(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: ,WO02/12502 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/395 ( ) A61K 48/00 ( ) A61P 37/00 ( ) C07K 16/24 ( ) C07K 16/42 ( ) C12N 15/09 ( ) C12N 15/13 ( ) C12N 5/10 ( ) (54) Przeciwciało, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, rekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompozycja, przeciwciało i kompozycja do zastosowania w diagnostyce lub terapii (30) Pierwszeństwo: , US, 60/223, , US, 60/236, , US, 09/920,137 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/10 (73) Uprawniony z patentu: CENTOCOR ORTHO BIOTECH INC., Horsham, US (72) Twórca(y) wynalazku: JILL GILES-KOMAR, Downingtown, US DAVID M. KNIGHT, Berwyn, US GEORGE HEAVNER, Malavern, US BERNARD SCALLON, Collegeville, US DAVID SHEALY, Downingtown, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca polinukleotydy kodujący takie przeciwciało, rekombinowany wektor zawierający taką cząsteczkę kwasu nukleinowego, komórka gospodarza zawierająca taką cząsteczkę kwasu nukleinowego albo taki wektor, kompozycja zawierająca takie przeciwciało oraz przeciwciało i kompozycja do zastosowania w diagnostyce lub terapii. Dziedzina wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał, specyficznych dla białka czynnika martwicy nowotworu (TNF) alfa. Stan techniki TNF alfa jest rozpuszczalnym homotrimerem składającym się z białkowych podjednostek o masie 17 kd (Smith i wsp., J. Biol. Chem. 262: (1987)). Istnieje także związana z błoną prekursorowa forma TNF o masie 26 kd (Kriegler i wsp. Cell 53:45-53 (1988)). W celu zapoznania się z artykułami przeglądowymi na temat TNF zobacz Beutler i wsp., Nature 320:584 (1986); Old, Science 230:630 (1986) i Le i wsp., Lab. Invest. 56:234 (1987). Komórki inne niż monocyty lub makrofagi także wytwarzają TNF alfa. Na przykład, TNF alfa jest produkowany przez ludzkie niemonocytarne nowotworowe linie komórkowe (Rubin i wsp., J. Exp. Med. 164:1350 (1986); Spriggs i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6563 (1987)). TNF alfa wytwarzają także limfocyty T z krwi obwodowej CD4+ i CD8+ i niektóre hodowane linie komórkowe limfocytów T i B (Cuturi i wsp., J. Exp. Med. 165:1581 (1987); Sung i wsp., J. Exp. Med. 168:1539 (1988); Turner i wsp., Eur. J. Immunol. 17: (1987)). TNF alfa powoduje zmiany prozapalne, których skutkiem jest uszkodzenie tkanek, takie jak degradacja chrząstki i kości (Saklatvala, Nature 322: (1986); Bertolini, Nature 319: (1986)), indukcja cząsteczek adhezyjnych, w tym prokoagulacyjny wpływ na komórki śródbłonka naczyniowego (Pober i wsp., J. Immunol. 136:1680 (1986)), zwiększenie przylegania neutrofili i limfocytów (Pober i wsp., J. Immunol. 138:3319 (1987)) oraz stymulacja uwalniania z makrofagów, neutrofili i komórek śródbłonka naczyniowego czynnika aktywującego płytki krwi (Camussi i wsp., J. Exp. Med. 166:1390 (1987)). Obecnie są dowody na powiązanie TNF alfa z infekcjami (Cerami i wsp., Immunol. Today 9:28 (1988)), chorobami immunologicznymi, patologiami nowotworowymi (Oliff i wsp., Cell 50:555 (1987)), patologiami autoimmunologicznymi i patologiami przeszczep przeciwko gospodarzowi" (Piguet i wsp., J. Exp. Med. 166:1280 (1987)). Udział TNF alfa w chorobach nowotworowych i patologiach infekcyjnych często jest związany ze stanem katabolizmu gospodarza. U pacjentów z chorobą nowotworową często dochodzi do znacznego zmniejszenia masy ciała, zazwyczaj związanego z anoreksją (brakiem apetytu). Rozległe wyniszczenie, związane z nowotworem i innymi chorobami, zwane jest kacheksją (Kern i wsp., J. Parent. Enter. Nutr. 12: (1988)). Kacheksja obejmuje postępujące zmniejszanie masy ciała, anoreksję i ciągłą erozję beztłuszczowej masy ciała w odpowiedzi na wzrost nowotworu złośliwego. Stan kacheksji powoduje pogorszenie stanu chorobowego i zwiększenie śmiertelności związanej z nowotworem. Udowodniono, że TNF alfa jest zaangażowany w kacheksję w chorobach nowotworowych, patologiach infekcyjnych i innych stanach katabolicznych (zobacz na przykład Beutler i Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7: (1989)). Przypuszcza się, że TNF alfa odgrywa główną rolę w posocznicy wywołanej bakteriami Gram- -ujemnymi i wstrząsie endotoksycznym (Michie i wsp., Br. J. Surg. 76: (1989); Debets i wsp., Second Vienna Shock Forum, str (1989); Simpson i wsp., Crit. Care Clin. 5:27-47 (1989)), w tym w gorączce, złym samopoczuciu, anoreksji i kacheksji. Endotoksyna silnie aktywuje produkcję i sekrecję TNF alfa oraz innych cytokin przez monocyty/makrofagi (Kornbluth i wsp., J. Immunol. 137: (1986)). TNF alfa i inne cytokiny produkowane przez monocyty pośredniczą w odpowiedzi metabolicznej i neurohormonalnej na endotoksyny (Michie i wsp., New Engl. J. Med. 318: (1988)). Podawanie endotoksyny ochotnikom (ludziom) powoduje ostre zachorowanie z objawami podobnymi do grypy, takimi jak gorączka, częstoskurcz, zwiększenie tempa przemian metabolicznych i uwalnianie hormonu stresu (Revhaug i wsp., Arch. Surg. 123: (1988)). U pacjentów z posocznicą wywołaną bakteriami Gram-ujemnymi dochodzi do zwiększenia stężenia krążącego TNF alfa (Waage i wsp., Lancet 1: (1987); Hammerle i wsp., Second Vienna Shock

3 PL B1 3 Forum, str (1989); Debets i wsp., Crit. Care Med. 17: (1989); Calandra i wsp., J. Infect. Dis. 161: (1990)). TNF alfa jest zatem zaangażowany w choroby zapalne, choroby autoimmunologiczne, infekcje wirusowe, bakteryjne i pasożytnicze, nowotwory złośliwe i(lub) choroby zwyrodnieniowe układu nerwowego i jest użytecznym celem specyficznej terapii biologicznej w chorobach takich, jak reumatoidalne zapalenie stawów i choroba Crohna. Stwierdzono pożądane skutki w otwartych próbach klinicznych z chimerowym przeciwciałem monoklonalnym rozpoznającym TNF alfa (ca2) objawiające się zahamowaniem stanu zapalnego i skutecznym leczeniem po nawrocie reumatoidalnego zapalenia stawów (Elliott i wsp., Arthritis Rheum. 