(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2014/02 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 38/18 ( ) A61K 39/395 ( ) A61P 35/00 ( ) C07K 16/22 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Sposób leczenia raka zawierający antagonistę VEGF-B (30) Pierwszeństwo: US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/19 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/07 (73) Uprawniony z patentu: Zenyth Operations PTY. Ltd., Parkville, AU (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ANDREW NASH, Kew, AU FELICITY MEREDITH DUNLOP, Regent, AU MANUEL BACA, Viewbank, AU LOUIS JERRY FABRI, Diamond Creek, AU PIERRE DAVID SCOTNEY, Greensborough, AU (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Piotr Godlewski JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 19253/14/P-RO/PG EP Opis TŁO WYNALAZKU DZIEDZINA WYNALAZKU Sposób leczenia raka zawierający antagonistę VEGF-B [0001] Wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny leczenia i profilaktyki raka. Bardziej szczegółowo, wynalazek dostarcza antagonistów czynnika wzrostu, które hamują wzrost raków, w tym guzów i tkanek przedrakowych. Jeszcze bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy antagonistów czynnika wzrostu B śródbłonka naczyniowego i ich zastosowania do hamowania wzrostu raka, w tym tkanki guza i tkanki przedrakowej. OPIS STANU TECHNIKI [0002] Szczegóły bibliograficzne publikacji odnoszące się do tego opisu zebrano także na końcu opisu. [0003] Odniesienie do jakiegokolwiek stanu techniki nie jest i nie powinno być rozumiane jako potwierdzenie albo inna forma sugestii, że ten stan techniki tworzy część wiedzy ogólnej w jakimkolwiek kraju. [0004] Rozwój naczyń krwionośnych i zaopatrzenie naczyniowe jest podstawowym warunkiem rozwoju narządów i różnicowania podczas embriogenezy, jak również normalnych postnatalnych procesów fizjologicznych, takich jak gojenie ran, regeneracja tkanek i narządów, i cykliczny wzrost ciałka żółtego i endometrium (Folkman & Klagsbrun, Science, 235(4787): , 1987; Klagsbrun & D Amore., Ann. Rev. Physiol. 53: , 1991; Carmeliet et al., Nature 380: , 1996; Ferrara et al., Nature 380: , 1996). Wzrost i dojrzewanie nowych naczyń (angiogeneza) jest wysoce złożonym i skoordynowanym procesem i wymaga sekwencyjnej aktywacji szeregu receptorów licznych ligandów (Yancopoulos et al., Nature 407: , 2000; Ferrara and Alitalo, Nature Medicine 5: , 1999; Carmeliet, Nature 407: , 2000). Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF albo VEGF-A) jest prawdopodobnie najdokładniej scharakteryzowanym z tych ligandów i sygnalizacja VEGF-A wydaje się reprezentować etap ograniczający szybkość krytyczną w procesie (Ferrara et al., Nature Medicine 9: , 2003). [0005] Oprócz normalnych procesów fizjologicznych, patologiczny rozwój guzów znany jest również jako zależny od stopnia tworzenia nowych naczyń krwionośnych w podstawie guza (Carmeliet et al., 2000 supra; Folkman, Nature Medicine 1:27-31, 1995; Hanahan & Folkman, Cell 86: , 1996). mrna VEGF-A jest aktywowany w wielu guzach ludzkich i VEGF-A wydaje się być ważnym czynnikiem angiogennym często wykorzystywanym przez guzy do wzrostu naczyń krwionośnych (Dvorak et al., Semin Perinatol 24:75-78, 2000; Ferrara & Alitalo, 1999 supra; Yancopoulos, 2000 supra; Benjamin & Keshet, Proc Natl Acad Sci USA 94: , 1997; Ferrara and Davis-Smyth, Endocr.

3 2 Rev 18:4-25, 1997). VEGF-A zwiększa także przepuszczalność naczyń krwionośnych, i jest to uważane za ważne dla inwazji guza i przerzutów (Dvorak et al., Curr Top Microbiol Immunol 237:97-132, 1999). W efekcie poczyniono znaczący wysiłek dla rozwoju środków ukierunkowanych na czynniki angiogenne, takie jak VEGF-A do zahamowania wzrostu guza (Ferrara et al., 2003 supra). Jednym takim środkiem jest bewacyzumab, humanizowane mysie przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z i hamuje aktywność VEGF-A. Bewacizumab (Avastin) został ostatnio zatwierdzony przez FDA do leczenia raka okrężnicy i odbytnicy. [0006] VEGF-A jest obecnie uznawany jako założycielski członek rodziny strukturalnie pokrewnych cząsteczek. "Rodzina VEGF" zawiera sześć członków, w tym prototypu VEGF- A, czynnik wzrostu łożyska (PLGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGFD i VEGF-E (Eriksson & Alitalo, Curr Top Microbiol Immunol 237:41-57, 1999). Funkcje biologiczne rodziny VEGF są mediowane przez aktywację różnicowania co najmniej trzech strukturalnie homologicznych receptorów kinazy tyrozynowej, VEGFR-1/Flt-1, VEGFR-2/Flk-1/KDR i VEGFR-3/Flt-4. VEGF-A, VEGF-B i PLGF także wiążą się z neuropiliną-1 i -2 receptorów kinazy nietyrozynowej, Soker et al., Cell 92:735-45, 1998; Neufeld et al., Trends Cardiovasc Med. 12: 13-19, 2002). Według ich wzorów wiązania receptorów, rodzinę VEGF można podzielić na trzy podgrupy: (1) VEGF-A, która wiąże się z VEGFR-1 i VEGFR-2; (2) PLGF i VEGF-B, która wiąże się tylko z VEGFR-1 i (3) VEGFC i VEGF-D, która oddziałuje zarówno VEGFR-2, jak i VEGFR-3 (Ferrara & Alitalo, 1999 supra; Ferrara et al., 2003 supra). [0007] Jak zauważono powyżej, VEGF-A jest najdokładniej scharakteryzowanym członkiem rodziny VEGF i nagromadzenie dowodów doprowadziło do wniosku, że VEGFR-2 jest głównym mediatorem VEGF-A związanym z aktywnościami biologicznymi, takimi jak proliferacja komórek śródbłonka, migracja i przeżycie, angiogeneza i przepuszczalność naczyniowa (Ferrara et al., 2003 supra). Oprócz VEGFR-2, VEGF-C i -D wiąże się również z i aktywuje, VEGFR-3. VEGFR-3 jest przede wszystkim ekspresjonowany w komórkach limfatycznych śródbłonka, i VEGF-C i D są uważane za kluczowe regulatory angiogenezy limfatycznej [albo limfangiogenezy] (Makinen et al., Nature Medicine 7: , 2001; Skobe et al., Nature Medicine 7:192-8, 2001; Stacker et al., Nature Medicine 7:186-91, 2001). W przeciwieństwie do VEGF-A, -C i -D i dalszych efektów sygnalizacji przez VEGFR-2 albo -3, dokładna rola VEGF-B i sygnalizacja przez VEGFR-1 pozostaje słabo zrozumiana. [0008] VEGFR-1 jest ekspresjonowany w wielu typach komórek (Clauss et al., J. Biol. Chem. 271: , 1996; Wang & Keiser, Circ. Res. 83: , 1998; Niida et al., J. Exp. Med. 190: , 1999) i ekspresja, co najmniej w komórkach śródbłonka, jest zwiększona przez niedotlenienie i mechanizm zależny od HIF-1α (Gerber et al., J. Biol. Chem. 272: , 1997). Jednakże, obserwuje się jedynie słabą autofosforylację VEGFR-1 w odpowiedzi na VEGF-A, i wiązanie VEGF-A z VEGFR-1 okazuje się nie aktywować dalszych sygnałów wymaganych do kluczowych odpowiedzi komórek śródbłonka, takich jak proliferacja i przeżycie (de Vries et al., Science 255: , 1992; Waltenberger et al., J. Biol. Chem. 269: , 1994; Keyt et al., J. Biol. Chem. 271: , 1996;

