozowanie wpływu mutacji oraz modyfikacji w segmencie wiążącym, albo mutacji i modyfikacji cytokiny np. analogów IL-B30. Wynalazek uwzględnia również zastosowanie kompetycyjnych testów w badaniu przesiewowym leków, np. gdzie przeciwciała neutralizujące przeciwko cytokinie albo fragmenty wiążące receptor współzawodniczą z badanym związkiem. Pochodne antygenów IL-B30 obejmują mutanty sekwencji aminokwasowej postaci występujących w naturze, odmiany glikozylacji i kowalencyjne albo agregacyjne koniugaty z innymi resztami chemicznymi. Pochodne kowalencyjne można wytworzyć przez połączenie grup funkcyjnych z grupami spotykanymi w łańcuchach bocznych aminokwasów IL-B30 albo na końcu C albo N, np. standardowymi metodami. Patrz, Lundblad i Noyes (1988) Chemical Reagents for Protein Modyfication, tom 1-2, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Hugli (wyd. 1989), San Diego, CA; i Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Boca Raton, FL. W szczególności, dotyczy to zmian glikozylacji, np. wytworzonych przez modyfikowanie wzorca glikozylacji polipeptydu podczas syntezy i przetwarzania, albo dalszych etapów przetwarzania. Patrz, np. Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56: Objęte są również odmiany peptydów, o tej samej sekwencji pierwszorzędowej, które mają niewielkie modyfikacje, w tym fosforylowane reszty aminokwasowe, np. fosfotyrozyna, fosfoseryna albo fosfotreonina. Dostarczone są również polipeptydy fuzyjne pomiędzy IL-B30 i innymi białkami homologicznymi i heterologicznymi. Wiele receptorów cytokin albo innych białek powierzchniowych stanowią białka multimeryczne, np. jednostki homodimeryczne, stąd wielokrotne konstrukty mogą posiadać szereg zalet, w tym mniejszą podatność na cięcie proteolityczne. Typowymi przykładami są fuzje polipeptydów reporterowych, np. lucyferazy, z segmentem albo domeną białka, np. segmentem wiążącym receptor, tak że obecność albo położenie ligandu fuzyjnego można łatwo określić. Patrz, np. Dull i in., patent USA 4,859,609. Inne składniki fuzji genów obejmują bakteryjną β-galaktozydazę, trpe, białko A, β-laktamazę, alfa-amylazę, dehydrogenazę alkoholową, czynnik alfa drożdży i znaczniki wykrywania i oczyszczania takie jak sekwencja FLAG sekwencji His6. Patrz, np. Godowski i in., (1988) Science 241: Peptydy fuzyjne zwykle wytwarza się metodami rekombinacji kwasu nukleinowego albo metodami syntezy polipeptydów. Techniki manipulacji kwasem nukleinowym i ekspresji opisano ogólnie np. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 i Ausubel i in., (wyd. 1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Willey, NY. Techniki syntezy peptydów opisane są np. Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: ; Merrifield (1986) Science 232: ; Atherton i in., (1989), IRL Press, Oxford; oraz Grant (1992) Synthetic Peptides: A User Guide, Freeman, NY. Metody fałdowania można zastosować wobec białek syntetycznych. Wynalazek uwzględnia również zastosowanie pochodnych białek IL-B30 innych niż odmiany sekwencji aminokwasowej czy glikozylacji. Pochodne takie mogą obejmować kowalencyjne albo agregacyjne połączenie z resztami chemicznymi albo nośnikami białkowymi. Pochodne kowalencyjne

14 14 PL B1 albo agregacyjne mogą być przydatne jako immunogeny, jako reagenty do testów immunologicznych, w metodach oczyszczania takich jako oczyszczanie przez powinowactwo ze składnikiem wiązania np. innym antygenem. IL-B30 można unieruchamiać przez kowalencyjne związanie z podłożem stałym, takim jak Sepharose aktywowana bromkiem cyjanu, które to sposoby są dobrze znane w dziedzinie, albo przez adsorpcję na powierzchniach poliolefinowych, z sieciowaniem glutaraldehydem albo bez, do zastosowania w teście albo w oczyszczaniu przeciwciał anty-il-b30 albo w alternatywnych kompozycjach wiążących. Białka IL-B30 można również znakować w sposób wykrywalny, np. do zastosowania w testach