36: (1993) i Elliott i wsp., Lancet 344: (1994)) i choroby Crohna (Van Dullemen i wsp., Gastroenterology 109: (1995)). Pożądane wyniki, obejmujące zahamowanie stanu zapalnego, uzyskano także w badaniu klinicznym z użyciem ca2, prowadzonym metodą randomizowanej, podwójnie ślepej próby z kontrolą placebo, w reumatoidalnym zapaleniu stawów (Elliott i wsp., Lancet 344: (1994)). Przeciwciała przeciwko czynnikowi modulującemu", który scharakteryzowano jako kachektynę (która później okazała się identyczna z TNF) ujawnili Cerami i wsp. (publikacja patentowa EPO , 4 marca 1987). Stwierdzono, że takie przeciwciała są użyteczne w diagnostycznych testach immunologicznych i terapii wstrząsu w infekcjach bakteryjnych. Rubin i wsp. (publikacja patentowa EPO , 22 kwietnia 1987) ujawnił przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu TNF, hybrydomy wydzielające takie przeciwciała, sposoby otrzymywania takich przeciwciał i zastosowanie takich przeciwciał w testach immunologicznych do oznaczania TNF. Yone i wsp. (publikacja patentowa EPO , 26 października 1988) ujawnił przeciwciała anty-tnf, w tym przeciwciała monoklonalne (mab) i ich zastosowanie w immunodiagnostyce chorób, w szczególności patologii Kawasaki i infekcji bakteryjnych. W płynach ustrojowych pacjentów z chorobą Kawasaki (zespół ostrego zapalenia śluzówkowoskórno-węzłowego z gorączką u dzieci; Kawasaki, T., Allergy 16:178 (1967); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26:935 (1985)) poziom TNF jest podwyższony, i to podwyższenie wykazuje związek z postępem procesu patologicznego (Yone i wsp., jak wyżej). Inni badacze opisali mab specyficzne dla rekombinowanego ludzkiego TNF, wykazujące in vitro aktywność neutralizującą (Liang, C-M. i wsp. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: (1986); Meager, A. i wsp., Hybridoma 6: (1987); Fendly i wsp., Hybridoma 6: (1987); Bringman, T. S. i wsp., Hybridoma 6: (1987); Hirai, M. i wsp., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987); Molier, A. i wsp. (Cytokine 2: (1990)). Niektórych z tych mab użyto do mapowania epitopów ludzkiego TNF i opracowania immunologicznych testów enzymatycznych (Fendly i wsp., jak wyżej; Hirai i wsp., jak wyżej; Molier i wsp., jak wyżej) i do ułatwienia oczyszczania rekombinowanego TNF (Bringman i wsp., jak wyżej). Jednakże te badania nie dostarczają podstawy do produkcji przeciwciał neutralizujących TNF, które można byłoby wykorzystać w diagnostyce in vivo u człowieka z powodu immunogenności, braku specyficzności i(lub) odpowiedniego charakteru farmaceutycznego. U ssaków innych niż człowiek wykazano, że neutralizujące surowice odpornościowe lub mab przeciwko TNF znoszą niepomyślne zmiany fizjologiczne i chronią przed śmiercią po podaniu dawki śmiertelnej w eksperymentalnej endotoksemii i bakteriemii. Ten efekt wykazano np. w oznaczeniach śmiertelności na gryzoniach i w modelowych systemach patologii u naczelnych (Mathison, J. C. i wsp., J. Clin. Invest. 81: (1988); Beutler, B. i wsp., Science 229: (1985); Tracey, K. J. i wsp., Nature 330: (1987); Shimamoto, Y. i wsp., Immunol. Lett. 17: (1988); Silva, A. T. i wsp., J. Infect. Dis. 162: (1990); Opal, S. M. i wsp., J. Infect. Dis. 161: (1990); Hinshaw, L. B. i wsp., Circ. Shock 30: (1990)). Przypuszczalne miejsce wiązania receptora przez htnf zostało ujawnione przez Eck i Sprang (J. Biol. Chem. 264(29), (1989), którzy zidentyfikowali miejsca wiązania receptora przez TNF-α jako składające się z aminokwasów 11-13, 37-42, i Zgłoszenie PCT W091/02078 (data pierwszeństwa 7 sierpnia 1989) ujawnia ligandy TNF, które mogą wiązać się z przeciwciałami mającymi następujące epitopy: przynajmniej jeden z 1-20, i ; przynajmniej dwa z 1-20, 56-77, i ; wszystkie z 1-18, 58-65, i ; wszystkie z 1-18 i ; wszystkie z 56-79, i 135- lub ; wszystkie z 1-30, i ; wszystkie z 1-26, i ; wszystkie z 22-40, lub -97, i ; wszystkie z 12-22, 36-45, i ; zarówno 1-20 jak i 76-90; wszystkie z 22-40, 69-97, i ; wszystkie z i ; wszystkie z i 49-98; przynajmniej jeden z 22-40, i 69-97, zarówno jak i W WO 97/29131 ujawniono przeciwciała ludzkie, wiążące się z ludzkim TNFα. Przeciwciała określa się jako przeciwciała o dużym powinowactwie do ludzkiego TNFα (war-

4 4 PL B1 tość K d 10-8 M lub mniej), niewielkiej prędkości oddysocjowania od ludzkiego TNFα (wartość K off 10-3 s -1 lub mniej) i zdolne do neutralizowania aktywności ludzkiego TNFα in vitro i in vivo. Przeciwciała ssacze inne niż ludzkie, chimerowe, poliklonalne (np. surowice odpornościowe) i(lub) przeciwciała monoklonalne (MAb) i fragmenty (np. produkty trawienia proteolitycznego lub produkty ich fuzji białkowych) są potencjalnymi czynnikami terapeutycznymi, które bada się w niektórych przypadkach prób leczenia pewnych chorób. Jednakże takie przeciwciała lub fragmenty mogą wywoływać odpowiedź immunologiczną po podaniu ludziom. Skutkiem takiej odpowiedzi immunologicznej może być usuwanie przeciwciał lub fragmentów z krążenia poprzez kompleksowanie przez układ immunologiczny, co czyni powtórne podanie nieprzydatnym w terapii, zmniejszając przez to terapeutyczną korzyść dla pacjenta i ograniczając możliwość powtórnego podania przeciwciała lub fragmentu. Na przykład powtórne podanie przeciwciał lub fragmentów obejmujących fragmenty pochodzenia innego niż ludzkie może prowadzić do choroby posurowiczej i(lub) anafilaksji. W celu uniknięcia tych i innych problemów stosowano wiele metod, aby zmniejszyć immunogenność takich przeciwciał i ich fragmentów, w tym wytwarzanie chimer i humanizację, dobrze znane ze stanu techniki. Jednakże te i inne metody mogą nadal powodować pewną immunogenność przeciwciał i fragmentów, ich niskie powinowactwo, niską zachłanność wiązania lub problemy z hodowlą komórkową, zwiększeniem skali produkcji, produkcją i(lub) niską wydajnością. Takie przeciwciała lub fragmenty mogą być zatem niewystarczająco przystosowane do masowej produkcji lub zastosowania jako białka terapeutyczne. Skutkiem tego istnieje potrzeba dostarczenia przeciwciał anty-tnf lub ich fragmentów, które pozwalałyby uniknąć przynajmniej jednego z tych problemów, jak również udoskonaleń w stosunku do znanych przeciwciał lub ich fragmentów. Krótki opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało zawierające: - regiony determinujące komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego i zmienne regiony zrębowe (FR) przeciwciała mab TNV148 jak opisano na Fig. 4; oraz - regiony CDR łańcucha lekkiego i zmienne regiony FR przeciwciała mab TNV148 jako opisano na Fig. 5; - ewentualnie zawierające ponadto specyficzną substytucję proliny seryną w regionie FR3 przeciwciała mab TNV148B jak opisano na Fig. 4. Korzystnie przeciwciało zawiera regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego jednego z przeciwciał mab TNV148 i mab TNV148B jak opisano na Fig. 4 i 5. Przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, charakteryzująca się tym, że zawiera polinukleotyd kodujący przeciwciało jak określono powyżej. Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowany wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono powyżej. Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono powyżej albo wektor jak określono powyżej. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera przeciwciało jak określono powyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik. Przedmiotem wynalazku jest ponadto przeciwciało jak określono powyżej albo kompozycja jak określono powyżej do zastosowania w diagnostyce lub terapii, korzystnie do zastosowania w leczeniu choroby związanej z układem immunologicznym. Wynalazek dotyczy wyizolowanych, ludzkich, naczelnych, gryzoni, ssaczych i(lub) chimerowych przeciwciał anty-tnf, kompozycji zawierających przeciwciała anty-tnf, kodujących je kwasów nukleinowych, wektorów, komórek gospodarza, kompozycji, i ich zastosowania, jak opisano i przedstawiono tutaj w połączeniu z tym, co jest znane ze stanu techniki. Przeciwciało według wynalazku może pochodzić od dowolnego ssaka bez ograniczenia do człowieka, myszy, królika, szczura, gryzonia, naczelnego lub ich kombinacji i tym podobne. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, zawierająca polinukleotyd kodujący przeciwciało według niniejszego wynalazku, rekombinowany wektor zawierający tę cząsteczkę kwasu nukleinowego, komórka gospodarza zawierająca tę cząsteczkę kwasu nukleinowego lub wektor, kompozycja zawierająca przeciwciało i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik i przeciwciało lub kompozycja do zastosowania w diagnostyce i terapii, korzystnie, do stosowania w leczeniu chorób immunologicznych. Niniejszy opis ujawnia izolowane cząsteczki kwasów nukleinowych, obejmujące komplementarny lub hybrydyzujący do niego polinukleotyd, kodujący specyficzne przeciwciała anty-tnf, obejmujący

5 PL B1 5 przynajmniej jedną wyszczególnioną sekwencję, domenę, jej fragment lub wariant. Niniejszy opis ponadto ujawnia rekombinowane wektory zawierające te cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-tnf, komórki gospodarza, zawierające takie kwasy nukleinowe i(lub) rekombinowane wektory, jak również sposoby wytwarzania i(lub) stosowania takich kwasów nukleinowych kodujących przeciwciało, wektorów i(lub) komórek gospodarza. Przynajmniej jedno przeciwciało według wynalazku wiąże przynajmniej jeden wyszczególniony epitop specyficzny dla przynajmniej jednego białka TNF, jego podjednostki, fragmentu, części lub ich dowolnej kombinacji. Przynajmniej jeden epitop może zawierać przynajmniej jeden region wiążący przeciwciało, który zawiera przynajmniej jeden fragment tego białka, przy czym epitop ten dogodnie składa się z przynajmniej 1-5 aminokwasów przynajmniej jednej jego części, takiej jak niebędąca ograniczeniem przynajmniej jedna funkcjonalna, zewnątrzkomórkowa, rozpuszczalna, hydrofilowa, zewnętrzna lub cytoplazmatyczna domena tego białka lub dowolna jego część. Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedno izolowane przeciwciało anty-tnf, jak opisano tutaj, które wykazuje przynajmniej jedną aktywność taką, jak niebędące ograniczeniem hamowanie cząsteczek adhezyjnych produkowanych przez komórki indukowane przez TNF, hamowanie wiązania TNF z receptorem, poprawienie wskaźnika zapalenia stawów w modelu mysim, (zobacz np. Przykłady 3-7). Przeciwciało anty-tnf można więc zbadać według znanych sposobów pod względem odpowiednich aktywności takich, jak niebędąca ograniczeniem przynajmniej jedna aktywność biologiczna dla białka TNF. Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jeden sposób ekspresji przynajmniej jednego przeciwciała anty-tnf w komórce gospodarza, obejmujący hodowanie komórki gospodarza, jak opisano tutaj, w warunkach, w których przynajmniej jedno przeciwciało anty-tnf ulega ekspresji w wykrywalnych i(lub) możliwych do oczyszczenia ilościach. Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedną kompozycję zawierającą (a) wyizolowany kwas nukleinowy kodujący przeciwciało anty-tnf i(lub) przeciwciało, jak opisano tutaj; i (b) odpowiedni nośnik lub rozcieńczalnik. Nośnik lub rozcieńczalnik opcjonalnie może być dopuszczalny farmaceutycznie, stosownie do znanych nośników i rozcieńczalników. Kompozycja może opcjonalnie zawierać przynajmniej jeden dalszy związek, białko lub kompozycję. Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jeden sposób lub kompozycję z przeciwciałem anty-tnf do podawania w terapeutycznie skutecznej dawce w celu modulowania lub leczenia przynajmniej jednej związanej z TNF choroby w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta i(lub) przed wystąpieniem tej choroby, po jej wystąpieniu lub w trakcie jej występowania, jak jest to znane ze stanu techniki i(lub) opisane tutaj. Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedną kompozycję, urządzenie i(lub) sposób dostarczania terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości przynajmniej jednego przeciwciała anty-tnf według niniejszego wynalazku. Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jeden sposób lub kompozycję z przeciwciałem anty-tnf do diagnostyki przynajmniej jednej związanej z TNF choroby w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta i(lub) przed wystąpieniem tej choroby, po jej wystąpieniu lub w trakcie jej występowania, jak jest to znane ze stanu techniki i(lub) opisane tutaj. Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedną kompozycję, urządzenie i(lub) sposób dostarczenia do diagnostyki przynajmniej jednego przeciwciała anty-tnf według niniejszego wynalazku. Opis rysunków Fig. 1 jest graficzną reprezentacją przedstawiającą oznaczanie zdolności mab TNV obecnych w supernatantach komórek hybrydomy do hamowania wiązania się TNFα z rekombinowanym receptorem TNF. Różne ilości supernatantów z komórek hybrydomy zawierających znane ilości mab TNV inkubowano wstępnie z ustalonym stężeniem (5 ng/ml) TNFα wyznakowanego I 125. Mieszaninę przeniesiono do 96-studzienkowych płytek Optiplate, które wcześniej pokryto p55-sf2, białkiem fuzyjnym rekombinowany receptor TNF/IgG. Po odpłukaniu niezwiązanego materiału oznaczano ilość TNFα, która wiązała się z receptorem p55 w obecności mab i zliczono ją przy użyciu licznika gamma. Pomimo, że w tych eksperymentach przetestowano osiem próbek mab TNV, dla uproszczenia nie pokazano tutaj trzech mab, dla których wykazano poprzez analizy sekwencji DNA, że są identyczne z jednym z innych mab TNV (zobacz Rozdział 5.2.2). Każdą próbkę testowano dwukrotnie. Pokazane wyniki przedstawiają dwa niezależne eksperymenty. Fig. 2 przedstawia sekwencje DNA regionów zmiennych łańcucha ciężkiego mab TNV. Pokazany gen wyjściowy to gen DP-46. Symbol TNV" wskazuje, że pokazana sekwencja jest sekwencją

6 6 PL B1 TNV14, TNV15, TNV148 i TNV196. Pierwsze trzy nukleotydy w sekwencji TNV definiują kodon inicjacji translacji Met. Kropki w sekwencji genu mab TNV wskazują, że ten sam nukleotyd występuje w sekwencji wyjściowej. 19 pierwszych nukleotydów sekwencji TNV (podkreślone) odpowiada oligonukleotydowi użytemu do amplifikacji regionu zmiennego w reakcji PCR. Translację aminokwasów (skróty jednoliterowe) zaczynającą się po ukończeniu dojrzewania mab pokazano tylko dla genu wyjściowego. Trzy domeny CDR w sekwencji aminokwasowej dla genu wyjściowego zaznaczono pogrubieniem i podkreśleniem. Linie oznaczone jako TNV148(B) wskazują, że pokazana sekwencja występuje zarówno w TNV148, jak i w TNV148B. Przerwy w sekwencji wyjściowego DNA (CDR3) występują z tego powodu, że ten fragment nie jest znany lub nie występuje w genie wyjściowym. W łańcuchach ciężkich mab TNV użyty jest region łączący J6. Fig. 3 przedstawia sekwencje DNA regionów zmiennych łańcucha lekkiego mab TNV. Pokazany gen wyjściowy jest przedstawicielem rodziny Vg/38K ludzkich genów wyjściowych kodujących regiony zmienne kappa. Kropki w sekwencjach genu mab TNV wskazują, że jest to ten sam nukleotyd, który występuje w sekwencji wyjściowej. 16 pierwszych nukleotydów sekwencji TNV (podkreślone) odpowiada oligonukleotydowi użytemu do amplifikacji regionu zmiennego w reakcji PCR. Translację aminokwasową dojrzałego mab (skróty jednoliterowe) pokazano tylko dla genu wyjściowego. Trzy domeny CDR w translacji aminokwasowej dla genu wyjściowego zaznaczono pogrubieniem i podkreśleniem. Linie oznaczone jako TNV148 (B) wskazują, że pokazana sekwencja występuje zarówno w TNV148, jak i w TNV148B. Przerwy w wyjściowej sekwencji DNA (CDR3) występują z tego powodu, że ten fragment nie jest znany lub nie występuje w genie wyjściowym. W łańcuchach ciężkich mab TNV użyty jest region łączący J3. Fig. 4 przedstawia wywnioskowane sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego mab TNV. Pokazane sekwencje aminokwasowe (skróty jednoliterowe) zostały wywnioskowane na podstawie oznaczonej sekwencji DNA, zarówno z niesklonowanych produktów PCR, jak i ze sklonowanych produktów PCR. Pokazane sekwencje aminokwasowe są podzielone na wydzielniczą sekwencję sygnałową (sygnał), sekwencję zrębową (FW) i domeny regionu determinującego komplementarność (CDR). Sekwencję aminokwasową dla genu wyjściowego DP-46 przedstawiono w górnym wierszu dla każdej domeny. Kropki wskazują, że aminokwas w mab TNV jest identyczny, jak w genie wyjściowym. TNV148(B) wskazuje, że pokazana sekwencja występuje zarówno w TNV148, jak i w TNV148B. Symbol TNV" wskazuje, że pokazana sekwencja występuje we wszystkich mab TNV, o ile nie jest przedstawiona inna sekwencja. Kreski w sekwencji wyjściowej (CDR3) wskazują, że sekwencje nie są znane lub nie występują w genie wyjściowym. Fig. 5 przedstawia wywnioskowane sekwencje aminokasowe regionów zmiennych łańcucha lekkiego mab TNV. Pokazane sekwencje aminokwasowe (skróty jednoliterowe) zostały wywnioskowane na podstawie oznaczonej sekwencji DNA zarówno z niesklonowanych produktów PCR, jak i ze sklonowanych produktów PCR. Pokazane sekwencje aminokwasowe są podzielone na wydzielniczą sekwencję sygnałową (sygnał), sekwencję zrębową (FW) i domeny regionu determinującego komplementarność (CDR). Sekwencję aminokwasową dla genu wyjściowego kodującego łańcuch lekki typu Vg/38K pokazano w górnym wierszu dla każdej domeny. Kropki wskazują, że aminokwas w mab TNV jest identyczny jak w genie wyjściowym. TNV148(B) wskazuje, że pokazana sekwencja występuje zarówno w TNV148, jak i w TNV148B. Wszystkie" wskazuje, że pokazana sekwencja występuje w TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B i TNV186. Fig. 6 przedstawia schematyczne rysunki plazmidów ekspresyjnych, zawierających łańcuch ciężki i lekki użytych do wytworzenia komórek C466 z ekspresją rtnv148b. P1783 oznacza plazmid zawierający łańcuch ciężki, a p1776 oznacza plazmid zawierający łańcuch lekki. Domeny kodujące region zmienny i stały rtnv148b są pokazane jako czarne prostokąty. Wzmacniacze immunoglobulinowe w intronach J-C są pokazane jako szare prostokąty. Pokazane są istotne miejsca restrykcyjne. Pokazane plazmidy są zorientowane tak, że transkrypcja genów Ab przebiega w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Długość plazmidu p1783 wynosi 19,53 kb, a plazmidu p ,06 kb. Znane są kompletne sekwencje nukleotydowe obydwu plazmidów. Sekwencja kodująca region zmienny w p1783 może być łatwo zastąpiona przez inną sekwencję regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przez zastąpienie fragmentu restrykcyjnego BsiWI/BstBI. Sekwencja kodująca region zmienny w p1776 może być łatwo zastąpiona przez inną sekwencję regionu zmiennego przez zastąpienie fragmentu restrykcyjnego SalI/AflII. Fig. 7 stanowi graficzną reprezentację analiz krzywych wzrostowych pięciu linii komórkowych produkujących rtnv148b. Hodowle zainicjowano dnia 0 przez rozsianie komórek do butelek T75

