Ekspresja białek w komórkach ssaczych

Transkrypt

1 Ekspresja białek w komórkach ssaczych

2 Ekspresja białek w komórkach ssaczych Używane powszechnie w laboratoriach ssacze linie komórkowe są zmodyfikowane w celu pełnienia roli gospodarza ekspresji białek heterologicznych defektywnymi wirusami stanowiącymi cześć układu ekspresyjnego z wprowadzonym do tych komórek wektorem plazmidowym Praca z tymi liniami komórkowymi wymaga przestrzegania zasad pracy z mikroorganizmami patogennymi

3 Ekspresja białek w komórkach ssaczych Linie komórkowe ssacze - zapewniają zróżnicowane mechanizmy postranslacyjnej modyfikacji białek charakterystycznych dla komórek eukariotycznych - zapewniają możliwości badania interakcji białek wystawianych na powierzchni komórek ssaczych z innymi białkami, - zapewniają możliwości ekspresji białek posttranslacyjnie zmodyfikowanych do pożywki hodowlanej

4 Pierwsza generacja ssaczych układów ekspresyjnych Ekspresja przejściowa Trudności w procesie klonowania Małe wydajności produkcji białek rekombinowanych Ograniczona ilość komórek gospodarza

5

6 Ssacze wektory ekspresyjne Ori replikacji zazwyczaj wirusa SV40 Promotory pochodzące z wirusów zwierzęcych lub genów ssaczych ulegających wysokiej ekspresji: SV40 CMV HSV (herpes simplex virus)

7 Markery selekcyjne

8 Markery selekcyjne Metortreksat (MTX) Zabija komórki nieposiadające reduktazy dihydrofolianowej Komórki gospodarza pozbawione są DHFR Wektory niosą gen DHFR Sulfoksymina metioniny (MSX) Toksyczna dla komórek Syntetaza glutaminy (GS) powoduje oporność na MSX Wektor zawiera GS Zwiększając stężenie MSX wybieramy komórki posiadające największą ilość kopii klonowanych genów Genetycyna (G418) Blokada translacji Fosfotransferaza neomycyny (npt) powoduje oporność na G418

9 Elementy systemu kontrolujące translację

10 Systemy produkcji dwóch (kilku) polipeptydów System wykorzystujący dwa wektory System eksprymujący kasetę złożoną z dwóch genów System bicistronowy

11 System wykorzystujący dwa wektory Klonowanie do dwóch wektorów Dwa markery selekcyjne Kotransfekcja

12 System wykorzystujący dwa wektory

13 Uwagi Różna ilość kopii plazmidów Różna siła promotorów Możliwość utraty jednego z plazmidów

14 System eksprymujący kasetę złożoną z dwóch genów Każdy z genów stanowi odrębną jednostkę transkrypcyjną Każdy z genów posiada swój własny promotor i miejsce polia Możliwość otrzymywania różnych ilości białek ze względu na różnice w wydajności transkrypcji i translacji różnych genów

15 System eksprymujący kasetę złożoną z dwóch genów

16 System bicistronowy Geny pod kontrolą jednego promotora stanowią jedną jednostkę trankrypcyjną Powstaje jeden mrna Konieczna jest obecność rbs Sekwencja IRES (Internal Ribosomal Entry Site) z ssaczych wirusów

17

18 Ekspresja białek w komórkach ssaczych linie komórkowe Ssacze linie komórkowe CHO-K1 linia komórkowa wyprowadzona w 1957 roku z jajnika chomika chińskiego COS-1 linia komórek wyprowadzona z fibroblastów nerek małpich HEK-293 linia komórkowa wyprowadzona z embrionalnych ludzkich komórek nerek

19 Ekspresja białek w komórkach ssaczych 1. Stabilne linie komórkowe (ekspresja konstytutywna) a. integracja z genomem b. episomal plasmid EBNA293 system 2. Stabilne linie komórkowe (ekspresja indukowana integracja z genomem) a. MEL cell system b. pcytts system c. T-Rex system (Tetracycline-Regulated Expression, Invitrogen ) 3. Ekspresja przejściowa e.g. Semliki Forest Virus