4 3 Rahimi et al., J. Biol. Chem. 275: , 2000). Obserwacja, że swoisty ligand VEGFR-1, PLGF, zwiększał aktywność VEGF-A w komórkach śródbłonka sugerowała, że VEGFR-1 mógłby funkcjonować jako receptor wabikowy tj. PLGF przemieszczonego VEGF-A z VEGFR-1 udostępniając go do wiązania z, i sygnalizowania przez VEGFR-2 (Park et al., J Biol Chem. 269: , 1994). Dane in vivo z genetycznie zmodyfikowanych myszy ponadto sugerowały niesygnalizującą rolę wabika dla VEGFR-1. Myszy VEGFR-1-/ - obumarły w macicy w okresie 8,5 i 9,5 dni i chociaż komórki śródbłonka rozwijały się, nie zdołały zorganizować się w kanały naczyniowe (Fong et al., Development 126: , 1999). Śmiertelność przypisywano nadmiernej proliferacji angioblastów, co z kolei przypisano zwiększonemu działaniu VEGF-A (Fong et al., 1999 supra). Obserwacja, że myszy ekspresjonujące VEGFR-1 pozbawione domeny kinazy były zdrowe i nie wykazywały jawnej wady w rozwoju naczyniowym dostarczając dalsze poparcie hipotezy wabika, ponieważ ścięty receptor nadal mógł wiązać receptor VEGF-A, ale nie przekazywał sygnałów wewnątrzkomórkowych (Hiratsuka etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: ). [0009] Analiza myszy VEGF-B-/- także nie zdołała rozwiązać zamieszania wokół dokładnej fizjologicznej (i patologicznej) roli specyficznych ligandów VEGFR-1 i sygnalizacji VEGFR- 1. W przeciwieństwie do myszy VEGF-/-, myszy VEGF-B-/- nie wykazują żadnych jawnych wad rozwoju naczyniowego, są zdrowe i płodne (Bellomo et al., Circ. Res. 86:E29-E35, 2000). W jednym raporcie serca myszy VEGF-B-/- były zmniejszone i odpowiedź na okluzję naczyń wieńcowych i rekonwalescencja mięśnia sercowego po niedokrwieniu były zagrożone (Bellomo et al 2000, supra). Chociaż morfologia serca okazała się prawidłowa, to autorzy wywnioskowali, że VEGF-B jest niezbędny dla utworzenia w pełni funkcjonalnego unaczynienia wieńcowego. W przeciwieństwie do tego, w drugim raporcie opisującym myszy VEGF-B-/ - odnotowano niewielką wadę przewodzenia przedsionkowego (Aase et al., Circulation 104: , 2001). [0010] W wyniku zamieszania wokół roli specyficznych ligandów VEGFR-1 i VEGFR-1 w regulacji tworzenia naczyń krwionośnych, potencjał VEGF-B jako ukierunkowanie terapeutyczne dla hamowania wzrostu guza i przerzutów nie jest jasne. Chociaż wykazano, że VEGF-B, wraz z innymi czynnikami, które mają być ekspresjonowane w różnych guzach (Salven et al., Am J Pathol, 153: , 1998), dowód na regulację w górę jest ograniczony (Li et al., Growth Factors 19:49-59, 2001) i nie było żadnych doniesień o skuteczności poszczególnych antagonistów VEGF-B w ksenoprzeszczepie albo innych odpowiednich modelach zwierzęcych. W rzeczywistości, potencjał VEGF-B (i PLGF) jest dodatkowo niejasny przez ujawnienie Cao et al w International PCT Publication No. WO03/62788, co sugeruje, że zwiększenie ekspresji VEGF-B, hamuje angiogenezę indukowaną przez VEGF- A, i tym samym reprezentuje potencjalne podejście do leczenia chorób wywołanych przez aktywność VEGF-A i angiogenezę indukowaną przez VEGF-A. [0011] US 2004/ opisuje system testowy użyteczny do identyfikacji przeciwciał, które wiążą się z VEGF-B i sposób skriningu dla inhibitorów aktywności biologicznej VEGF-

5 4 B, i odnosi się do przeciwciał, które wiążą się z VEGF-B i hamują jego aktywność biologiczną. [0012] Według wynalazku nieoczekiwanie ustalono, że antagoniści VEGF-B są użyteczni do ograniczania wzrostu i rozwoju raka, w tym tkanki guza. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0013] W całym opisie, o ile kontekst nie wymaga inaczej, słowo "zawierać", albo jego odmiany takie jak "zawiera" albo "zawierający" będą rozumiane jako oznaczające włączenie podanego elementu albo liczby całkowitej, albo grupy elementów albo liczb całkowitych, bez wykluczenia jakiegokolwiek innego elementu albo liczby całkowitej, albo grupy elementów albo liczb całkowitych. [0014] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe określa się przez numer identyfikacyjny sekwencji SEQ (SEQ ID NO:). Numery SEQ ID NO: odpowiadają numerycznie identyfikatorom sekwencji <400>1 (SEQ ID NO:1), <400>2 (SEQ ID NO:2), itd. Podsumowanie identyfikatorów sekwencji przedstawiono w Tabeli 1. Wyszczególnienie sekwencji przedstawiono po zastrzeżeniach. [0015] To zgłoszenie opisuje sposób hamowania wzrostu raka, w tym tkanki guza i tkanki przedrakowej za pomocą antagonisty VEGF-B. Dostarcza się także kompozycje zawierające jeden albo więcej antagonistów VEGF-B, oddzielnie albo w kombinacji z innymi środkami antyrakowymi albo innymi środkami hamującymi angiogenezę. [0016] Antagonista tutaj rozważany może być przeciwciałem, które hamuje oddziaływanie pomiędzy VEGF-B i VEGFR-1. Opisano tu także związek antysensowny, który zmniejsza ekspresję VEGF-B albo zakłócając kwas nukleinowy, który zmniejsza ekspresję VEGF-B. [0017] Korzystne przeciwciała wiążą się z VEGF-B i zakłócają interakcję VEGF-B z jego receptorem. Ujawniono przeciwciało i innych antagonistów do zastosowania w leczeniu pewnych stanów mediowanych w całości albo w części, albo bezpośrednio albo pośrednio, za pomocą VEGF-B i sposobów leczenia tych stanów u podmiotu obejmujących podawanie antagonisty VEGF-B zostały także ujawnione. [0018] W przypadku przeciwciał albo innych antagonistów ukierunkowanych na ludzki VEGF-B, pewien poziom reaktywności krzyżowej z innymi ssaczymi postaciami VEGF-B może być pożądany w niektórych okolicznościach, takich jak, chociażby, dla potrzeb badania przeciwciał albo innych antagonistów w modelach zwierzęcych na ich wpływ na konkretną chorobę i prowadzenie badań toksykologicznych przy sygnalizacji receptora VEGF- B/VEGFR-1 u badanego zwierzęcia, na którą wpływa badane przeciwciało albo inni antagoniści. Gatunki gdzie reaktywność krzyżowa przeciwciała albo innych antagonistów ludzkiego VEGF-B może być pożądana obejmują mysz, psa i małpę. Przeciwciała według wynalazku wykazują reaktywność krzyżową dla ludzkiego VEGF-B i mysiego VEGF-B. [0019] Przeciwciała według wynalazku wiążą się z domeną wiążącą (RBD) receptora VEGF- B i hamują sygnalizację indukowaną przez VEGF-B poprzez VEGFR-1. Szczególnie