diagnostycznych. Oczyszczanie IL-B30 można przeprowadzić przy użyciu unieruchomionych przeciwciał albo komplementarnych składników wiązania, np. części wiążącej receptora. Rozpuszczalną IL-B30 albo fragment według wynalazku można zastosować jako immunogen do wytwarzania surowic odpornościowych albo swoistych przeciwciał. Oczyszczony antygen można zastosować do przesiewania przeciwciał albo fragmentów wiążących antygen, w tym fragmentów wiążących antygen przeciwciał naturalnych, np. Fab, Fab', F(ab') 2, itp. Oczyszczone antygeny można również zastosować jako reagent do wykrywania przeciwciał wytworzonych w reakcji na obecność podwyższonych poziomów cytokin, co może być diagnostyczne dla nieprawidłowych albo specyficznych stanów fizjologicznych albo chorobowych. Wynalazek uwzględnia przeciwciała wytworzone przeciwko sekwencjom aminokwasowym kodowanym przez sekwencję nukleotydową pokazaną jako Id. Sekw. nr 1, albo białkom zawierającym ich fragmenty. W szczególności, wynalazek uwzględnia przeciwciała o powinowactwie wiązania z albo wywołane przeciwko konkretnym domenom, np. helisom A, B, C albo D. Wynalazek uwzględnia izolowanie dodatkowych odmian z gatunków blisko spokrewnionych. Analizę Southern'a i Northern umożliwi ustalenie, czy istnieją podobne jednostki genetyczne u innych ssaków. Prawdopodobnie, IL-B30 jest szeroko rozpowszechniona jako odmiany gatunkowe, np. gryzoni, lagomorpha, carnivora, artiodactyla, perissodactyla i naczelnych. Wynalazek dostarcza również sposobów izolowania grupy pokrewnych antygenów wykazujących różnice i podobieństwa struktury, ekspresji i funkcji. Wyjaśnienie wielu działań fizjologicznych cząsteczek byłoby znacznie przyspieszone przez wyizolowanie i charakteryzację dodatkowych odmian gatunkowych albo polimorficznych. W szczególności, wynalazek dostarcza przydatnych sond do identyfikacji dodatkowych homologicznych jednostek genetycznych u różnych gatunków. Izolowane geny umożliwiają transformację komórek pozbawionych ekspresji IL-B30, np. rodzajów komórek albo komórek, które nie posiadają odpowiednich białek i wykazują negatywną aktywność spoczynkową. Powinno to umożliwić analizę funkcji IL-B30 w porównaniu z nietransformowanymi komórkami kontrolnymi. Określenie kluczowych elementów strukturalnych, które wywołują różne funkcje fizjologiczne za pośrednictwem tych antygenów możliwe jest przy użyciu standardowych technik nowoczesnej biologii molekularnej opisanych w Cunningham i in., (1989) Science, 243: ; oraz podejścia zastosowane w O'Dowd i in., (1988) J. Biol. Chem. 263: i Lechleiter i in., (1990) EMBO J. 9: Międzykomórkowa sygnalizacja obejmuje prawdopodobnie sygnalizację przez receptor. Jednakże, w pewnych warunkach może następować internalizacja białek i oddziaływanie pomiędzy składnikami wewnątrzkomórkowymi i cytokiną. Swoiste segmenty oddziaływania IL-B30 ze składnikami oddziaływania można zidentyfikować przez mutagenezę albo bezpośrednio metodami biochemicznymi, np. przez sieciowanie albo powinowactwo. Analiza strukturalna metodami krystalograficznymi albo innymi metodami fizycznymi powinna być również możliwa do zastosowania. Dalsze badania mechanizmu przekazywania sygnału powinny obejmować badanie towarzyszących składników, które można wyizolować metodami powinowactwa albo metodami genetycznymi, np. metodą komplementacji mutantów. Przewiduje się dalsze badania ekspresji i kontroli IL-B30. Elementy kontrolujące związane z antygenami powinny wykazywać różnicowy wzorzec fizjologiczny, rozwojowy, tkankowo-specyficzny albo ekspresyjny. Interesujące są elementy kontrolne powyżej i poniżej genu. Badania strukturalne antygenów IL-B30 powinny dostarczyć nowych antygenów, szczególnie analogów wykazujących właściwości agonistyczne albo antagonistyczne wobec cząsteczki. Można to połączyć z uprzednio opisanymi metodami izolowania antygenów wykazujących pożądane spektra aktywności.