7 PL B1 7 w pożywce I5Q+MHX tak, aby otrzymać gęstość żywotnych komórek 1,0 x 10 5 komórek/ml w objętości 30 ml. Hodowle komórkowe użyte w tych badaniach były hodowlami ciągłymi dopóki nie wykonano transfekcji lub subklonowań. W ciągu następnych dni komórki w butelkach T ponownie zawieszano i pobierano porcję 0,3 ml hodowli. Badania krzywej wzrostowej kończono, gdy liczebność komórek spadła poniżej 1,5 x 10 5 komórek/ml. Liczbę żywych komórek w pobranej porcji oznaczano przez barwienie barwnikiem typu błękitu trypanu, a resztę porcji zachowywano w celu późniejszego oznaczania stężenia mab. Ze wszystkich pobranych próbek w tym samym czasie wykonano test ELISA w kierunku ludzkich IgG. Fig. 8 stanowi graficzną reprezentację porównania szybkości wzrostu komórek w obecności zmieniającego się stężenia czynnika selekcyjnego MHX. Subklony komórkowe C466A i C466B rozmrożono do pożywek bez MHX (IMDM. 5% FBS, 2 mm glutaminy) i hodowano przez dwa dodatkowe dni. Obydwie hodowle komórkowe zostały następnie podzielone na trzy hodowle, które nie zawierały MHX albo zawierały 0,2X MHX lub 1X MHX. Dzień później hodowle rozsiano do świeżych butelek T75 do początkowej gęstości 1 x 10 5 komórek/ml i liczono komórki w odstępach co 24 godziny przez jeden tydzień. Policzono czas podwojenia liczby komórek podczas pierwszych 5 dni przy użyciu wzoru z SOP PD32.025; czas ten przedstawiono nad słupkami. Fig. 9 stanowi graficzną reprezentację stabilności produkcji mab w czasie dla dwóch linii komórkowych produkujących rtnv148b. Subklony komórkowe pozostające w hodowli ciągłej od chwili transfekcji i subklonowań zastosowano do zapoczątkowania długookresowych seryjnych hodowli na 24-studzienkowych płytkach hodowlanych. Komórki były hodowane w pożywce I5Q z selekcją i bez selekcji czynnikiem MHX. Komórki pasażowano w sposób ciągły przez rozsiewanie hodowli co każde 4-6 dni w celu utrzymywania nowych żywotnych hodowli, poprzednie hodowle pozostawiano zaś do wyczerpania zapasów pokarmowych. Krótko po ukończeniu hodowli zbierano porcje supernatantów z pozostawionych komórek i przechowywane je do chwili oznaczenia stężenia mab. Ze wszystkich zebranych próbek w tym samym czasie wykonano test ELISA w kierunku ludzkiej IgG. Fig. 10 przedstawia zmiany masy ciała w mysim modelu zapalenia stawów u myszy Tg 197 w odpowiedzi na przeciwciała anty-tnf według niniejszego wynalazku w porównaniu z kontrolami z Przykładu 4. Badane myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni przydzielano, na podstawie płci i masy ciała, do jednej z 9 grup i podawano im dootrzewnowo pojedynczą dużą dawkę PBS Dulbecco (D- PBS) lub przeciwciała anty-tnf według niniejszego wynalazku (TNV14, TNV148 lub TNV196) w ilości 1 mg/kg lub 10 mg/kg. Gdy masę ciała analizowano jako zmianę w stosunku do masy przed podaniem dawki, wszystkie zwierzęta podczas badania leczone 10 mg/kg ca2 wykazywały zawsze większy przyrost masy ciała niż myszy otrzymujące D-PBS. Ten wzrost masy ciała był znaczący w tygodniach 3-7. Zwierzęta otrzymujące 10 mg/kg TNV148 także osiągnęły znacząco większy wzrost masy ciała w 7 tygodniu badań. Fig. 11A-C przedstawiają progresję nasilenia objawów chorobowych mierzonych na podstawie wskaźnika zapalenia stawów (Al), jak przedstawiono w Przykładzie 4. Wskaźnik zapalenia stawów w grupach otrzymujących 10 mg/kg ca2 był niższy w porównaniu z grupą kontrolną D-PBS, od 3 tygodnia aż do końca badań (tydzień 7). U zwierząt leczonych 1 mg/kg TNV14 i zwierząt leczonych 1 mg/kg ca2 nie zaobserwowano znaczącego zmniejszenia AI po trzech tygodniach w porównaniu z grupą otrzymującą D-PBS. Porównując pomiędzy sobą grupy otrzymujące podobną dawkę (10 mg/kg ca2 w porównaniu z 10 mg/kg TNV14, 148 i 196) nie stwierdzono żadnych istotnych różnic pomiędzy grupami otrzymującymi dawkę 10 mg/kg. Przy porównaniu grup otrzymujących 1 mg/kg stwierdzono, że grupa otrzymująca 1 mg/kg TNV148 wykazywała znacząco niższy Al w tygodniu 3, 4 i 7 niż grupa otrzymująca 1 mg/kg ca2. Al w grupie otrzymującej 1 mg/kg TNV148 był także znacząco niższy w tygodniu 3 i 4 niż w grupie otrzymującej 1 mg/kg TNV14. Pomimo, że podawanie TNV196 powodowało istotne zmniejszenie Al do 6 tygodnia badań (w porównaniu z grupą otrzymującą D-PBS), grupa otrzymująca TNV148 była jedyną grupą spośród grup otrzymujących 1 mg/kg, w której zmniejszenie Al było istotne na końcu badania. Fig. 12 przedstawia zmiany masy ciała w mysim modelu zapalenia stawów u myszy Tg 197 w odpowiedzi na przeciwciała anty-tnf według niniejszego wynalazku w porównaniu z kontrolami z Przykładu 5. Badane myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni przydzielano na podstawie masy ciała do jednej z 8 grup i podawano im dootrzewnowo pojedynczą dużą dawkę środka kontrolnego (D-PBS) lub przeciwciała (TNV14, TNV148) w ilości 3 mg/kg (tydzień 0). Iniekcje powtórzono u wszystkich zwierząt w tygodniach 1, 2, 3 i 4. W grupach 1-6 oznaczano skuteczność podanego środka. W prób-

8 8 PL B1 kach surowicy uzyskanych od zwierząt z grup 7 i 8 oznaczano indukcję odpowiedzi immunologicznej i farmakokinetykę usuwania TNV14 lub TNV148 w tygodniach 2, 3 i 4. Fig. 13A-C są wykresami przedstawiającymi progresję nasilenia choroby w Przykładzie 5 na podstawie wskaźnika zapalenia stawów. Wskaźnik zapalenia stawów w grupie otrzymującej 10 mg/kg ca2 był istotnie niższy niż w grupie kontrolnej, od 2 tygodnia do końca badań (tydzień 5). U zwierząt otrzymujących 1 mg/kg lub 3 mg/kg ca2 i zwierząt otrzymujących 3 mg/kg TNV14 nie zaobserwowano żadnego istotnego zmniejszenia Al przez cały czas trwania badań w porównaniu z grupą kontrolną traktowaną D-PBS. Zwierzęta otrzymujące 3 mg/kg TNV148 wykazywały istotne zmniejszenie Al od tygodnia 3 do tygodnia 5 w porównaniu z grupą otrzymującą D-PBS. Zwierzęta otrzymujące 10 mg/kg ca2 wykazywały istotne zmniejszenie Al w 4 i 5 tygodniu badań w porównaniu z niższymi dawkami (1 mg/kg i 3 mg/kg) ca2, jak również Al w tygodniach 3-5 był istotnie niższy niż u zwierząt traktowanych TNV14. Pomimo, że nie stwierdzono