6 5 korzystną grupą przeciwciał według wynalazku są te, które wiążą się z ludzkim VEGF-B RBD i które także wiążą, oddziałują albo inaczej łączą się z mysim VEGFB RBD i hamują sygnalizację indukowaną przez VEGF-B poprzez VEGFR-1. [0020] Korzystnie, przeciwciała są przeciwciałami monoklonalnymi ("mabs") albo ich fragmentami wiążącymi antygen. Jeszcze korzystniej, przeciwciała są humanizowanymi przeciwciałami, włączając deimmunizowane albo chimeryczne przeciwciała odpowiednie do podawania ludziom. Szczególnie korzystne są humanizowane przeciwciała, wytwarzane chociażby z mysich przeciwciał monoklonalnych i ludzkie przeciwciała monoklonalne, które są wytwarzane chociażby przy użyciu myszy transgenicznych albo przez prezentację fagową. [0021] Przeciwciała tutaj opisane obejmują mysie przeciwciała monoklonalne 1C6, 2F5, 2H10 i 4E12 i humanizowane, deimmunizowane albo chimeryczne postacie mabs 1C6, 2F5, 2H10 i 4E12. Przeciwciała według wynalazku obejmują przeciwciało 2H10 i są zdefiniowane w zastrzeżeniach od 1 do 6. [0022] To zgłoszenie opisuje sposoby modulowania chorób mediowanych przez VEGF-B albo stanów przez podawanie antagonistów VEGF-B, zwłaszcza przeciwciała tutaj ujawnione. Stany do leczenia obejmują raki i guzy, i zwłaszcza guzy lite. Mogą być także leczone stany przedrakowe i guzy rozproszone, takie jak chociażby szpiczaki i chłoniaki. [0023] Ten wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało anty-vegf-b, które hamuje wiązanie VEGF-B z VEGFR-1, przy czym przeciwciało wiąże ludzki VEGF-B o wartości K D 1 x 10-7 M albo mniejszej, przy czym przeciwciało to jest krzyżowo reaktywne dla ludzkiego VEGF-B i mysiego VEGF-B i przy czym przeciwciało zawiera łańcuch lekki o CDR-ach posiadających sekwencje pokazane w numerach SEQ ID: od 5 do 7 i łańcuch ciężki o CDRach posiadających sekwencje pokazane w numerach SEQ ID: od 8 do 10 i korzystne cechy są określone w zastrzeżeniach od 2 do 6. [0024] Podsumowanie identyfikatorów sekwencji używanych w całym opisie przedmiotowym przedstawiono w Tabeli 1. TABELA 1 Podsumowanie identyfikatorami sekwencji NUMERY IDENTYFIKACYJ NE SEKWENCJI: OPIS 1 Sekwencja aminokwasowa ludzkiego VEGF-B Sekwencja aminokwasowa mysiego VEGF-B Sekwencja aminokwasowa regionu łańcucha lekkiego mysiego mab 2H 10

7 6 Podsumowanie identyfikatorami sekwencji NUMERY IDENTYFIKACYJ NE SEKWENCJI: OPIS 4 Sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mysiego mab 2H10 5 Sekwencja aminokwasowa 2H10 CDR-L1 6 Sekwencja aminokwasowa 2H10 CDR-L2 7 Sekwencja aminokwasowa 2H10 CDR-L3 8 Sekwencja aminokwasowa 2H10 CDR-H1 9 Sekwencja aminokwasowa 2H10 CDR-H2 10 Sekwencja aminokwasowa 2H10 CDR-H3 11 Sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha lekkiego mysiego mab 4E Sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mysiego mab 4E Sekwencja aminokwasowa 4E12 CDR-L1 14 Sekwencja aminokwasowa 4E12 CDR-L2 15 Sekwencja aminokwasowa 4E12 CDR-L3 16 Sekwencja aminokwasowa 4E12 CDR-H1 17 Sekwencja aminokwasowa 4E12 CDR-H2 18 Sekwencja aminokwasowa 4E12 CDR-H3 19 Sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha lekkiego mysiego mab 2F5 20 Sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mysiego mab 2F5 21 Sekwencja aminokwasowa 2F5 CDR-L1

8 7 Podsumowanie identyfikatorami sekwencji NUMERY IDENTYFIKACYJ NE SEKWENCJI: OPIS 22 Sekwencja aminokwasowa 2F5 CDR-L2 23 Sekwencja aminokwasowa 2F5 CDR-L3 24 Sekwencja aminokwasowa 2F5 CDR-H1 25 Sekwencja aminokwasowa 2F5 CDR-H2 26 Sekwencja aminokwasowa 2F5 CDR-H3 27 Sekwencja aminokwasowa Ludzkiego Zmiennego Łańcucha Lekkiego: Linia zarodkowa PK9/JK4 28 Sekwencja aminokwasowa Ludzkiego Zmiennego Łańcucha Lekkiego: Linia zarodkowa DP75/JH4a 29 Ludzki Zmienny Łańcuch Lekki z przeszczepionymi CDR 2H10: Linia zarodkowa PK9/JK4 30 Ludzki Zmienny Łańcuch Ciężki z przeszczepionymi CDR 2H10: Linia zarodkowa DP75/JH4a 31 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-L1 32 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-L1 zoptymalizowana do ekspresji w E. coli 33 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-L2 34 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-L2 zoptymalizowana do ekspresji w E. coli 35 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-L3 36 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-L3 zoptymalizowana do ekspresji w E. coli 37 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-H1 38 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-H1 zoptymalizowana do

9 8 Podsumowanie identyfikatorami sekwencji NUMERY IDENTYFIKACYJ NE SEKWENCJI: OPIS ekspresji w E. coli 39 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-H2 40 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-H2 zoptymalizowana do ekspresji w E. coli 41 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-H3 42 Sekwencja nukleotydowa 2H10 CDR-H3 zoptymalizowana do ekspresji w E. coli 43 Sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha lekkiego mysiego mab 1 C6 44 Sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mysiego mab 1C6 45 Sekwencja aminokwasowa 1C6 CDR-L1 46 Sekwencja aminokwasowa 1C6 CDR-L2 47 Sekwencja aminokwasowa 1C6 CDR-L3 48 Sekwencja aminokwasowa 1C6 CDR-H 1 49 Sekwencja aminokwasowa 1C6 CDR-H2 50 Sekwencja aminokwasowa 1C6 CDR-H3 [0025] Lista skrótów stosowanych w opisie przedmiotowym przedstawiono w Tabeli 2. Tabela 2 Skróty Skrót VEGF VEGF-B VEGFR-1 Definicja skrótu Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego Czynnik B wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF-B Receptor