15 PL B1 15 V. Przeciwciała Przeciwciała można wytworzyć przeciwko różnym epitopom białek IL-B30, w tym odmianom gatunkowym, polimorficznym albo allelicznym oraz ich fragmentom, w ich postaci naturalnej, jak i rekombinowanej. Oprócz tego, przeciwciała można wywołać przeciwko IL-B30 w postaci aktywnej albo postaci nieaktywnej, w tym natywnej albo denaturowanej. Uwzględniane są również przeciwciała antyidiotypowe. Przeciwciała, w tym fragmenty wiążące i jednołańcuchowe, przeciwko określonym fragmentom antygenów można wytworzyć przez immunizowanie zwierząt koniugatami fragmentów z białkami immunogennymi. Przeciwciała monoklonalne izoluje się z komórek wytwarzających pożądane przeciwciała. Przeciwciała te można badać przesiewowo w kierunku wiązania z normalnymi albo defektywnymi IL-B30, albo badać przesiewowo w kierunku aktywności agonistycznej albo antagonistycznej, np. za pośrednictwem receptora. Przeciwciała mogą być agonistyczne albo antagonistyczne, np. przez steryczne blokowanie wiązania z receptorem. Takie przeciwciała monoklonalne wiążą się zwykle z K D równą przynajmniej około 1 mm, zwykle przynajmniej około 30 μm, korzystnie przynajmniej około 10 μm, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej około 3 μm albo lepiej. Przeciwciała według wynalazku mogą być również przydatne w zastosowaniach diagnostycznych. Jako przeciwciała wychwytujące albo nie neutralizujące, można je badać przesiewowo w kierunku zdolności do wiązania z antygenami bez hamowania wiązania z receptorem. Jako przeciwciała neutralizujące, mogą być przydatne w kompetycyjnych testach wiązania. Będą również przydatne w wykrywaniu albo ocenie ilościowej białka IL-B30 albo jej receptora. Patrz, np. Chan (wyd. 1987) Immunology: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FL; Price i Newman (wyd. 1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, NY; i Ngo (wyd. 1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, NY. Absorpcja krzyżowa i inne testy powinny zidentyfikować przeciwciała, które wykazują różne spektra swoistości, np. unikalne albo wspólne swoistości gatunkowe. Dalej, przeciwciała, w tym fragmenty wiążące antygen według wynalazku mogą być silnymi antagonistami, którzy wiążą antygen i hamują wiązanie funkcjonalne, np. z receptorem, który może wywoływać reakcję biologiczną. Mogą być również przydatne jako przeciwciała nie neutralizujące i można je sprzęgać z toksynami albo izotopami radioaktywnymi w taki sposób, że po związaniu się z antygenem komórka, która go wyraża, np. na powierzchni, ulega zniszczeniu. Dalej, przeciwciała te można sprzęgać z lekami albo innymi środkami terapeutycznymi bezpośrednio albo pośrednio przy użyciu łącznika i można uzyskać w ten sposób kierowanie leku. Fragmenty antygenu można łączyć z innymi substancjami, szczególnie polipeptydami, jako polipeptydy fuzyjne albo połączone kowalencyjne do stosowania jako immunogeny. Antygen i jego fragmenty można poddać fuzji albo połączyć kowalencyjnie z różnymi immunogenami, jak np. hemocyjanina skałoczepa, albumina surowicy bydlęcej, anatoksyna tężcowa itp. Patrz, Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, NY; Williams i in., (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, tom 1, Academic Press, NY; Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, SCH Press, NY, zawierające opis sposobów wytwarzania surowic poliklonalnych. W niektórych przypadkach, pożądane jest wytworzenie przeciwciał monoklonalnych z różnych gatunków ssaków, takich jak myszy, gryzonie, naczelne, ludzie itp. Opis technik wytwarzania takich przeciwciał można znaleźć w np. Stites i in., (wyd.) Basic and Clinical Immunology (wyd. 4), Lange Medical Publications, Los Altos, CA i cytowane tam odnośniki; Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, SCH Press, NY; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (wyd. 2), Academic Press, NY; zaś w szczególności Kohler i Milstein (1975) Nature 256: , gdzie znajduje się opis jednego ze sposobów wytwarzania przeciwciał monoklonalnych. Inne odpowiednie techniki obejmują ekspozycję limfocytów in vitro na polipeptydy antygenowe albo alternatywnie, wybór biblioteki przeciwciał w fagu albo podobnym wektorze. Patrz, Huse i in., (1989) Science 246: ; i Ward i in., (1989) Nature 341: Polipeptydy i przeciwciała według wynalazku można zastosować z modyfikacjami albo bez, w tym przeciwciała chimeryczne albo humanizowane. Często, polipeptydy i przeciwciała będą znakowane przez przyłączenie, kowalencyjne albo nie kowalencyjne, substratu, który zapewnia wykrywalny sygnał. Różne znaczniki i techniki koniugacji są znane i opisywane w literaturze naukowej i patentowej. Odpowiednie znaczniki obejmują izotopy promieniotwórcze, enzymy, substraty, kofaktory, inhibitory, reszty fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne itp. Patenty opisujące takie znaczniki obejmują patenty USA 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241. Można również wy-

