Inżynieria genetyczna

Transkrypt

1 Inżynieria genetyczna i technologia rekombinowanego DNA Dr n. biol. Urszula Wasik Zakład Biologii Medycznej Inżynieria genetyczna świadoma, celowa, kontrolowana ingerencja w materiał genetyczny organizmów w celu zmiany ich właściwości dziedzicznych CEL: 1. Uzyskanie organizmów o zmienionych właściwościach (GMO) 2. Produkcja białek rekombinowanych 1

2 Białka rekombinowane Białka uzyskiwane z rekombinowanych genów, czyli cząsteczek DNA, złożonych z różnych fragmentów kw. nukleinowych. wydajna produkcja peptydów, białek Białka rekombinowane w kosmetologii czynnik wzrostu naskórka, EGF (ang. Epidermal Growth Factor) stymuluje, wzrost, proliferację, różnicowanie komórek - przyśpiesza proces regeneracji - ma działanie przeciwzapalne czynnik wzrostu fibroblastów, FGF (ang. Fibroblast Growth Factor) - stymuluje syntezę kolagenu 2

3 Białka rekombinowane w kosmetologii tropoelastyna tworzy elastynę która występuję w tkance łącznej - wydzielana jest przez fibroblasty do macierzy pozakomórkowej Białka rekombinowane transkrypcja translacja fałdowanie bioreaktor 3

4 Dlaczego białko lepiej wyprodukować niż wyizolować z tkanki? Zalety: wydajność jakość immunogenność Immunogenność zdolność substancji do wywołania przeciwko sobie swoistej odpowiedzi odpornościowej 4

5 Informacja genetyczna W przemyśle biotechnologicznym najlepszym źródłem informacji jest ludzki organizm. Podobieństwo genetyczne między Homo sapiens a innymi gatunkami 98,8% 67% 90% 82% 5

6 Bioreaktory I Izolacja informacji genetycznej Dostarczenie do komórki docelowej Ekspresja genu w komórce docelowej Selekcja, oczyszczanie białka Bioreaktory 6

7 Bioreaktory I Izolacja informacji genetycznej Dostarczenie do komórki docelowej (transfekcja) Ekspresja genu w komórce docelowej Selekcja, oczyszczanie białka Izolacja informacji genetycznej Ludzki genom: 3 mld pz genów Chromatyna jądrowa ~ 2m 7

8 Izolacja informacji genetycznej transkrypcja translacja fałdowanie W inżynierii genetycznej izolowaną informacją jest RNA a nie DNA. DNA Dlaczego??? mrna 8

9 Izolacja informacji genetycznej Dlaczego izolujemy mrna a nie DNA? 1. mrna nie zawiera intronów co jest kluczowe w przypadku wykorzystania informacji genetycznej przez komórki prokariotyczne. Splicing (składanie genu, wycinanie intronów) usunięcie intronów (sekwencji niekodujących) i połączenie eksonów (sekwencji kodujących) Izolacja informacji genetycznej W komórkach prokariotycznych splicing NIE zachodzi. 9

10 Izolacja informacji genetycznej Dlaczego izolujemy mrna a nie DNA? 2. mrna jest krótszym odcinkiem kwasu nukleinowego niż DNA. Manipulacji długimi odcinkami kwasów nukleinowych jest bardzo trudna i często niemożliwa. Bioreaktory I Izolacja informacji genetycznej mrna odwrotna transkrypcja cdna 10

11 Izolacja informacji genetycznej -odwrotna transkrypcja odwrotna transkrypcja proces przepisania jednoniciowego RNA przez enzym odwrotną transkryptazę (RT) na dwuniciowy DNA. Izolacja informacji genetycznej -PCR Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (z ang. polymerase chain reaction) metoda cyklicznego powielania łańcuchów DNA 1. Wyodrębnienie informacji np. cdna kodujące FGF 2. Namnożenie informacji Kary Mullis 11

12 Izolacja informacji genetycznej -PCR Matrycowy DNA Primery 5 3 Primer Primer Polimeraza Taq dntp T A G C Buffor (Mg 2+, DMSO, NaCl, Tris) Izolacja informacji genetycznej -PCR denaturacja hybrydyzacja elongacja 12

13 Izolacja informacji genetycznej -PCR przyrost produktu w czasie = 2 n (n-liczba cyklu) 1 polimerazadna, ~2h PCR Oczyszczanie namnożonego DNA (usuwamy składniki reakcji PCR) elektroforeza agarozowa 13

14 Izolacja informacji genetycznej -elektroforeza agarozowa Elektroforeza agarozowa - rozdział DNA w polu elektrycznym. Cząsteczki migrują w żelu o określonym usieciowieniu. Gęstość usieciowienia, określa zdolność rozdzielczą żelu. Zależy ona ściśle od stężenia agarozy. Otrzymanie informacji genetycznej 1. izolacja mrna 2. odwrotna transkrypcja otrzymanie cdna 3. PCR namnożenie ściśle określonej informacji 4. elektroforeza agarozowa otrzymanie informacji genetycznej w odpowiedniej ilości i o odpowiednim stopniu czystości 14