10 9 PLGF Mabs 1C6 2F5 2H10 4E12 RBD CDR mvegf-b hvegf-b Czynnik wzrostu łożyska Przeciwciała monoklonalne Mysie przeciwciało monoklonalne dla VEGF-B Mysie przeciwciało monoklonalne dla VEGF-B Mysie przeciwciało monoklonalne dla VEGF-B Mysie przeciwciało monoklonalne dla VEGF-B Domena wiążąca receptora Regiony dopasowane komplementarnie Mysi VEGF-B Ludzki VEGF-B VEGF-B Skrócona postać VEGF-B obejmująca aminokwasy od 10 do 108 RT-PCR KRÓTKI OPIS FIGUR [0026] Reakcja łańcuchowa odwrotnej transkrypcji polimerazy Figura 1 przedstawia sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego regionu zmiennego anty-vegf-b mab 2H10. Numeracja aminokwasów jest według Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). Regiony CDR (podkreślone) są zdefiniowane przez definicję sekwencji według Kabat et al. (supra), z wyjątkiem CDR-H1, który ma sekwencję połączoną i definicję strukturalną według Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: , Figura 2 przedstawia sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego regionu zmiennego anty-vegf-b mab 4E12. Numeracja aminokwasów jest według Kabat et al., (supra). Regiony CDR (podkreślone) są zdefiniowane przez definicję sekwencji według Kabat et al. (supra), z wyjątkiem CDR-H1, który ma sekwencję połączoną i definicję strukturalną według Chothia and Lesk (supra). Figura 3 przedstawia sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego regionu zmiennego anty-vegf-b mab 2F5. Numeracja aminokwasów jest według Kabat et al., (supra). Regiony CDR (podkreślone) są zdefiniowane przez definicję sekwencji według Kabat et al. (supra), z wyjątkiem CDR-H1, który ma sekwencję połączoną i definicję strukturalną według Chothia and Lesk (supra). Figura 4 przedstawia sekwencję aminokwasową Linii Zarodkowej Ludzkiego Zmiennego Łańcucha Lekkiego (PK9/JK4) pochodzącą z bazy danych sekwencji EmBL X93622 i J00242 (ludzkie nierearanżowane przeciwciało linii zarodkowej regionów łańcucha lekkiego

11 10 odpowiednio PK9 i JK4) i sekwencję aminokwasową Linii Zarodkowej Ludzkiego Zmiennego Łańcucha Ciężkiego (DP75/JH4a) pochodzącą z bazy danych sekwencji EmBL HSIGDP75 i J00256 (ludzkie nierearanżowane przeciwciało linii zarodkowej regionów łańcucha ciężkiego odpowiednio DP75 i JH4a) Regiony CDR są podkreślone. Figura 5 przedstawia sekwencję aminokwasową Ludzkiego Zmiennego Łańcucha Lekkiego Linii Zarodkowej (PK9/JK4) i sekwencję aminokwasową Ludzkiego Zmiennego Łańcucha Ciężkiego Linii Zarodkowej (DP75/JH4a) następującej po przeszczepieniu CDR z CDR z mysiego anty-vegf-b przeciwciała monoklonalnego 2H10. Regiony CDR są podkreślone. Aminokwas w pozycji 74 w sekwencji łańcucha ciężkiego (numeracja Kabat H73) zmutowano wstecznie z Thr do Lys jak opisano w Przykładzie 10. Figura 6 przedstawia sekwencje kwasów nukleinowych regionów CDR 2H10 zoptymalizowane do ekspresji w E.coli. Figura 7 przedstawia sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego regionu zmiennego anty-vegf-b mab 1C6. Numeracja aminokwasów jest według Kabat et al., (supra). Regiony CDR (podkreślone) są zdefiniowane przez definicję sekwencji według Kabat et al. (supra), z wyjątkiem CDR-H1, który ma sekwencję połączoną i definicję strukturalną według Chothia and Lesk(supra). SZCZEGÓŁOWY OPIS PRZYKŁADÓW WYKONANIA [0027] Przed szczegółowym opisaniem tego wynalazku, należy rozumieć, że jeżeli nie wskazano inaczej, wynalazek przedmiotowy nie ogranicza się do określonych formulacji komponentów, sposobów wytwarzania, dawkowania albo schematów diagnostycznych albo podobnych. Należy również rozumieć, że terminologia tutaj stosowana jest jedynie na potrzeby opisania poszczególnych wykonań i nie jest przeznaczona do ograniczania. Zakres wynalazku jest zdefiniowany w zastrzeżeniach dołączonych do tego opisu. [0028] Formy liczby pojedynczej "a", "an" i "the" obejmują aspekty liczby mnogiej, o ile kontekst jasno nie wskazuje inaczej. Dlatego chociażby określenie "przeciwciało" obejmuje pojedyncze przeciwciało, jak również dwa albo więcej przeciwciał; określenie "VEGF-B" obejmuje pojedynczy VEGF-B, jak również dwie albo więcej cząsteczek VEGF-B, określenie "antagonista" obejmuje pojedynczego antagonistę, jak również dwóch albo więcej antagonistów; i tak dalej. [0029] W opisie i zastrzeżeniach tego wynalazku, stosuje się następującą terminologię według podanych poniżej definicji. [0030] Terminy "antagonista", "związek", "środek aktywny", "środek farmakologicznie aktywny", "lek" i "aktywny" są tutaj stosowane wymiennie i odnoszą się do antagonisty VEGF-B, który indukuje pożądane działanie farmakologiczne i/albo działanie fizjologiczne. Terminy obejmują również farmaceutycznie dopuszczalne i farmakologicznie czynne postacie tych środków aktywnych w szczególności tutaj wymienionych, w tym, ale nie wyłącznie, sole, estry, amidy, proleki, aktywne metabolity, analogi i podobne. Gdy stosuje się terminy

12 11 "antagonista", "związek", "środek czynny", "środek farmakologicznie aktywny", "lek" i "aktywny", to należy rozumieć, że zawiera środek aktywny sam w sobie, jak również ich farmaceutycznie dopuszczalne, farmakologicznie aktywne sole, estry, amidy, proleki, metabolity, analogi, itp. [0031] Określenie "antagonista", "związek", "środek aktywny", "środek farmakologicznie aktywny", "lek" i "aktywny" może obejmować kombinację dwóch albo więcej spośród takich składników, takich jak chociażby dwa albo więcej przeciwciał. "Kombinacja" obejmuje także kombinacje wieloczęściowe, takie jak kompozycja dwuczęściowa, gdzie środki są dostarczane oddzielnie i podawane albo dozowane oddzielnie albo zmieszane ze sobą przed dozowaniem. [0032] Przykładowo wieloczęściowe opakowanie farmaceutyczne może mieć dwa albo więcej przeciwciał utrzymywanych oddzielnie albo przeciwciało anty-vegf-b i środek antyrakowy albo czynnik hamujący angiogenezę. [0033] Terminy "skuteczna ilość" i "terapeutycznie skuteczna ilość" środka w znaczeniu tutaj stosowanym oznaczają wystarczającą ilość antagonisty VEGF-B dla zapewnienia pożądanego efektu terapeutycznego albo fizjologicznego albo wyniku, w tym hamowania angiogenezy i/albo hamowania wzrostu raka, w tym tkanki guza. Działania niepożądane, np. efekty uboczne, są często manifestowane wraz z pożądanym efektem terapeutycznym; stąd lekarz równoważy potencjalne korzyści i potencjalne ryzyko przy wyznaczaniu co jest właściwą "skuteczną ilością". Dokładna wymagana ilość środka będzie zmieniać się od podmiotu do podmiotu, w zależności od gatunku, wieku i ogólnego stanu podmiotu, sposobu podawania i podobnych. Zatem może nie być możliwe określenie dokładnej "skutecznej ilości". Jednakże, odpowiednia "skuteczna ilość" w dowolnym konkretnym przypadku może być określona przez osobę o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie za pomocą jedynie rutynowych doświadczeń. Zdolność antagonisty VEGF-B, korzystnie przeciwciała, do hamowania raka można ocenić w zwierzęcym modelowym systemie predykcyjnym skuteczności w ludzkich guzach. Osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie będzie w stanie wyznaczyć takie ilości w oparciu o takie czynniki jak wielkość podmiotu, nasilenie objawów u podmiotu i konkretna kompozycja albo wybrana droga podawania. [0034] Przez "farmaceutycznie dopuszczalny" nośnik i/albo rozcieńczalnik rozumie się nośnik farmaceutyczny zawierający materiału, który nie jest biologicznie albo inaczej niepożądany, tj. materiał można podawać podmiotowi razem z wybranym środkiem aktywnym bez wywoływania żadnej albo istotnej negatywnej reakcji. Nośniki mogą obejmować dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, media dyspersyjne, powłoki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki służące do dostosowania toniczności, bufory, środki chelatujące i środki opóźniające absorpcję, i podobne. [0035] Podobnie, "farmaceutycznie dopuszczalna" sól, ester, amid prolek albo pochodna związku jak tutaj opisano jest solą, estrem, amidem prolekiem albo pochodną, która nie jest biologicznie albo inaczej niepożądana.