16 16 PL B1 tworzyć rekombinowane immunoglobuliny, patrz, Cabilly, patent USA 4,816,567; Moore i in., patent USA 4,642,334; Queen i in., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: Przeciwciała według wynalazku można również zastosować w celu chromatografii powinowactwa w izolowaniu białka. Można wytworzyć kolumny, w których przeciwciała połączone są z podłożem stałym. Patrz, Wilchek i in., (1984) Meth. Enzymol. 104: Przeciwciała wywołane przeciwko IL-B30 powinny być również przydatne do wywołania przeciwciał antyidiotypowych. Będą one przydatne do wykrywania i diagnozowania różnych stanów immunologicznych związanych z ekspresją odpowiednich antygenów. VI. Kwasy nukleinowe Opisane sekwencje peptydowe i pokrewne reagenty są przydatne do wykrywania, izolowania albo identyfikowania klonu DNA kodującego IL-B30, np. ze źródła naturalnego. Zwykle, powinno być to przydatne przy izolowaniu genu od ssaka, zaś podobne procedury stosuje się do izolowania genów z innych gatunków, np. zwierząt ciepłokrwistych, takich jak ptaki i ssaki. Hybrydyzacja krzyżowa powinna umożliwić izolowanie IL-B30 z tego samego gatunku, np. odmian polimorficznych, albo z innych gatunków. W celu pomyślnego wyizolowania odpowiedniego klonu kwasu nukleinowego dostępnych jest wiele podejść. Oczyszczone białko albo określone peptydy są przydatne do wytwarzania przeciwciał standardowymi sposobami, jak to opisano wyżej. Syntetyczne peptydy albo oczyszczone białka mogą być prezentowane układowi odpornościowemu w celu wywołania przeciwciał poliklonalnych albo monoklonalnych. Patrz, Coligan i in., (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; oraz Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, SCH Press. Przykładowo, swoiście wiążące kompozycje można zastosować do badania przesiewowego biblioteki ekspresyjnej wytworzonej z linii komórkowej, która wyraża IL-B30. Badanie przesiewowe ekspresji wewnątrzkomórkowej można przeprowadzić wieloma sposobami barwienia albo immunofluorescencji. Kompozycje wiążące można zastosować w celu oczyszczania przez powinowactwo albo sortowania komórek wyrażających fuzyjne białko powierzchniowe. Segmenty peptydowe można również zastosować w celu przewidywania odpowiednich oligonukleotydów do przesiewania biblioteki. Kod genetyczny można zastosować do selekcji odpowiednich oligonukleotydów przydatnych jako sondy do przesiewania. Patrz, np. Id. Sekw. nr 1. W kombinacji z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR), syntetyczne oligonukleotydy powinny być przydatne do selekcji prawidłowych klonów z biblioteki. Sekwencje komplementarne można również zastosować jako sondy, startery albo nici antysensowne. Różne fragmenty powinny być szczególnie przydatne, np. sprzęgnięte z wektorami kotwiczącymi albo techniki PCR z komplementarnymi poli-a albo z komplementarnymi DNA dla innych peptydów. Wynalazek uwzględnia zastosowanie izolowanego DNA albo fragmentów do kodowania biologicznie czynnych polipeptydów odpowiadających IL-B30, szczególnie pozbawionych części kodujących nie ulegające translacji końce 5' opisanej sekwencji. Oprócz tego, wynalazek obejmuje izolowane i rekombinowane DNA, które kodują biologicznie czynne białko albo polipeptyd i które są zdolne do hybrydyzacji w odpowiednich warunkach z opisanymi tu sekwencjami DNA. Takim biologicznie czynnym białkiem albo polipeptydem może być cały antygen, albo fragment, i może mieć sekwencję pokazaną jako np. Id. Sekw. nr 2, szczególnie dojrzały, wydzielany polipeptyd. Dalej, wynalazek obejmuje zastosowanie izolowanego albo rekombinowanego DNA, albo jego fragmentu, które kodują białka wykazujące silną identyczność z wydzielniczą IL-B30. Izolowany DNA może zawierać odpowiednie sekwencje regulatorowe na końcach 5' i 3', np. promotory, wzmacniacze, sygnały poliadenylacji i inne. Alternatywnie, ekspresję można przeprowadzić przez połączenie funkcjonalne segmentu kodującego z promotorem heterologicznym, np. przez wprowadzenie promotora powyżej endogennego genu. Izolowany kwas nukleinowy oznacza kwas nukleinowy, np. RNA, DNA albo mieszany polimer, który jest zasadniczo oddzielony od innych składników, które naturalnie towarzyszą natywnej sekwencji, np. rybosomy, polimerazy i/lub flankujące sekwencje genomowe z gatunków pochodzenia. Określenie obejmuje sekwencje kwasu nukleinowego, które pobrano ze środowiska naturalnego i obejmują rekombinowane albo klonowane izolaty DNA oraz chemicznie syntetyzowane analogi albo analogi syntetyzowane biologicznie przez układy heterologiczne. Zasadniczo czysta cząsteczka obejmuje izolowane postaci cząsteczki. Ogólnie, kwas nukleinowy będzie w wektorze albo fragmencie wielkości mniejszej niż około 50 kb, zwykle mniej niż około 30 kb, zwykle mniej niż około 10 kb, zaś korzystnie mniej niż około 6 kb.

