Przeglądanie bibliotek

Transkrypt

1 Przeglądanie bibliotek Czyli jak złapać (i sklonować) ciekawy gen? Klonowanie genów w oparciu o identyczność lub podobieństwo ich sekwencji do znanego już DNA Sonda homologiczna (komplementarna w 100%) umożliwia klonowanie: Genomowego klonu, gdy posiadamy klon cdna Klonu cdna lub genomowego pełnej długości gdy posiadamy tylko jego fragment Sonda heterologiczna (o znaczącym udziale zasad komplementarnych) umożliwia klonowanie: Tego samego genu (lub cdna) z innego organizmu Genu (lub cdna) syntetycznym oligonukleotydem z sekwencją zdegenerowaną (opracowaną np. na podstawie sekw. białka) Rodziny genów z tego samego lub innego organizmu 1

2 Liczebność biblioteki do wysiania żeby coś znaleźć Biblioteka genomowa Klonowanie fragmentów przy konstrukcji biblioteki jest losowe - niektóre sekwencje klonują się kilkakrotnie, niektóre wcale liczba niezależnych rekombinantów wchodzących w skład biblioteki musi być większa niż n = wielkość genomu / średnia wielkość insertu dla prawdopodobieństwa 95% biblioteka musi liczyć 3 x n rekombinantów, dla 99% - 5 x n (genom człowieka) powyższe szacunki zakładają równy udział całej sekwencji (zależy np. od metody izolacji i fragmentacji). Biblioteka cdna Liczebność zależy od poziomu transkrypcji poszukiwanego genu udział w puli cdna Biblioteka znormalizowana zawiera wyrównane liczebności cdna poszczególnych genów Klonowanie genów w oparciu o ich zmienną transkrypcję Czynniki wpływające na zróżnicowaną ekspresję genów: różnice gatunkowe i odmianowe stadia rozwojowe organy tkanki warunki środowiskowe inne bodźce zewnętrzne stres mutacje i zmiany epigenetyczne 2

3 NA OKO I NA OŚLEP Przeglądanie różnicowe (differential screening) - w stosunkowo dużym zbiorze klonów (biblioteka) wyszukiwanie pojedynczych klonów, które ulegają ekspresji tylko w jednej ze sprawdzanych tkanek (organizmie, stanie fizjologicznym) Subtrakcja - subtraction (tworzenie biblioteki subtrachowanej) - masowe i automatyczne wzbogacanie zbioru klonów cdna w te które ulegają ekspresji (występują) tylko w jednej ze sprawdzanych tkanek = + Szczegóły techniczne przeglądania różnicowego - tyle sposobów ile bibliotek (albo i więcej) Standardowe przeglądanie biblioteki: może być zwykła biblioteka cdna (z mrna + ): poszukiwanie głównie klonów indukowanych wysiew biblioteki i odciski replik na filtrach konstrukcja sond molekularnych + i - (cdna) i hybrydyzacja Cold plaque screening - przeglądanie zimnych łysinek (virtual subtraction): biblioteka cdna z mrna +, nie trzeba replik odcisków sonda z mrna - ciekawe są te łysinki, które nie hybrydyzują 3

4 4

5 Nowsze (nie znaczy, że lepsze) metody przeglądania różnicowego (c.d.) Differential display (DD - RT PCR) i pochodne metody oparte o PCR identyfikacja klonów na podstawie długości produktów RT - PCR z dwóch starterów starter zakotwiczający (anchoring primer) - pierwsza nić cdna, starter arbitralny - druga nić cdna, amplifikacja, rozdział na żelu ( bp) i wybór fragmentów, reamplifikacja, subklonowanie i sprawdzanie metody pochodne (bez startera zakotwiczającego, 1, 2 lub 3 arbitralne w 1 reakcji, adaptor + komplementarny primer zamiast arbitralnego) cdna-aflp Odwrotna transkrypcja i trawienie cdna dwoma enzymami dającymi fragmenty w zakresie rozdzielczości żelu akrylamidowego Doklejenie różnych adaptorów do różnych lepkich końców identyfikacja klonów na podstawie długości produktów PCR ze starterów komplementarnych do adaptorów plus 2 zasady selektywne na końcu 3 : razem 4x4 [starter forward] x 4x4 [starter reverse] = 256 kombinacji Transkryptom jest podzielony na max 256 podgrup Differential Display DD RT-PCR starter zakotwiczający starter arbitralny brak podziału tkanek na tester i driver 5

6 Wykonała mgr M. Święcicka - KGHiBR 6

7 Metody oparte o sekwencjonowanie cdna Ilość sekwencji pochodzących od transkryptów tego samego genu w jednej puli cdna może być porównana do drugiej puli cdna Metody oparte o masowe sekwencjonowanie cdna RNA-Seq to też sekwencjonowanie cdna 7

8 Metody oparte o masowe sekwencjonowanie cdna RNA-Seq to też sekwencjonowanie cdna Znajomość sekwencji pozwala oprócz analizy ilościowej (wzrost/spadek) pogrupować zidentyfikowane geny na kategorie (regulowane procesy, specyficzne kompartmenty czy rodziny genów). Np. analiza programem MapMan Obecność funkcjonalnego białka LSD1 zmienia reakcję korzeni na atak nicieni pasożytniczych. Col0 lsd1(col0) Wykonał mgr Mateusz Matuszkiewicz KGHiBR 16 8

9 Metody oparte o analizę makro- i mikroukładów Wymagają wcześniejszej znajomości i adnotacji większej ilości cdna lub genomu danego organizmu Produktem subtrakcji jest zbiór fragmentów, które po umieszczeniu w wektorze są biblioteką Konwencjonalna biblioteka subtrachowana dwie tkanki, dwie pule mrna: + i - synteza sscdna + i hybrydyzacja z nadmiarem mrna - oddzielenie niezhybrydyzowanego sscdna od dwuniciowych hybryd - teoretycznie tylko geny indukowane synteza dscdna i ligacja do wektora Subtrakcja w oparciu o PCR supression subtractive hybridization (SSH) i representational difference analysis (RDA) synteza cdna tester (+) i driver (-) możliwość amplifikacji pierwotnego cdna - mała ilość startowego mrna cięcie na krótsze fragmenty enzymem 4-ro tnącym ligacja adaptorów do cdna testera hybrydyzacja testera z driverem zagnieżdżony PCR (nested) 9

10 10

11 SSH subtractive suppression hybridization (supresyjna hybrydyzacja odejmująca) TESTER próbka badana DRIVER próbka kontrolna PCR suppression by inverted terminal repeats NIEDOGODNOŚCI skrócenie sklonowanych fragmentów (degradacja, cięcie), błędy PCR i innych polimeraz, subtrakcja daje tylko wzbogacenie mieszaniny w specyficzne cząsteczki, brak skutecznych w 100% metod masowego potwierdzania skuteczności strategii (że dane klony są istotnie specyficzne), zmiany ilościowe często nieuchwytne, trudno wyłowić gen ulegający alternatywnemu montażowi (alternative splicing), większość metod umożliwia badanie zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkrypcji, zwykle żmudna, wieloetapowa i wielodniowa procedura. 11

12 DEFINICJE pfu (plaque forming unit) - jednostka tworząca łysinkę, najczęściej pojedynczy fag, ale nie zawsze. Miano biblioteki - ilość pfu na jednostkę objętości (np. pfu/ml). Jednostka aktywności enzymu (jednostka, unit - U) - taka ilość białka enzymatycznego, która strawi całkowicie 1 mg DNA dzikiego bakteriofaga lambda w ciągu 1 godziny w optymalnych warunkach (bufor, temperatura). 12