13 12 [0036] Terminy "leczący" i "leczenie" tutaj stosowane odnoszą się do zmniejszenia nasilenia i/albo częstości objawów raka, eliminacji objawów i/albo przyczyn wywołujących raka, zapobiegania wystąpieniu objawów raka i/albo wywołującej je przyczyny i poprawy albo zapobiegania albo łagodzenia uszkodzeń w następstwie raka. [0037] Terminy "rak" i "guz" mogą być stosowane zamiennie i obejmują stany przedrakowe. [0038] "Leczenie" podmiotu może obejmować zapobieganie wzrostowi raka albo innym, niepożądanym zdarzeniom fizjologicznym u podatnego podmiotu, jak również leczenie podmiotu z objawami klinicznymi przez łagodzenie objawów raka. [0039] "Podmiot" tutaj stosowany odnosi się do zwierzęcia, korzystnie ssaka, korzystniej człowieka, który może korzystać z formulacji farmaceutycznych i sposobów według wynalazku. Nie ma żadnych ograniczeń co do rodzaju zwierzęcia, które może korzystać z opisanych tutaj formulacji farmaceutycznych i sposobów. Podmiot niezależnie od tego, czy zwierzę będące człowiekiem, czy nie będące człowiekiem może być określane jako jednostka, pacjent, zwierzę, gospodarz albo biorca, jak również podmiot. Związki i sposoby według wynalazku mają zastosowanie w medycynie i w medycynie weterynaryjnej. [0040] Korzystnymi zwierzętami są ludzie albo zwierzęta do badań laboratoryjnych. [0041] Zwierzęta do badań laboratoryjnych obejmują chociażby myszy, szczury, króliki, świnki morskie, chomiki, koty i psy. [0042] Wynalazek wykorzystuje konwencjonalną biologię molekularną, mikrobiologię i techniki rekombinacji DNA. Techniki te są dobrze znane w dziedzinie i są opisane w różnych publikacjach, takich jak Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1989.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes i and II (D. N. Glover ed. 1985) and F. M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., [0043] Terminy "polinukleotyd", "kwas nukleinowy" albo "cząsteczka kwasu nukleinowego" odnoszą się do polimerycznej postaci estru fosforanowego rybonukleozydów (adenozyny, guanozyny, urydyny albo cytydyny; "cząsteczki RNA") albo dezoksyrybonukleozydów (dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksytymidyny albo dezoksycytydyny; "cząsteczki DNA"), albo ich fosfoestrowych analogów, takich jak fosforotioniany i tioestry, w formie pojedynczej nici, w formie dwuniciowej albo innej. [0044] Terminy "sekwencja polinukleotydowa", "sekwencja kwasu nukleinowego" albo "sekwencja nukleotydowa" dotyczy szeregu zasad nukleinowych (określanych również jako "nukleotydy") w kwasie nukleinowym, takim jak DNA albo RNA, i oznacza dowolny łańcuch dwóch albo więcej nukleotydów. [0045] Terminy "sekwencja kodująca" albo "sekwencyjne kodowanie" produkt ekspresji, takiego jak RNA, polipeptyd, białko albo enzym, oznacza sekwencję nukleotydową, która gdy ekspresjonowana, powoduje wytwarzanie produktu.

14 13 [0046] Termin "gen" oznacza sekwencję DNA, która koduje albo odpowiada określonej sekwencji rybonukleotydów albo aminokwasów, które obejmują całość albo część jednej albo więcej cząsteczek RNA, białek albo enzymów, i może zawierać albo nie zawierać sekwencji regulatorowych DNA, takich jak sekwencje promotora, które określają chociażby warunki, w których gen jest ekspresjonowany. Geny mogą być transkrybowane z DNA na RNA, które mogą być albo nie być translowane do sekwencji aminokwasów. [0047] Termin "amplifikacja" sekwencji nukleotydowej tutaj stosowany może oznaczać wykorzystanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dla zwiększenia stężenia określonej sekwencji nukleotydowej w mieszaninie sekwencji nukleotydowych. Saiki, et al., Science 239: 487, 1988 dostarcza opis PCR. Kwasy nukleinowe tutaj opisane obejmują te, które kodują przeciwciało anty-vegf-b, przeciwciało anty-vegf-b łańcucha ciężkiego albo lekkiego, przeciwciało anty-vegf-b regionu zmiennego łańcucha ciężkiego albo lekkiego, przeciwciało anty-vegf-b regionu stałego łańcucha ciężkiego albo lekkiego, CDR przeciwciała anty-vegf-b (CDR-L1, CDR-L2, CDR L3, CDR-H1, CDR-H2 albo CDR-H3), myszo-ludzkie przeciwciało chimeryczne jak tutaj opisano albo humanizowane przeciwciała jak tutaj opisano, które mogą być amplifikowane przez PCR. Kwasy nukleinowe według wynalazku są jak zdefiniowano w zastrzeżeniach 8 i 9. [0048] Termin "oligonukleotyd" odnosi się do kwasu nukleinowego, na ogół co najmniej 10, korzystnie co najmniej 15, korzystniej co najmniej 20 nukleotydów, korzystnie nie więcej niż 100 nukleotydów, który może być zdolny do hybrydyzacji z cząsteczką genomową DNA, cząsteczką cdna albo cząsteczką mrna kodującą gen, mrna, cdna albo inny kwas nukleinowy będący przedmiotem zainteresowania. Oligonukleotydy mogą być znakowane chociażby przez wbudowanie nukleotydów 32 P, nuklotydów 3 H, nukleotydów 14 C, nukleotydów 35 S albo nukleotydów, do których znacznik, taki jak biotyna, został sprzężony kowalencyjnie. Znakowany oligonukleotyd może być stosowany jako sonda do wykrywania obecności kwasu nukleinowego. Oligonukleotydy (jeden albo obydwa mogą być znakowane) można stosować jako primery PCR, zarówno do klonowania pełnej długości, jak i fragmentu genu, albo do wykrywania obecności kwasów nukleinowych. Na ogół, oligonukleotydy wytwarza się syntetycznie, korzystnie za pomocą syntezatora kwasów nukleinowych. [0049] Sekwencja dowolnego kwasu nukleinowego (chociażby, kwas nukleinowy kodujący gen VEGF-B albo kwas nukleinowy kodujący przeciwciało anty-vegf-b albo ich fragment albo część) może być sekwencjonowany dowolnym sposobem znanym w dziedzinie, takim jak sekwencjonowanie chemiczne albo sekwencjonowanie enzymatyczne. "Chemiczne sekwencjonowanie" DNA może być wykonane sposobem Maxama i Gilberta, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (2): , 1977), w którym DNA jest losowo rozszczepiane przy użyciu reakcji specyficznych dla poszczególnych zasad. "Enzymatyczne sekwencjonowanie" DNA może być wykonane sposobem Sangera (Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(12): , 1977). [0050] Kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być flankowane przez naturalne regulacyjne (kontrola ekspresji) sekwencje albo mogą być związane z sekwencjami