17 PL B1 17 Izolowany kwas nukleinowy będzie ogólnie homogenną kompozycją cząsteczek, ale w niektórych wykonaniach, zawierać może pewną heterogenność. Tą heterogenność spotyka się na końcach polimerów albo częściach, które nie są kluczowe dla pożądanego działania biologicznego albo aktywności. Rekombinowany kwas nukleinowy określony jest sposobem wytwarzania albo jego budową. W odniesieniu do sposobu wytwarzania, np. produkt wytworzony sposobem stosuje się sposoby rekombinacji kwasu nukleinowego, np. obejmujące interwencję człowieka w sekwencję nukleotydową, zwykle selekcję albo wytwarzanie. Alternatywnie, może to być kwas nukleinowy wytworzony z sekwencji obejmującej fuzję dwóch fragmentów, które nie są naturalnie styczne do siebie, ale z wyłączeniem produktów naturalnych, np. mutantów występujących naturalnie. Tak więc, np. dotyczy to produktów wytworzonych przez transformowanie komórek nienaturalnie występującym wektorem, podobnie jak kwasy nukleinowe obejmujące sekwencję otrzymaną przy użyciu dowolnego procesu z udziałem syntetycznego oligonukleotydu. Często przeprowadza się to przez zastąpienie kodonu nadmiarowym kodonem kodującym ten sam albo konserwatywny aminokwas, przy wprowadzeniu albo usunięciu sekwencji rozpoznającej. Alternatywnie, przeprowadza się to w celu połączenia ze sobą segmentów kwasu nukleinowego o pożądanej funkcji w celu wytworzenia pojedynczej jednostki genetycznej obejmującej pożądaną kombinację funkcji, nie spotykaną w dostępnej postaci naturalnej. Celem takich manipulacji są często miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne, ale inne miejsca np. promotory, miejsca replikacji DNA, sekwencje regulatorowe, kontrolne i inne mogą być również włączone. Podobny koncept dotyczy rekombinowanych, np. polipeptydów fuzyjnych. Konkretnie dotyczy to syntetycznych kwasów nukleinowych, które z powodu nadmiarowości kodu genetycznego, kodują polipeptydy podobne do fragmentów tych antygenów i fuzji tych sekwencji z różnych gatunków albo odmian polimorficznych. Istotny fragment w kontekście kwasu nukleinowego oznacza ciągły segment długości przynajmniej około 17 nukleotydów, ogólnie przynajmniej około 22 nukleotydów, zwykle przynajmniej około 29 nukleotydów, częściej przynajmniej około 35 nukleotydów, zwykle przynajmniej około 41 nukleotydów, zwykle przynajmniej około 47 nukleotydów, korzystnie przynajmniej około 55 nukleotydów, zaś w szczególnie korzystnych wykonaniach przynajmniej około 60 nukleotydów albo więcej, np. 67, 73, 81, 89, 95 itp. DNA który koduje białko IL-B30 powinien być szczególnie użyteczny do identyfikacji genów, mrna i cdna, które kodują pokrewne albo podobne białko, jak również DNA, które kodują białka homologiczne z innych gatunków. Będą to homologi innych gatunków, w tym naczelnych, gryzoni, psów, kotów i ptaków. Różne białka IL-B30 powinny być homologiczne z innymi gatunkami. Jednakże, nawet białka, które mają odleglejsze zależności ewolucyjne z antygenem można łatwo wyizolować w odpowiednich warunkach, stosując sekwencje jeżeli nie są odpowiednio homologiczne. Szczególnie interesujące są białka IL-B30 innych naczelnych. Rekombinowane klony z sekwencji genomowych, np. zawierające introny, powinny być przydatne do badań transgenicznych, w tym np. komórek transgenicznych i organizmów oraz do terapii genowej. Patrz, np. Goodnow (1992) Transgenic Animals, Roitt (wyd.) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, str ; Travis (1992) Science 256: ; Kuhn i in., (1991) Science 254: ; Capecchi 91989) Science 244: 1288; Robertson (1987) (wyd.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cels: A practical Approach, IRL Press, Oxford; oraz Rosenberg (1992) J. Clin. Oncol. 10: Zasadnicza homologia, np. identyczność, w kontekście porównania sekwencji kwasu nukleinowego oznacza, że segmenty albo ich komplementarne nici, przy porównaniu są identyczne przy optymalnym przyrównaniu, z odpowiednimi insercjami albo delecjami oligonukleotydów, w przynajmniej 50%, ogólnie przynajmniej około 58%, zwykle przynajmniej około 65%, często przynajmniej około 85%, korzystnie przynajmniej około 95 do 98% albo więcej. Alternatywnie, zasadnicza homologia występuje, gdy segmenty hybrydyzują w wybiórczych warunkach hybrydyzacji z nicią albo jej sekwencją komplementarną, z zastosowaniem sekwencji IL-B30, np. w Id. Sekw. nr 1. Zwykle, swoista hybrydyzacja powinna zajść gdy występuje przynajmniej około 55% identyczności na przestrzeni przynajmniej około 30 nukleotydów, korzystnie przynajmniej około 75% na przestrzeni około 25 nukleotydów, zaś najkorzystniej przynajmniej około 90% na przestrzeni około 20 nukleotydów. Patrz, Kanehisa (1984) Nucl. Acids Res. 12: Długość porównania identyczności jak opisano może być na przestrzeni dłuższego ciągu, zaś szczególne wykonania powinny obejmować ciąg przynajmniej około 17 nukle-