15 Bioreaktory I Izolacja informacji genetycznej Dostarczenie informacji do komórki docelowej Ekspresja genu w komórce docelowej Selekcja, oczyszczanie białka Bakteryjne systemy ekspresyjne Pałeczka okrężnicy Escherichia coli BIOREAKTOR 15

16 Dostarczenie informacji do komórki docelowej wektor Wektor cząsteczka kwasu nukleinowego służąca do przenoszenia obcego DNA, zawiera sekwencje które umożliwiają ekspresję wprowadzonego genu. Plazmid nośnik informacji Kolista cząsteczka DNA występująca w komórce poza chromosomem i zdolna do autonomicznej replikacji Wielkość insertu (fragment DNA który wprowadzamay do plazmidu) pz 16

17 Bakteryjne systemy ekspresyjne Narzędzia molekularne: enzymy restrykcyjne ligazy wektory insert cięcie ligacja wektor gotowy konstrukt Bakteryjne systemy ekspresyjne - klonowanie 1. DNA donorowy poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym. 17

18 Dostarczenie informacji do komórki docelowej enzymy restrykcyjne Enzymy restrykcyjne zostały wyizolowane z wielu gatunków bakterii, w których pełnią funkcję obrony przed obcym DNA (np. wirusami), należą do grupy endonukleaz, przecinają nici DNA w środku cząsteczki. Bakteryjne systemy ekspresyjne Narzędzia molekularne: enzymy restrykcyjne ligazy wektory insert cięcie ligacja wektor gotowy konstrukt 18

19 Dostarczenie informacji do komórki docelowej - ligacja Ligazy DNA są enzymami łączącymi dwa fragmenty DNA poprzez tworzenie wiązań fosfodiestrowych między grupą 3 OH deoksyrybozy i grupą fosforanową ( 5 P) przy wykorzystaniu energii z hydrolizy ATP. Bakteryjne systemy ekspresyjne - klonowanie 1. DNA donorowy poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym. 2. Ligacja wektora z fragmentami donorowego DNA wprowadzone DNA plazmid rekombinowany 19

20 Bakteryjne systemy ekspresyjne - klonowanie 1. DNA donorowy poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym. 2. Ligacja wektora z fragmentami donorowego DNA 3. Transformacja - wprowadzenie DNA do komórek bakterii. Dostarczenie informacji do komórki docelowej Transformacja wprowadzenie informacji genetycznje do komórki prokariotycznej (bakteryjnej) Transfekcja - wprowadzenie informacji genetycznje do komórki eukariotycznej za pomocą wektorów niewirusowych Transdukcja - wprowadzenie informacji genetycznej do komórki eukariotycznej za pomocą wektorów wirusowych 20

21 Dostarczenie informacji do komórki docelowej nośniki DNA Jon lub związek chemiczny, obdarzony ładunkiem dodatnim, umożliwiający zneutralizowanie ładunku ujemnego kwasu nukleinowego i jego wniknięcie do komórki : jony wapnia dekstran liposomy kationowe polipeptydy dendrymery Dostarczenie informacji do komórki docelowej transformacja bakterii Transformację bakterii przeprowadza się w trzech etapach: przygotowanie komórek kompetentnych traktowanie komórek chlorkiem wapnia transformacja komórek kompetentnych zastosowanie szoku cielplnego selekcja transformantów 21

22 Dostarczenie informacji do komórki docelowej nośniki DNA, jony wapnia Dostarczenie informacji do komórki docelowej elektroporacja Odmianą transformacji jest elektroporacja. W tej metodzie mieszaninę DNA i bakterii poddaje się krótkiemu (5-10 msec) pulsowi prądu. 22

23 Bioreaktory I Izolacja informacji genetycznej Dostarczenie do komórki docelowej Ekspresja genu w komórce docelowej Selekcja, oczyszczanie białka Ekspresja genu w komórce docelowej Wektory ekspresyjne umożliwiają ekspresję wstawionej do nich sekwencji DNA kodującej białko. W ich budowie występuje: 1. Sekwencje promotorową silny promotor umiejscowiony przed miejscem wprowadzenia sekwencji kodującej. Może być konstytutywny albo regulowany. 23

24 Ekspresja genu w komórce docelowej 2. Terminator transkrypcji - za sekwencją kodującą 3. Sekwencja Shine-Dalgarno (SD=RBS) - miejsce wiązania rybosomów bakteryjnych. Bioreaktory I Izolacja informacji genetycznej Dostarczenie do komórki docelowej Ekspresja genu w komórce docelowej Selekcja, oczyszczanie białka 24

25 Selekcja 1. Czy komórka biorcy posiada plazmid? TAK 2. Czy plazmid zawiera informację genetyczną? Selekcja Marker I pozwiala odróżnić bakterie posiadające plazmid od takich, które go nie zawierają. Jako markery najczęściej stosuje się geny oporności na antybiotyki (np. ampicylinę lub tetracyklinę). 25