15 14 heterologicznymi, w tym promotorami, wewnętrznymi miejscami wejścia rybosomu (IRES) i innymi sekwencjami miejsc wiązania rybosomu, wzmacniaczami, elementami odpowiedzi, supresorami, sekwencjami sygnałowymi, sekwencjami poliadenylacji, intronami, niekodującymi regionami 5'- i 3'- i podobnymi. [0051] "Promotor" albo "sekwencja promotora" jest regionem regulatorowym DNA zdolnym do wiązania polimerazy RNA w komórce i inicjowania transkrypcji sekwencji kodującej. Sekwencja promotora jest zwykle ograniczona na jej końcu 3' przez miejsca inicjacji transkrypcji i rozciąga się w górę w kierunku 5' obejmując minimalną liczbę zasad albo elementów niezbędnych do zainicjowania transkrypcji na dowolnym poziomie. Miejsce inicjacji transkrypcji, jak również domeny wiążące białko (sekwencje konsensusowe) odpowiedzialne za wiązanie polimerazy RNA można znaleźć w sekwencji promotora. Promotor może być operacyjnie związany z innymi sekwencjami kontroli ekspresji, obejmując sekwencje wzmacniające i represorowe albo z kwasem nukleinowym według wynalazku. Promotory, które można stosować do kontroli ekspresji genów obejmują, lecz nie są do nich ograniczone, promotor wirusa cytomegalii (CMV) Patenty USA Numery i ) i wczesny region promotora SV40 (Benoist, et al., Nature 290: , 1981). [0052] Sekwencja kodująca jest "pod kontrolą", "funkcjonalnie związana z" albo "operacyjnie związana z" transkrypcyjna i translacyjna kontrola sekwencji w komórce, gdy sekwencje kierują transkrypcją sekwencji kodującej mediowaną przez polimerazę RNA w RNA, korzystnie mrna, które następnie mogą być łączonym trans-rna (jeśli zawiera introny) i, opcjonalnie, translowanym do białka kodowanego przez sekwencję kodującą. [0053] Terminy "ekspresjonować" i "ekspresja" oznaczają umożliwienie albo powodowanie informacji w genie, sekwencja RNA albo DNA do konwertowania w produkt; chociażby, wytwarzanie białka przez aktywowanie funkcji komórkowych zaangażowanych w transkrypcję i translację sekwencji nukleotydowej. Sekwencja DNA jest ekspresjonowana w albo przez komórkę do utworzenia "produktu ekspresji" (takiego jak mrna) albo białka (takiego jak przeciwciało anty-vegf-b). Można także stwierdzić, że produkt ekspresji sam w sobie będzie "ekspresjonowany" przez komórkę. [0054] Terminu "wektor", "wektor klonowania" i "wektor ekspresji" oznaczają nośnik (taki jak plazmid), za pomocą którego sekwencja DNA albo RNA może być wprowadzona do komórki gospodarza do transformowania gospodarza, opcjonalnie wspierania ekspresji i/albo replikacji wprowadzonej sekwencji. [0055] Określenie "transfekcja" albo "transformacja" oznacza wprowadzenie kwasu nukleinowego do komórki. Terminy te mogą odnosić się do wprowadzania kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-vegf-b albo jego fragmentu w komórce. Wprowadzony gen albo sekwencję można nazywać "klonem". Komórka gospodarza, która przyjmuje wprowadzane DNA albo RNA, została "transformowana" i jest "transformantem" albo "klonem". Wprowadzone DNA albo RNA do komórki gospodarza mogą pochodzić z dowolnego źródła, obejmującego komórki tego samego rodzaju albo gatunku jako komórki gospodarza, albo komórki innego rodzaju albo gatunku.

16 15 [0056] Termin "komórka gospodarza" oznacza dowolną komórkę dowolnego organizmu, która jest wybrana, zmodyfikowana, transfekowana, transformowana, hodowana albo stosowana, albo manipulowana dowolną drogą dla wytwarzania substancji przez komórkę, chociażby ekspresji albo replikacji przez komórkę, genu, sekwencji DNA albo RNA, białka albo enzymu. [0057] Termin "system ekspresji" oznacza komórkę gospodarza i kompatybilny wektor, które w odpowiednich warunkach mogą ekspresjonować białko albo kwas nukleinowy, który jest przenoszony przez wektor i wprowadzany do komórki gospodarza. Wspólne systemy ekspresji obejmują komórki gospodarza E. coli i wektory plazmidowe, owadzie komórki gospodarza i wektory bakulowirusowe, i ssacze komórki gospodarza i wektory. [0058] Wynalazek dotyczy ogólnie sposobu hamowania wzrostu raków, w tym tkanki guzowej, jak również tkanki przedrakowej poprzez hamowanie funkcji sygnalizacyjnej VEGF-B. Może to nastąpić poprzez hamowanie aktywności VEGFB, hamowanie interakcji VEGF-B z receptorem albo zmniejszanie ekspresji VEGF-B. Odpowiednio, zgłoszenie to ujawnia sposób leczenia raka oraz kompozycje i substancje użyteczne do tego celu. W korzystnym wykonaniu, wynalazek dostarcza przeciwciała, które antagonizują interakcję VEGF-B/VEGFR-1. [0059] Jednakże, zgłoszenie to ujawnia innych antagonistów VEGF-B, w tym związek antysensowny, który obniża ekspresję VEGF-B albo zakłócając kwas nukleinowy, który zmniejsza ekspresję VEGF-B. Zakłócająca cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera RNA syntetyczne albo RNAi pochodzące od DNA. [0060] Antagonistów VEGF-B można przygotować wieloma sposobami. Chociażby, związki na bazie kwasów nukleinowych można wytworzyć stosując ogólne podejścia podane w zgłoszeniu patentowym USA nr i obejmują enzymatyczne cząsteczki kwasu nukleinowego (rybozymy, takie jak Inozym, G-cleaver, amberzym, zinzym), DNAzymy, chimery antysensowne 2-5A, tripleks tworzący kwas nukleinowy, kwasy nukleinowe wabika, aptamery, allozymy, antysensowne kwasy nukleinowe zawierające grupy chemiczne rozszczepiające RNA (Cook et al., U.S. Patenty USA Numery ), mało zakłócający kwas nukleinowy (sirna, Beigelman et al., U.S. S Nr 60/ ). [0061] Antysensowne związki, które zmniejszają ekspresję VEGF-B są opisane w Zhang and Dobie, International PCT Publication No. WO03/ Zakłócanie cząsteczek kwasów nukleinowych, takich jak cząsteczki krótkiego interferującego kwasu nukleinowego (sirna), krótkiego interferującego RNA (sirna), dwuniciowego RNA (dsrna), mikro-rna (mirna) i krótkiego typu spinka do włosów RNA (shrna) zdolne do mediowania interferencji RNA (RNAi) przeciw VEGF-B i/albo które zmniejszają ekspresję VEGF-B można wytworzyć stosując ogólne podejście opisane w McSwiggen et al., International PCT Publication No. WO 03/ [0062] Korzystni antagoniści tutaj ujawnieni odnoszą się do ludzkiego VEGF-B. Jednakże, reagujący krzyżowo antagoniści VEGF-B, tj. antagonizujący VEGF-B ludzkie i innych form