18 18 PL B1 otydów, zwykle przynajmniej około 28 nukleotydów, zwykle przynajmniej około 40 nukleotydów, zaś korzystnie przynajmniej około 75 do 100 albo więcej nukleotydów. Surowe warunki, w odniesieniu do homologii w kontekście hybrydyzacji, powinny być surowymi złożonymi warunkami stężenia soli, temperatury i rozpuszczalników organicznych oraz innych parametrów, zwykle kontrolowanych w reakcjach hybrydyzacji. Surowe warunki temperatury obejmują zwykle temperatury ponad 30 C, zwykle ponad około 37 C, zwykle ponad około 55 C, korzystnie ponad około 70 C. Surowe warunki stężenia soli zwykle będą niższe niż około 1000 mm, zwykle mniej niż około 400 mm, zwykle mniej niż około 250 mm, korzystnie mniej niż około 150 mm, w tym mniej niż około 100, 50 albo nawet 20 mm. Jednakże, złożone parametry są bardziej istotne niż wielkość konkretnego parametru. Patrz, np. Wetmur i Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: Hybrydyzacja w surowych warunkach powinna dawać tło wynoszące przynajmniej 2-krotność tła, korzystnie przynajmniej 3-5 albo więcej. Do porównania sekwencji, zwykle jedna sekwencja działa jako sekwencja odniesienia, do której porównywana jest badana sekwencja. Przy zastosowaniu algorytmu porównania sekwencji, sekwencję badaną i odniesienia wprowadza się do komputera, oznacza się współrzędne sekwencji, jeżeli to konieczne, i zaznacza się parametry algorytmu. Algorytm porównania sekwencji obliczany jako procent identyczności dla sekwencji badanej względem sekwencji odniesienia oparty jest na określonych parametrach programu. Można przeprowadzić optyczne przyrównanie sekwencji w celu porównania, np. algorytmem miejscowej homologii Smith i Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, algorytmem przyrównania homologii Needleman i Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, metodą poszukiwania podobieństwa Pearson i Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, komputerowymi implementacjami tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w pakiecie Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI) albo wizualnie (patrz, Ausubel i in., wyżej). Jednym z przykładów przydatnego algorytmu jest PILEUP. PILEUP tworzy liczne przyrównania sekwencji z grupy porównywanych sekwencji stosując progresywne, sparowane porównania wykazujące pokrewieństwo i procent identyczności sekwencji. Kreśli również drzewo albo dendrogram pokazujący skupienia pokrewieństwa zastosowane do wytworzenia przyrównania. PILEUP wykorzystuje uproszczoną metodę progresywnego przyrównywania Feng i Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: Zastosowany sposób jest podobny do metody opisanej przez Higgins i Sharp (1989) CABIOS 5: Program może przyrównać do 300 sekwencji, o długości do 5000 nukleotydów albo aminokwasów. Procedura wielokrotnego przyrównywania rozpoczyna się przyrównywaniem parami dwóch najbardziej podobnych sekwencji, dając przedział dwóch przyrównanych sekwencji. Następnie, przedział ten jest przyrównywany do następnej, najbliżej spokrewnionej sekwencji albo przedziału przyrównanych sekwencji. Dwa przedziały sekwencji są przyrównywane przez proste rozszerzenie przyrównania parami dwóch poszczególnych sekwencji. Końcowe przyrównanie otrzymuje się przez szereg progresywnych przyrównań parami. Program uruchamia się przez określenie konkretnych sekwencji i ich współrzędnych aminokwasów albo nukleotydów dla regionów porównania sekwencji i przez określenie parametrów programu. Przykładowo, sekwencję odniesienia można porównać z inną sekwencją badaną w celu określenia procentu identyczności stosując następujące parametry: domyślna przerwa (3,00), długość domyślnej przerwy (0,10) i ważone końce przerw. Innym przykładem algorytmu przydatnego do określania procentu identyczności sekwencji i podobieństwa sekwencji jest algorytm BLAST, który został opisany przez Altshul i in., (1990) J. Mol. Biol. 215: Oprogramowanie do przeprowadzania analizy BLAST jest dostępne publicznie przez serwer National Center for Biotechnology Information. Oprócz obliczania procentu identyczności sekwencji, algorytm BLAST przeprowadza również analizę statystyczną podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami (patrz, np. Karlin i Altshul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: ) Dalszą wskazówką, że dwie sekwencje kwasu nukleinowego są podobne zasadniczo identyczne jest to, że polipeptyd kodowany przez pierwszy kwas nukleinowy reaguje immunologicznie krzyżowo z polipeptydem kodowanym przez drugi kwas nukleinowy, jak to opisano niżej. Tak więc, polipeptyd jest zwykle zasadniczo identyczny z drugim polipeptydem, przykładowo, gdy oba peptydy różnią się jedynie konserwatywnymi zastąpieniami. Inną wskazówką, że dwie sekwencje kwasu nukleinowego są podobne zasadniczo identyczne jest to, że obie cząsteczki hybrydyzują ze sobą w surowych warunkach, jak to opisano niżej.