żadnych istotnych różnic pomiędzy dowolną z grup leczonych dawką 3 mg/kg, wartości Al u zwierząt otrzymujących 3 mg/kg TNV14 były istotnie wyższe w pewnych punktach czasowych w porównaniu z dawką 10 mg/kg, natomiast zwierzęta otrzymujące TNV148 nie wykazywały istotnych różnic w porównaniu ze zwierzętami otrzymującymi 10 mg/kg ca2. Fig. 14 przedstawia zmiany masy ciała w mysim modelu zapalenia stawów u myszy Tg 197 w odpowiedzi na przeciwciała anty-tnf według niniejszego wynalazku w porównaniu z kontrolami z Przykładu 6. Badane myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni przydzielano na podstawie masy ciała do jednej z 6 grup i podawano im dootrzewnowo pojedynczą dużą dawkę przeciwciała (ca2 lub TNV148) w ilości 3 mg/kg lub 5 mg/kg. W tym badaniu wykorzystano grupy kontrolne, którym podano D-PBS i 10 mg/kg ca2. Fig. 15 przedstawia progresję nasilenia objawów chorobowych na podstawie wskaźnika zapalenia stawów, jak przedstawiono w Przykładzie 6. We wszystkich grupach stwierdzono pewien stopień ochrony we wczesnych punktach czasowych: w grupach otrzymujących 5 mg/kg ca2 i 5 mg/kg TNV148 wykazano istotne zmniejszenie Al w tygodniach 1-3, a we wszystkich grupach wykazano istotne zmniejszenie Al w tygodniu 2. Ponadto podczas badań u zwierząt otrzymujących 5 mg/kg ca2 stwierdzono pewien stopień ochrony z istotnym zmniejszeniem Al w tygodniach 4, 6 i 7. Niska dawka (3 mg/kg) zarówno ca2, jak i TNV148 powodowała istotne zmniejszenie Al w tygodniu 6, a we wszystkich grupach obserwowano istotnie zmniejszenie Al w tygodniu 7. Żadna z grup nie była zdolna do utrzymania istotnej redukcji do końca badań (tydzień 8). Nie stwierdzono żadnych istotnych różnic pomiędzy badanymi grupami (wyłączając grupę kontrolną traktowaną solą fizjologiczną) w dowolnym punkcie czasowym. Fig. 16 przedstawia zmiany masy ciała w mysim modelu zapalenia stawów u myszy Tg 197 w odpowiedzi na przeciwciała anty-tnf według niniejszego wynalazku w porównaniu z kontrolami w Przykładzie 7. W celu porównania skuteczności pojedynczej dootrzewnowej dawki TNV148 (otrzymanego z komórek hybrydomy) i rtnv148b (otrzymanego z komórek transfekowanych). Badane myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni przydzielano na podstawie płci i masy ciała do jednej z 9 grup i podawano im dootrzewnowo pojedynczą dużą dawkę Dulbecco PBS (D-PBS) lub przeciwciała (TNV148, rtnv148b) w ilości 1 mg/kg. Fig. 17 przedstawia progresję nasilenia objawów chorobowych mierzonych na podstawie wskaźnika zapalenia stawów, jak przedstawiono w Przykładzie 7. Wskaźnik zapalenia stawów w grupach otrzymujących 10 mg/kg ca2 był niższy w porównaniu z grupą kontrolną D-PBS, od 4 tygodnia aż do końca badań (tydzień 8). Zarówno w grupach otrzymujących TNV148, jak i w grupie otrzymującej 1 mg/kg ca2 stwierdzono istotne zmniejszenie Al w tygodniu 4. Pomimo, że wcześniejsze badanie (P ) wykazało, że TNV148 był nieco bardziej skuteczny w zmniejszaniu wskaźnika zapalenia stawów po podaniu dootrzewnowe pojedynczej dużej dawki w ilości 1 mg/kg, te badanie wykazało, że Al w grupach otrzymujących obydwie wersje przeciwciała TNV był nieco wyższy. Pomimo, że (z wyjątkiem tygodnia 6) w grupie otrzymującej 1 mg/kg ca2 Al nie był istotnie wyższy w porównaniu z grupą otrzymującą 10 mg/kg ca2, a w grupach otrzymujących TNV148 Al był istotnie wyższy w tygodniach 7 i 8, nie zaobserwowano żadnych różnic w Al pomiędzy grupami otrzymującymi 1 mg/kg ca2, 1 mg/kg TNV148 i 1 mg/kg TNV 148B w dowolnym punkcie czasowym badania. Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanych, rekombinowanych i(lub) syntetycznych, ludzkich, naczelnych, gryzoni, ssaczych, chimerowych przeciwciał anty-tnf, jak również kompozycji i kodujących cząsteczek kwasu nukleinowego zawierających przynajmniej jeden polinukleotyd kodujący przynajmniej jedno przeciwciało anty-tnf według wynalazku. Niniejszy wynalazek obejmuje także zasto-

9 PL B1 9 sowanie takich przeciwciał, na przykład w diagnostycznych i terapeutycznych kompozycjach, sposobach i urządzeniach. Stosowane tutaj terminy przeciwciało przeciwko czynnikowi martwicy nowotworu alfa", przeciwciało anty-tnf", część przeciwciała anty-tnf" lub fragment przeciwciała anty-tnf" i(lub) wariant przeciwciała anty-tnf" i tym podobne dotyczą dowolnego białka lub peptydu zawierającego cząsteczkę, która obejmuje przynajmniej część cząsteczki immunoglobulinowej takiej, jak niestanowiący ograniczenia region determinujący komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego lub lekkiego lub ligand wiążący jego fragment, region zmienny łańcucha ciężkiego lub lekkiego, region stały łańcucha ciężkiego lub lekkiego, region zrębowy lub dowolny jego fragment lub przynajmniej jeden fragment receptora TNF lub białka wiążącego, które można włączać do przeciwciała według niniejszego wynalazku. Takie przeciwciało może ponadto opcjonalnie oddziaływać ze specyficznym ligandem, w taki sposób niebędący ograniczeniem, że przeciwciało moduluje, zmniejsza, zwiększa, działa w sposób antagonistyczny, agonistyczny, minimalizuje, blokuje, hamuje, znosi i(lub) interferuje z przynajmniej jedną aktywnością lub wiązaniem TNF lub z aktywnością lub wiązaniem receptora TNF, in vitro, in situ i(lub) in vivo. Jako nieograniczający przykład można podać, że odpowiednie przeciwciało anty-tnf, wyszczególniony fragment lub wariant może wiązać przynajmniej jeden TNF lub jego wyszczególnione fragmenty, warianty lub domeny. Odpowiednie przeciwciało anty-tnf, jego wyszczególniony fragment lub wariant może także opcjonalnie wpływać na przynajmniej jedną aktywność lub funkcję TNF, jak niebędąca ograniczeniem synteza RNA, DNA lub białka, uwalnianie TNF, przekazywanie sygnałów do receptora TNF, błonowe cięcie TNF, aktywność TNF, produkcja i(lub) synteza TNF. Ponadto sugeruje się, aby termin przeciwciało" obejmował przeciwciała, fragmenty po trawieniu, ich wyszczególnione fragmenty i warianty, w tym mimetyki przeciwciał lub fragmenty przeciwciał, które naśladują strukturę i(lub) funkcję przeciwciała lub jego wyszczególnionego fragmentu lub części. Funkcjonalne fragmenty obejmują fragmenty