26 Selekcja Marker II ten marker pozwala odróżnić bakterie, które pobrały plazmid bez wstawki, od takich, które otrzymały plazmid zrekombinowany, czyli zawierający wstawkę. Gen reporterowy - gen kodujący białko, którego obecność lub aktywność biochemiczną można w łatwy sposób oznaczyć w komórce (in vivo) poprzez wykorzystanie technik autoradiograficznych, spektrofotometrycznych lub bio- i chemiluminescencyjnych. 26

27 Selekcja Marker II, gen letalny Selekcja zrekombinowanych klonów może zachodzić przez zahamowanie namnażania się komórek zawierających niezrekombinowany plazmid. Takie wektory zawierają gen letalny dla komórki gospodarza. Insercja klonowanego DNA inaktywuje ekspresję letalnego genu umożliwiając wzrost rekombinantów. Oczyszczanie białka Oczyszczanie białka - dla każdego białka powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania, wykorzystujący jego własności fizykochemiczne i biologiczne. 27

28 Oczyszczanie białka Oczyszczanie białka Rekombinowane białko może być obecne : we wnętrzu komórki bakteryjnej w przestrzeni periplazmatycznej w środowisku zewnętrznym 28

29 Wady bakteryjnych systemów ekspresji Bakterie nie są zdolne do przeprowadzania mechanizmów modyfikacji potranslacyjnej, takich jak np. cięcia enzymatyczne, glikozylacja. W większości przypadków są one kluczowe dla prawidłowej aktywności białek eukariotycznych. Produkty wytwarzane w systemach bakteryjnych mogą być zatem niestabilne lub nieaktywne biologicznie. Alternatywne do systemów bakteryjnych systemy ekspresji białek 29

30 Saccharomyces cerevisiae Zalety: jednokomórkowe prosta hodowla geny w nich klonowane mogą zawierać sekwencje intronowe powstające białka mogą podlegać modyfikacjom potranslacyjnym Wektory drożdżowe DNA wprowadza się do komórki na kilka sposobów, np. poprzez elektroporację lub usunięcie ściany komórkowej, to znaczy otrzymywanie protoplastów. Przykładowym produktem otrzymywanym w drożdżach jest insulina oraz, stosowany jako szczepionka, powierzchniowy antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B. 30

31 Komórki ssacze Wykorzystuje się mysie lub ludzkie linie komórek ssaczych. Przykładowo białko ludzkiego czynnika VIII (podawane osobom chorym na hemofilię) wytwarza się w liniach komórkowych chomika poddanych wcześniej transfekcji 186kpz fragmentem ludzkiego genomowego DNA. Komórki ssacze W porównaniu z komórkami mikroorganizmów komórki ssaków cechują się wolniejszym tempem translacji i fałdowania. W związku z tym są one lepszymi gospodarzami w przypadku produkcji białek błonowych. Ich wadą jest jednak stosunkowo niska wydajność idąca w parze z wysokimi kosztami całego procesu. 31

32 Bakulowirusy Infekują bezkręgowce Do hodowli bakulowirusów wykorzystuje się komórki owadzie. Znajdujący się w genomie bakulowirusów gen białka poliedryny zastąpuje się genem docelowym, który w ten sposób łatwo zostaje przeniesiony do komórek owadzich i ulega ekspresji na późnym etapie infekcji. Bakulowirusy - produkcji antywirusowego białka - β-interferonu oraz erytropoetyny stosowanej u pacjentów cierpiących na anemię. 32

33 GMO - adenowirusy Adenowirusy to wirusy o genomie długości ok. 36 kpz zawierającym ds DNA, nie posiadające otoczki, mogą infekować duży wachlarz typów komórek, także nie dzielące się i są w miarę łagodne. nie powodują żadnych ludzkich chorób (bo przy braku adenowirusa są defektywne replikacyjnie) Mają dość dużą pojemność (tylko ok. 4% genomu wirusa jest niezbędna) Mogą dostarczać DNA niedzielącym się komórkom W naturalnej formie wbudowują geny do chromosomów gospodarza co pozwala na przedłużoną ekspresję transgenu Genetycznie modyfikowane organizmy Dzięki zastosowaniu metod inżynierii genetycznej zdołano skonstruować między innymi owce i kozy wydzielające do mleka odpowiedniki ludzkich białek. 33

34 Genetycznie modyfikowane organizmy Wydzielane na zewnątrz mleko jest produkowane w dużych ilościach i może być zbierane bez szkody dla wytwarzającego je zwierzęcia. Ponadto zawiera ono niewiele rodzajów białek, co znacznie ułatwia W ten sposób produkuje się m.in. czynnik IX (krzepnięcie krwi) i białko osocza α1-antytrypsynę. Wykorzystanie zwierząt transgenicznych jest jednak bardzo kosztowne i budzi wiele kontrowersji na tle etycznym. Wada wektorów wirusowych Wbudowanie informacji genetycznej do genomu jest nieprzewidywalne 34

35 4uNFY 35