19 PL B1 19 IL-B30 od jednego gatunku ssaka można klonować i izolować przez hybrydyzację międzygatunkową blisko spokrewnionego gatunku. Homologia może być względnie niska pomiędzy odległymi gatunkami, stąd zalecana jest hybrydyzacja względnie blisko spokrewnionych gatunków. Alternatywnie, preparat przeciwciał, które wykazują mniejszą swoistość gatunkową może być przydatny w podejściu polegającym na klonowaniu ekspresyjnym. VII. Wytwarzanie IL-B30; Mimetyki DNA, który koduje IL-B30 albo jego fragmenty można otrzymać drogą syntezy chemicznej, badania przesiewowego bibliotek cdna albo badania przesiewowego bibliotek genomowych wytworzonych z różnych linii komórkowych albo próbek tkanek. Patrz, np. Okayama i Berg (1982) Mol. Cell. Biol. 2: ; Gubler i Hoffman (1983) Gene 25: ; i Glover (wyd. 1984) DNA Cloning: A practical Approach, IRL Press, Oxford. Alternatywnie, dostarczone tu sekwencje zapewnią przydatne startery do PCR albo syntetyczne albo inne preparaty odpowiednich genów kodujących IL-B30; w tym naturalnie występujące wykonania. DNA ten można poddać ekspresji w różnych komórkach gospodarza w celu syntezy IL-B30 pełnej długości albo fragmentów, które z kolei można użyć do wytworzenia przeciwciał poliklonalnych albo monoklonalnych; do badań wiązania; do konstruowania i ekspresji modyfikowanych cząsteczek oraz do badań nad strukturą/funkcją. Wektory w znaczeniu tu zastosowanym, obejmują plazmidy, wirusy, bakteriofagi, fragmenty DNA zdolne do integracji i inne nośniki, które umożliwiają integrację fragmentów DNA z genomem gospodarza. Patrz, np. Pouwels i in., (1985 i suplementy) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, NY. i Rodriguez i in., (1988, wyd.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA. Dla celów wynalazku, sekwencje DNA są pokrewne funkcjonalnie ze sobą. Przykładowo, DNA dla pre-sekwencji albo fragmentu wydzielniczego jest połączony z polipeptydem jeżeli ulega on ekspresji jako pre-białko albo uczestniczy w kierowaniu polipeptydu do błony komórkowej albo w wydzieleniu polipeptydu. Promotor jest połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą jeżeli kontroluje ona transkrypcję polipeptydu; miejsce wiązania rybosomu jest połączone funkcjonalnie z sekwencją kodującą, jeżeli jest w położeniu umożliwiającym translację. Zwykle, połączenie funkcjonalne oznacza połączenie ciągłe i w tej samej ramce odczytu, jednakże niektóre elementy genetyczne, takie jak geny represorowe, nie są połączone w ciągu, ale wiążą sekwencję operatora co z kolei kontroluje ekspresję. Patrz, np. Rodriguez i in., rozdz. 10, str ; Balbas i Bolivar (1990) Met. Enzymol. 185: 14-37; Ausubel i in., wyżej. Reprezentatywne przykłady odpowiednich wektorów ekspresyjnych obejmują pcdna1; pcd, Okayama i in., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: ; pmc1neo Poly-A, Thomas i in., (1987) Cell 51: ; oraz wektor bakulowirusowy taki jak pac 373 albo pac 610. Patrz, Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42: Często będzie pożądane wyrażenie polipeptydu IL-B30 w układzie, który zapewnia swoisty i określony wzorzec glikozylacji. Patrz, Luckow i Summers (1988) Bio/Technology 6: 47-55; Kaufman (1990) Meth. Enzymol. 185: IL-B30 albo jej fragment można przekonstruować w taki sposób, aby była połączona z błoną komórkową przez fosfatydylo-inozytol (PI), ale można ją było usunąć z błony przez traktowanie enzymem tnącym fosfatydylo-inozytol, np. fosfolipazą C. Uwalnia to antygen w postaci biologicznie czynnej, i umożliwia oczyszczanie standardowymi procedurami chemii białek. Patrz, np. Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988: ; Tse i in., (1985) Science 230: ; Brunner i in., (1991) J. Cell Biol. 114: Obecnie, ponieważ IL-B30 została scharakteryzowana, jej fragmenty albo pochodne można wytworzyć konwencjonalnymi sposobami syntezy peptydów. Obejmują one procesy takie jak opisane w Stewart i Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bondaszky i Bondaszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, NY, Bondaszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, NY; i Villafranca (wyd. 1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, CA. VIII. Zastosowania Wynalazek dostarcza reagentów, które znajdą zastosowanie w diagnostyce, jak to opisano, np. w stanach w których pośredniczy IL-B30 albo poniżej, w opisie zestawów diagnostycznych. Gen może być przydatny dla celów kryminalistyki, np. w celu odróżnienia gryzonia od człowieka, albo jako