17 16 ssaczych mogą być pożądani. [0063] Przeciwciała tutaj ujawnione i przeciwciała według wynalazku są korzystnie przeciwciałami monoklonalnymi. Korzystnie, przeciwciała są w postaci wyizolowanej, homogenicznej albo w pełni albo częściowo oczyszczonej. [0064] Najkorzystniej, przeciwciała są humanizowane albo chimeryczne odpowiednie do podawania ludziom. Te obejmują humanizowane przeciwciała wytworzone, chociażby, z mysich przeciwciał monoklonalnych. Opisane są również ludzkie przeciwciała monoklonalne, które można wytwarzać, chociażby, przy użyciu myszy transgenicznych, jak opisano poniżej, albo przez prezentację fagową. "Humanizowane" przeciwciało zawiera deimmunizowane przeciwciało. [0065] Określenie "VEGF-B" obejmuje wszystkie naturalnie występujące izoformy VEGF-B, w tym VEGF-B 167 i VEGFB 186 (Olofsson et al., J Biol Chem. 271: , 1996), występujące naturalnie przetworzone formy VEGF-B, wraz z wszelkimi genetycznie zmodyfikowanymi formami na bazie sekwencji naturalnie występujących białek VEGF-B. VEGF-B jest przedstawicielem rodziny czynników wzrostu VEGF i podobne jak wszyscy przedstawiciele tej rodziny zawiera domenę homologiczną VEGF (Olofsson et al., Curr Opin in Biotech. Vol 10: , 1999). Domena homologiczna charakteryzuje się motywem strukturalnym określanym jako węzeł cystyny, i jest także tą częścią białka, która zachowuje zasadniczo sekwencje peptydów odpowiedzialne za wiązanie z VEGFR-1. Dla ludzkiego i mysiego VEGF-B, domena homologiczna VEGF jest zawarta w genetycznie zmodyfikowanej formie, która obejmuje aminokwasy dojrzałych form zarówno VEGF-B 167, jak i VEGF-B 186. Domenę homologiczną VEGF w VEGF-B można także określić jako domenę wiążącą receptor (RBD). Zmodyfikowany VEGF-B wiąże się z domeną wiążącą ligandu VEGFR-1 i wykazuje aktywność w badaniu receptora chimerycznego przeznaczonym do wykazania sygnalizacji poprzez VEGFR-1 (Scotney et al., Clin Exp Pharmacol Physiol (Australia), 29 (11): , 2002). [0066] Cząsteczki VEGF-B według wynalazku obejmują ludzki VEGF-B 167 (numer dostępu NCBI AAB06274; sekwencja białka obejmuje sekwencję sygnałową), ludzki VEGF-B 186 (numer dostępu NCBI AAC50721; sekwencja białka obejmuje sekwencję sygnałową), mysie VEGF-B 167 (numer dostępu NCBI AAB06273; sekwencja białka obejmuje sekwencję sygnałową), mysie VEGF-B 186 (numer dostępu NCBI AAC52823; sekwencja białka obejmuje sekwencję sygnałową) i ich zmodyfikowane formy określane jako ludzki VEGF-B (SEQ ID NO:1) i mysi VEGF-B (SEQ ID NO:2). [0067] Sekwencja ludzkiego VEGF-B odpowiada sekwencji aminokwasów od aminokwasu 31 (H) do aminokwasu 129 (K), włącznie z sekwencją białka ludzkiego VEGF- B 167 pokazaną przez numer dostępu NCBI AAB06274, i do sekwencji aminokwasów od aminokwasu 31 (H) do aminokwasu 129 (K) włącznie z sekwencją białka ludzkiego VEGF- B 186 pokazaną przez numer dostępu NCBI AAC [0068] Sekwencja mysiego VEGF-B odpowiada sekwencji aminokwasów od

18 17 aminokwasu 31 (H) do aminokwasu 129 (K), włącznie z sekwencją białka mysiego VEGF- B 167 pokazaną przez numer dostępu NCBI AAB06273, i do sekwencji aminokwasów od aminokwasu 31 (H) do aminokwasu 129 (K) włącznie z sekwencją białka mysiego VEGF- B 186 pokazaną przez numer dostępu NCBI AAC [0069] Przeciwciałami tutaj opisanymi są chociażby te, które wiążą się z VEGF-B i blokują sygnalizację VEGF-B przez VEGFR-1, hamując przez to aktywność biologiczną indukowaną przez VEGF-B. Takie przeciwciała można skierować przeciw polipeptydowi VEGF-B albo jego części antygenowej albo części immunogennej, takim jak chociażby VEGF-B 167 albo peptydom zawierającym domenę wiążącą receptor (RBD), takim jak VEGF-B Przeciwciała, które mają zdolność blokowania sygnalizacji VEGF-B przez VEGFR-1 można wybrać używając testów bazujących na komórce albo biochemicznych, takich jak, ale nie ograniczonych do tych opisanych tutaj testów. Korzystnie, przeciwciała są skierowane przeciw ludzkiemu polipeptydowi VEGF-B albo jego immunogennych części. Korzystnie, wybiera się przeciwciała, które blokują sygnalizację ludzkiego VEGF-B. [0070] Przeciwciała według wynalazku wiążą się z ludzkim VEGF-B i hamują sygnalizację indukowaną przez ludzki VEGF-B przez VEGFR-1. [0071] Opisano przeciwciała, które wiążą się z ludzkim VEGF-B (SEQ ID NO:1) i hamują indukowaną przez VEGF-B sygnalizację przez VEGFR-1 i przeciwciała, które wiążą się z ludzkim VEGF-B RBD i hamują indukowaną przez VEGF-B sygnalizację przez VEGFR-1 i są one objęte zakresem wynalazku, jeżeli spełnione są wymagania według zastrzeżenia 1. [0072] W przypadku przeciwciał ukierunkowanych na ludzki VEGF-B, pewien poziom reaktywności krzyżowej z innymi ssaczymi postaciami VEGF-B może być pożądany w niektórych okolicznościach, takich jak, chociażby, dla potrzeb badania przeciwciał w modelach zwierzęcych na ich wpływ na konkretną chorobę i dla prowadzenia badań toksykologicznych drogą, gdzie badane antyciało wpływa na sygnalizację VEGF-B/VEGFR-1 u badanego zwierzęcia. Gatunki, gdzie reaktywność krzyżowa przeciwciała dla ludzkiego VEGF-B może być pożądana obejmują mysz, szczura, psy i małpę. Przeciwciała według wynalazku są dla ludzkiego VEGF-B i wykazują pewien poziom gatunkowej reaktywności krzyżowej dla mysiego VEGF-B ("mvegf-b"). Reaktywność krzyżowa oznacza, że przeciwciało wiąże się z wysokim powinowactwem z ludzkim VEGF-B i VEGF-B z innych gatunków i hamuje interakcję VEGF-B z VEGFR-1. Reaktywność krzyżowa dla innych antagonistów VEGF-B, takich jak antysensowne albo zakłócające RNA, oznacza, że mogą one zmniejszać ekspresję ludzkiego VEGF-B i VEGF-B z innych gatunków. [0073] Korzystne przeciwciała według wynalazku i do stosowania w sposobach opisanych w tym zgłoszeniu są krzyżowo reaktywne z VEGF-B z dwóch albo więcej gatunków i hamują indukowaną przez VEGF-B sygnalizację poprzez VEGFR-1. [0074] Przeciwciała według wynalazku wiążą się z ludzkim VEGF-B i hamują indukowaną przez mysi VEGF-B sygnalizację poprzez VEGFR-1.