wiążące antygen, które wiążą się ze ssaczym TNF. Na przykład niniejszy wynalazek obejmuje fragmenty zdolne do wiązania TNF lub ich części, w tym, ale bez ograniczenia do fragmentów Fab (wytworzonych np. przez trawienie papainą), Fab' (wytworzonych np. przez trawienie pepsyną i częściową redukcję) i F(ab') 2 (wytworzonych np. przez trawienie pepsyną), facb (wytworzonych np. przez trawienie plazminą), pfc' (wytworzonych np. przez trawienie pepsyną lub trawienie plazminą), Fd (wytworzonych np. przez trawienie pepsyną, częściową redukcję i ponowną agregację), Fv lub scfv (wytworzonych np. przez techniki biologii molekularnej) (zobacz np. Colligan, Immunology, jak wyżej). Takie fragmenty można otrzymywać przez cięcie enzymatyczne, przy użyciu technik syntezy lub rekombinacji genetycznej, które są znane ze stanu techniki i(lub) opisane tutaj. Przeciwciała można wytwarzać w postaci różnych form skróconych przy użyciu genów przeciwciał, w których na lewo od naturalnego miejsca końca translacji wprowadzono jeden lub większą liczbę kodonów stop. Na przykład kombinacja genu kodująca fragment F(ab') 2 łańcucha ciężkiego może być tak zaprojektowana, żeby zawierała sekwencje DNA kodujące domenę CH 1 i(lub) region łączący łańcucha ciężkiego. Różne fragmenty przeciwciał można ze sobą łączyć chemicznie przy użyciu klasycznych technik lub wytwarzać jako jeden fragment białkowy przy użyciu technik inżynierii genetycznej. Stosowany tutaj termin przeciwciało ludzkie" dotyczy przeciwciała, w którym zasadniczo każda część białka (np. CDR, region zrębowy, C L, domeny C H (np. C H 1, C H 2, C H 3 ), region łączący (V L, V H )) jest zasadniczo nieimmunogenny dla ludzi, z niewielkimi tylko zmianami sekwencji lub odstępstwami. Podobnie przeciwciała oznaczone jako przeciwciała naczelnych (małpa, pawian, szympans itp.) gryzoni (mysz, szczur, królik, świnka morska, chomik i tym podobne) i innych ssaków wskazują dany gatunek, podrodzaj, rodzaj, podrodzinę i rodzinę. Ponadto, przeciwciała chimerowe zawierają kombinacje powyższych. Takie zmiany lub odstępstwa opcjonalnie i dogodnie utrzymują lub eliminują immunogenność u ludzi lub innych gatunków w porównaniu z przeciwciałami niemodyfikowanymi. Ludzkie przeciwciało jest więc różne od przeciwciała chimerowego lub humanizowanego. Należy podkreślić, że przeciwciało ludzkie może być wytwarzane przez zwierzę inne niż człowiek lub przez komórkę prokariotyczną lub eukariotyczną, zdolną do ekspresji funkcjonalnie zmienionych genów ludzkich immunoglobulin (np. łańcucha ciężkiego i(lub) łańcucha lekkiego). Ponadto, jeżeli ludzkie przeciwciało jest przeciwciałem o pojedynczym łańcuchu, może ono zawierać peptyd łączący, który nie występuje w natywnych ludzkich przeciwciałach. Na przykład Fv może zawierać peptyd łączący, taki jak dwie do ośmiu glicyn lub innych reszt aminokwasowych, które łączą region zmienny łańcucha ciężkiego i region zmienny łańcucha lekkiego. Takie peptydy łączące uznaje się za peptydy pochodzenia ludzkiego.

10 10 PL B1 Można także zastosować przeciwciała bispecyficzne, heterospecyficzne, heterokoniugaty lub podobne, które są monoklonalne, jeżeli są to przeciwciała ludzkie lub humanizowane i wykazują specyficzność wiązania z przynajmniej dwoma różnymi antygenami. W tym przypadku, jedna ze specyficzności wiązania dotyczy przynajmniej jednego białka TNF, inna zaś dowolnego innego antygenu. Sposoby wytwarzania specyficznych przeciwciał są znane ze stanu techniki. Tradycyjnie, rekombinowana produkcja bispecyficznych przeciwciał opiera się na koekspresji dwóch par: łańcuch ciężki- -łańcuch lekki immunoglobuliny, gdzie dwa łańcuchy ciężkie mają różną specyficzność (Milstein i Cuello, Nature 305:537 (1983)). Z powodu losowego łączenia się łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobuliny te hybrydomy (kwadromy) produkują potencjalną mieszankę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedna ma właściwą strukturę bispecyficzną. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, które zazwyczaj wykonuje się metodą użyciu chromatografii powinowactwa, jest dość trudne, a wydajność jest mała. Podobne procedury ujawniono np. w WO 93/08829, patentach USA nr , , , , , , , , , , , , , , , , , , , WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker i wsp., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh i wsp., Methods in Enzymology 121:210 (1986). Przeciwciała anty-tnf (określane także jako przeciwciała TNF) według niniejszego wynalazku można opcjonalnie scharakteryzować pod względem wysokiego powinowactwa w wiązaniu się z TNF i mogą one opcjonalnie wykazywać niską toksyczność. W szczególności przeciwciało według niniejszego wynalazku jest szczególnie użyteczne w niniejszym wynalazku, jeżeli jego poszczególne składniki, takie jak region zmienny, region stały, region zrębowy, każdy z osobna lub wszystkie razem opcjonalnie i dogodnie wykazują niską immunogenność. Przeciwciała, które można zastosować w niniejszym wynalazku, są opcjonalnie scharakteryzowane pod względem możliwości ich stosowania u pacjentów przez dłuższy czas przy mierzalnej poprawie objawów chorobowych oraz niskiej i(lub) akceptowalnej toksyczności. Na osiągnięte rezultaty terapeutyczne mogą składać się niska lub akceptowalna immunogenność i(lub) wysokie powinowactwo, jak również inne pożądane właściwości. Niską immunogenność" definiuje się tutaj jako wywoływanie istotnej odpowiedzi HAHA, HACA lub HA- MA u mniej niż około 75% lub zwłaszcza mniej niż około 50% leczonych pacjentów i(lub) uzyskiwanie niskiego miana u leczonych pacjentów (mniejszego niż około 300, zwłaszcza mniejszego niż około 100 w enzymatycznym teście immunologicznym z podwójnym antygenem) (Elliott i wsp., Lancet 344: (1994). Zastosowanie Izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku można zastosować do otrzymania przynajmniej jednego przeciwciała anty-tnf lub jego wyszczególnionego wariantu, którego można użyć do pomiaru lub wpływu na komórkę, tkankę, narząd lub zwierzę (w tym na ssaki i ludzi), do diagnostyki, monitorowania, modulowania, leczenia, ulżenia cierpieniu, ułatwienia zapobiegania skutkom