20 20 PL B1 znacznik w celu rozróżnienia pomiędzy różnymi komórkami wykazującymi różnicową ekspresję albo wzorzec modyfikacji. Wynalazek dostarcza również reagentów o istotnych możliwościach komercyjnych i/lub terapeutycznych. IL-B30 (występująca naturalnie albo rekombinowana), jej fragmenty i przeciwciała przeciwko niej, wraz ze związkami o powinowactwie wiązania z IL-B30, powinny być przydatne jako reagenty do nauki technik biologii molekularnej, immunologii albo fizjologii. Przy użyciu reagentów można wytworzyć odpowiednie zestawy, np. do praktycznych zajęć laboratoryjnych wytwarzania albo zastosowania białek, przeciwciał, metod klonowania, histologii itp. Reagenty będą również przydatne do leczenia stanów związanych z nieprawidłową fizjologią albo rozwojem, w tym stanów zapalnych. Mogą być przydatne w testach in vitro na obecność składników oddziałujących, które mogą korelować z powodzeniem konkretnych strategii leczenia. W szczególności, przez odpowiednie sposoby leczenia przy użyciu dostarczonych to kompozycji można osiągnąć modulowanie fizjologii np. komórek krwiotwórczych albo limfoidalnych. Patrz, Thompson (1994; wyd.) The Cytokine Handbook (wyd. 2) Academic Press, San Diego; Metcalf i Nicola (1995) The Hematopoietic Golony Stimulating Factors, Cambridge University Press; i Aggarwal i Gutterman (1991) Human cytokines; Blackwell Publ. Przykładowo, choroba albo zaburzenie związane z nieprawidłową ekspresją albo nieprawidłową sygnalizacją przez IL-B30 powinno być celem dla agonisty albo antagonisty. Nowa cytokina powinna odgrywać rolę w regulowaniu albo rozwoju komórek krwiotwórczych, np. komórek limfoidalnych, które wpływają na reakcje odpornościowe, np. reakcję zapalną i/lub choroby autoagresyjne. Alternatywnie, może wpływać na fizjologię naczyniową albo rozwój albo objawy neuronalne. W szczególności, cytokina powinna pośredniczyć w różnych kontekstach, syntezie cytokin przez komórki, proliferacji itp. Antagoniści IL-B30, tacy jak odmiany muteinowe naturalnie występujących postaci IL-B30 albo przeciwciała blokujące, mogą zapewnić wybiórczy i silny sposób blokowania reakcji odpornościowej, np. w sytuacjach reakcji zapalnej albo autoagresyjnej. Patrz, również Samter i in., (wyd.) Immunological Diseases tom 1 i 2, Little, Brown and Co. Oprócz tego, powinny być przydatne pewne kompozycje skojarzone, np. z innymi modulatorami stanu zapalnego. Takie cząsteczki mogą obejmować steroidy, inne wersje G-CSF i/lub IL-6, w tym odmiany gatunkowe, albo homologi wirusowe oraz innych antagonistów. Wiadomo, że różne nieprawidłowe stany powodują wytwarzanie w różnych rodzajach komórek mrna dla IL-B30 co stwierdzono analizą Northern. Patrz, Berkow (wyd.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co. Rahway, NJ; Thorn i in., Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY; Weatherall i in., (wyd.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Wiele innych stanów i chorób obejmuje aktywację przez makrofagi albo monocyty, i wiele z nich reaguje na leczenie dostarczonymi tu agonistami albo antagonistami. Patrz, Stites i Terr (wyd. 1991) Basic and Clinical Immunology, Appleton & Lange, Norwalk, CT; Samter i in., (wyd.) Immunological Diseases, Little, Brown and Co., Problemy te są podatne na zapobieganie albo leczenia dostarczonymi tu kompozycjami. Lokalizacja w wysepkach trzustkowych wskazuje ewentualny związek z cukrzycą. IL-B30, antagoniści, przeciwciała itp. można oczyszczać a następnie podawać pacjentowi, weterynaryjnemu albo człowiekowi. Wszystkie reagenty można łączyć w celach terapeutycznych, z dodatkowymi albo obojętnymi składnikami, np. z konwencjonalnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami albo rozcieńczalnikami, np. adiutantami immunologicznymi, wraz z fizjologicznie nieszkodliwymi stabilizatorami, zaróbkami albo konserwantami. Kombinacje te można sterylizować przez filtrowanie i umieszczać w postaciach dawkowania, jak np. przez liofilizowanie w fiolkach albo przechowywać w stabilizowanych roztworach wodnych. Wynalazek uwzględnia również zastosowanie przeciwciał albo ich fragmentów wiążących, w tym postaci, które nie wiążą dopełniacza. Badanie przesiewowe leków przy użyciu IL-B30 albo jej fragmentów można przeprowadzić w celu zidentyfikowania związków o powinowactwie wiązania albo o innych biologicznych działaniach na funkcjonowanie IL-B30, w tym izolowanie składników towarzyszących. Kolejne testy biologiczne można wykorzystać w celu stwierdzenia, czy związek ma wewnątrzpochodną aktywność pobudzającą, a stąd czy jest blokerem albo antagonistą ponieważ blokuje aktywność cytokiny. Podobnie, związek o wewnątrzpochodnej aktywności pobudzającej może aktywować szlak sygnalizacji, a stąd jest agonistą pobudzającym aktywność IL-B30. Wynalazek dalej uwzględnia zastosowanie terapeutyczne przeciwciał blokujących przeciwko IL-B30, jako antagonistów, i przeciwciał pobudzających, jako agonistów. Podejście to powinno być szczególnie przydatne w przypadku odmian gatunkowych IL-B30.