19 18 [0075] Opisane są przeciwciała, które wiążą się z ludzkim VEGF-B (SEQ ID NO:1) i z mysim VEGF-B (SEQ ID NO:2), i hamują indukowaną przez VEGF-B sygnalizację poprzez VEGFR-1, i przeciwciała, które wiążą się z ludzkim VEGF-B RBD i z mysim VEGF-B RBD, i hamują indukowaną przez VEGF-B sygnalizację poprzez VEGFR-1, i są one objęte zakresem wynalazku, jeżeli spełnione są wymagania według zastrzeżenia 1. [0076] Korzystnie, przeciwciała są przeciwciałami monoklonalnymi. [0077] Najkorzystniej, przeciwciała są humanizowane, w tym deimmunizowane przeciwciała monoklonalne odpowiednie do zastosowania w terapeutyce ludzi. [0078] Ujawnia się przeciwciała, które są humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, które wiążą się z VEGF-B i blokują sygnalizację VEGFB poprzez VEGFR-1, ponieważ są humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, które wiążą się z ludzkim VEGF-B i hamują indukowaną przez VEGF-B sygnalizację poprzez VEGFR-1, np. przeciwciałami, które są humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, które wiążą się z ludzkim VEGF-B (SEQ ID NO:1) i hamują indukowaną przez VEGF-B sygnalizację poprzez VEGFR-1, przeciwciałami, które są humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, które wiążą się z ludzkim VEGF-B RBD i hamują indukowaną przez VEGF-B sygnalizację poprzez VEGFR-1, przeciwciałami, które są humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, które reagują krzyżowo z VEGFB z dwóch albo więcej gatunków i hamują indukowaną przez VEGF-B sygnalizację poprzez VEGFR-1, przeciwciałami, które są humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, które wiążą się z ludzkim VEGF-B i z mysim VEGF-B, i hamują sygnalizację VEGF-B poprzez VEGFR-1, przeciwciałami, które są humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, które wiążą się z ludzkim VEGF-B (SEQ ID NO:1), które także wiążą się z mysim VEGF-B (SEQ ID NO:2) i hamują sygnalizację VEGF-B poprzez VEGFR-1, przeciwciałami, które są humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, które wiążą się z hvegf-b RBD i które także wiążą się z mvegf-b RBD i hamują sygnalizację VEGF-B poprzez VEGFR -1. Przeciwciała takie dostarcza się jako przeciwciała według wynalazku, jeżeli spełnione są wszystkie wymagania według zastrzeżenia 1. [0079] Określenie "przeciwciało" albo "przeciwciała" obejmuje odniesienie do wszystkich różnych postaci przeciwciał, w tym, ale nie ograniczając się do: pełnych przeciwciał (np. mających nienaruszony region Fc), w tym, chociażby, przeciwciała monoklonalne; fragmenty przeciwciał wiążące antygeny, w tym chociażby fragmenty Fv, Fab, Fab' i F(ab')2; humanizowane przeciwciała, i polipeptydy pochodzące z immunoglobuliny wytwarzane przez techniki inżynierii genetycznej. O ile nie podano inaczej, terminy "przeciwciało" albo "przeciwciała" i jak tutaj stosowane, obejmują zarówno przeciwciała pełnej długości, jak i ich fragmenty wiążące antygen. [0080] O ile nie stwierdzono inaczej, specyficzność w odniesieniu do przeciwciała według wynalazku ma oznaczać, że przeciwciało wiąże się w zasadzie tylko z jego antygenem docelowym bez znaczącego wiązania z niepokrewnymi białkami. Jednakże, możliwe jest, że przeciwciało będzie zaprojektowane albo wybrane do wiązania się z dwoma albo więcej

20 19 pokrewnymi białkami. Białko pokrewne obejmuje różne połączone warianty albo fragmenty tego samego białka albo białek homologicznych z innych gatunków. Takie przeciwciała są nadal uważane za swoiste dla tych białek i są objęte zakresem tego wynalazku. Termin "zasadniczo" w tym kontekście oznacza, że nie ma wykrywalnego wiązania do niedocelowego antygenu powyżej podstawowych, tj. nieswoistych poziomów. [0081] Przeciwciała, które wiążą VEGF-B są określane jako przeciwciała anty-vegf-b. [0082] Przeciwciała według wynalazku można wytwarzać za pomocą dobrze znanych procedur. Patrz, chociażby, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). [0083] Jeden ze sposobów wytwarzania przeciwciała według wynalazku albo jak tutaj opisano zawiera immunizowanie zwierzęcia nie będącego człowiekiem, takiego jak mysz albo transgeniczna mysz, z polipeptydem VEGF-B albo jego części immunogenne, taka jak, chociażby, peptyd zawierający RBD, za pomocą którego przeciwciała skierowane przeciw polipeptydowi VEGF-B albo jego części immunogenne są wytwarzane u tego zwierzęcia. Różne sposoby zwiększenia antygeniczności danego immunogenu, takie jak podawanie adiuwantów albo skoniugowanych antygenów, zawierające antygen przeciwko któremu pożądana jest odpowiedź przeciwciała i inny [0084] komponent, są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i mogą być wykorzystywane. Immunizacje zazwyczaj obejmują wstępną immunizację, po której następuje seria immunizacji przypominających. Zwierzęta mogą być skrwawiane i w surowicy oznacza się miano przeciwciała. Zwierzęta mogą być wspierane aż do osiągnięcia plateau miana. Koniugaty można sporządzać w rekombinowanej hodowli komórek jako fuzje białkowe. Ponadto, czynniki agregujące, takie jak ałun, są odpowiednio stosowane do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. [0085] Zarówno poliklonalne jak i monoklonalne przeciwciała można wytwarzać tym sposobem. Sposoby uzyskiwania obydwu typów przeciwciał są dobrze znane w dziedzinie. Przeciwciała poliklonalne są mniej korzystne, ale są stosunkowo łatwe do wytworzenia przez iniekcję odpowiedniemu zwierzęciu laboratoryjnemu skutecznej ilości polipeptydu VEGF-B albo jego immunogennych części, pobranie surowicy od zwierzęcia i wyizolowanie przeciwciał swoistych dla VEGF-B dowolnymi znanymi technikami immunoadsorpcyjnymi. Przeciwciała wytworzone tą techniką są zwykle mniej preferowane ze względu na możliwość wystąpienia heterogeniczności produktu. [0086] Stosowanie monoklonalnych przeciwciał jest szczególnie korzystne ze względu na możliwość wytworzenia ich w dużych ilościach i homogeniczność produktu. Przeciwciała monoklonalne mogą być wytwarzane za pomocą konwencjonalnych procedur. [0087] Stosowany tutaj termin "przeciwciało monoklonalne" dotyczy przeciwciała uzyskanego z populacji zasadniczo homogenicznych przeciwciał, tj. pojedyncze przeciwciała