lub zmniejszenia objawów chorobowych przynajmniej jednego stanu chorobowego związanego z TNF, wybranego spośród, ale nieograniczającego się do zaburzenia lub choroby immunologicznej, zaburzenia lub choroby sercowo-naczyniowej, zaburzenia lub choroby infekcyjnej, związanej z nowotworem złośliwym lub choroby układu nerwowego. Taki sposób może obejmować podawanie skutecznej dawki kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej zawierającej przynajmniej jedno przeciwciało anty-tnf komórce, tkance, narządowi, zwierzęciu lub pacjentowi potrzebującemu takiej modulacji, leczenia, ulżenia w cierpieniu, profilaktyki lub zmniejszenia objawów, skutków lub mechanizmów. Skuteczna dawka może obejmować ilość od około 0,001 do 500 mg/kg przy podawaniu pojedynczej dawki (np. pojedynczej dawki w dużej ilości), podawaniu wielokrotnym lub ciągłym lub ilość pozwalającą osiągnąć, przy podawaniu dawki pojedynczej, podawaniu wielokrotnym lub ciągłym, stężenie w surowicy 0, μg/ml lub dowolnego innego zakresu lub wartości w nim zawartej, co przeprowadza się i oznacza przy użyciu znanych sposobów, jak opisano tutaj lub jest to znane ze stanu techniki. Cytowania Wszystkie publikacje lub patenty cytowane tutaj przedstawiają stan techniki w chwili opracowywania niniejszego wynalazku i(lub) dostarczają opisu i wykonania niniejszego wynalazku. Publikacje są dowolnymi publikacjami naukowymi lub patentowymi lub informacjami dostępnymi na dowolnym nośniku, na przykład nagraniami, dokumentami elektronicznymi lub drukowanymi. Specyficznie wymienione są poniższe pozycje piśmiennictwa: Ausubel i wsp., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY ( ); Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Labo-

11 PL B1 11 ratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan i wsp., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY ( ); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, ( ). Przeciwciała według niniejszego wynalazku Przynajmniej jedno przeciwciało anty-tnf według niniejszego wynalazku może być opcjonalnie wytwarzane przez linię komórkową, mieszaną linię komórkową, komórkę unieśmiertelnioną lub klonalną populację komórek unieśmiertelnionych, jak jest to dobrze znane ze stanu techniki. Zobacz np. Ausubel, i wsp., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY ( ); Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, i wsp., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY ( ); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, ( ). Można wytwarzać ludzkie przeciwciała, skierowane specyficznie przeciwko ludzkim białkom TNF lub ich fragmentom, przeciwko odpowiedniemu immunogennemu antygenowi, takiemu jak wyizolowany antygen i(lub) białko TNF lub jego fragment (w tym cząsteczki syntetyczne, takie jak syntetyczne peptydy). Podobnie można wytwarzać inne specyficzne lub ogólne ssacze przeciwciała. Antygeny immunogenne i przeciwciała monoklonalne można wytwarzać przy użyciu dowolnej dogodnej techniki. W jednej z metod hybrydomę wytwarza się przez fuzję odpowiedniej unieśmiertelnionej linii komórkowej (np. linia komórkowa szpiczaka, taka jak między innymi Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A lub podobna, lub heteroszpiczaków, ich produktów fuzyjnych lub dowolnych pochodzących z nich komórek lub fuzji komórkowych, lub dowolnej odpowiedniej linii komórkowej, znanej ze stanu techniki. Zobacz np. i podobne z komórkami wytwarzającymi przeciwciała, takimi jak, lecz bez ograniczenia, wyizolowane lub sklonowane komórki śledziony, krwi obwodowej, chłonki, migdałka lub z innych komórek, limfocyty B lub dowolne inne komórki z ekspresją sekwencji stałych, zmiennych, zrębowych lub CDR łańcucha ciężkiego lub lekkiego zarówno w postaci endogennego, jak i heterologicznego kwasu nukleinowego, rekombinowane lub endogenne, wirusowe, bakteryjne, pochodzące z glonów, prokariotyczne, pochodzące ze zwierząt ziemnowodnych, owadzie, gadzie, rybie, ssacze, pochodzące z gryzoni, zwierząt jednokopytnych, dwukopytnych, kozie, owcze, pochodzące z naczelnych, eukariotyczne, genomowe DNA, cdna, rdna, mitochondrialne DNA lub RNA, chloroplastowe DNA lub RNA, hnrna, mrna, trna, jednoniciowe, dwuniciowe, trójniciowe, hybrydyzowane i tym podobne lub jako dowolna ich kombinacja. Zobacz np. Ausubel, jak wyżej, i Colligan, Immunology, jak wyżej, rozdział 2. Komórki produkujące przeciwciała można także uzyskać z krwi obwodowej lub, dogodniej, ze śledziony lub węzłów chłonnych ludzi lub innych odpowiednich zwierząt, które immunizowano antygenem będącym przedmiotem zainteresowania. Do ekspresji heterologicznego lub endogennego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało, jego wyszczególnionego fragmentu lub wariantu, zgodnie z niniejszym wynalazkiem można użyć dowolnej innej odpowiedniej komórki gospodarza. Fuzje komórkowe (hybrydomy) lub komórki rekombinowane można wyizolować przy użyciu selektywnych warunków hodowli lub innych znanych odpowiednich sposobów i klonować przez rozcieńczenie do pojedynczych komórek lub przez sortowanie komórek lub innymi znanymi sposobami. Komórki produkujące przeciwciała z pożądaną specyficznością można wyselekcjonować przez zastosowanie odpowiedniego oznaczenia (np. testu ELISA). Można zastosować inne odpowiednie sposoby wytwarzania lub izolacji przeciwciał o wymaganej specyficzności, w tym, lecz bez ograniczenia, sposoby służące do selekcji rekombinowanego przeciwciała z biblioteki peptydowej lub biblioteki białek (np. niebędąca ograniczeniem biblioteka bakteriofagów, rybozymów, oligonukleotydów, RNA, cdna lub podobna, biblioteka bazująca na prezentacji, np. dostępna w Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, Wielka Brytania; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, Niemcy; Biovation, Aberdeen, Szkocja, Wielka Brytania; BioInvent, Lund, Szwecja; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA, USA; Ixsys. Zobacz np. EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/ (5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); W090/14443; W090/14424; W090/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754; (Scripps);