20 Transient Expression Systems, TES Transient expressions Systems, TES w systemie tym ekspresja białek zachodzi tylko przez ściśle określony okres czasu Komórki ssacze są transfekowane ekspresyjnym wektorem plazmidowym nie posiadającym markera selekcyjnego, co prowadzi do jego utraty już po kilku kolejnych pasażach tej linii komórkowej

21 Countinuous Expression Systems in stably transfected cell lines, CES Countinuous Expression Systems in stably transfected cell lines, CES - w systemie tym uzyskujemy stabilne linie komórkowe umożliwiające ekspresję białek heterogenicznych System ten różni się od TES, iż równolegle z transfekcją ekspresyjnym wektorem plazmidowym, przeprowadza się także transfekcje z wektorem plazmidowym niosącym marker selekcyjny (np. gen oporności na neomycynę)

22 Wektory plazmidowe systemów TES i CES dla komórek ssaczych (Novagen) W systemach TES i CES wykorzystuje się te same wahadłowe plazmidowe wektory ekspresyjne Do najczęściej wykorzystywanych wektorów należy wektor plazmidowy ptandem-1firmy Novagen

23 Wektory plazmidowe systemów TES i CES Wektor serii ptandem-1 jest przykładem wektora w którym można prowadzić równoległą ekspresję dwóch białek, w układzie bicistronowym Obecność dwóch sekwencji MCS po dwóch stronach regionu IRES zawierającego wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu

24 Wektory plazmidowe systemów TES i CES Ekspresja genu wklonowanego za regionem IRES jest niższa od ekspresji genu wklonowanego tuż za promotorem Zazwyczaj jest ona niższa od 3 do 40 razy i zależy od charakteru białka kodowanego przez gen wklonowany za regionem IRES

25 Wektory plazmidowe systemów TES i CES Wektor ptandem-1 zawierają wczesny promotor wirusa CMV, oraz terminator króliczej globiny Sygnał transkrypcyjny z promotora CMV jest wzmocniony sekwencją wirusowego wzmacniacza transkrypcji

26 Wektory plazmidowe systemów TES i CES Wektor ptandem-1 posiada intron, który został tak zaprojektowany by ułatwić mrna proccesing i transport do retikulum endoplazmatycznego

27 Wektory plazmidowe systemów TES i CES Z elementów prokariotycznych ta seria wektorów wahadłowych zawiera: Ori puc zapewnia wysoką ilość kopii plazmidu w E. coli, potrzebną do uzyskania wystarczającej masy DNA potrzebnego na etapie transfekcji komórek eukariotycznych Prokariotyczny marker selekcyjny, gen oporności na ampicylinę Amp (bla)

28 ptk-neo, wektor plazmidowy używany w konstrukcji stabilnych ssaczych lini komórkowych w systemie CES Gen oporności na neomycynę pod kontrolą słabego promotora kinazy tymidynowej W celu uzyskania stabilnych ekspresyjnych linii komórkowych należy dokonać kotransfekcji dwoma wektorami plazmidowymi tj. plazmidem ptk-neo i plazmidem ptandem-1 Następnie pasażować linie komórkowe na pożywkach zawierających antybiotyk G-418

29 Wektory hybrydowe serii ptriex Wektory serii ptriex pozwalają na ekspresję wklonowanego genu w trzech różnych układach ekspresyjnych: bakteryjnych, owadzich i ssaczych

30 Wektory hybrydowe serii ptriex Jednoczesna możliwość ekspresji tego samego białka w eukariotycznych systemach ekspresyjnych może być użyteczna w celu uzyskania posttranslacyjnych modyfikacji lub zapewnić odmienne warunki składania białka niż w cytoplazmie komórek bakteryjnych

31 Wektory hybrydowe serii ptriex Nie posiadają owadzich lub ssaczych markerów selekcyjnych tj. ptriex-1.1, ptriex-2, ptriex-3, ptriex-4, wektory te są wykorzystywane zarówno w systemach owadzich lub ssaczych typu TES jak i CES Posiadają geny oporności na neomycynę lub hygromycynę np. ptriex-2 Hygro, ptriex-2 Neo i nie wymagają dla uzyskania stabilnych linii komórkowych kotransfekcji z wektorami ptk-neo (linie kom. ssaczych) lub pie1-neo (linie kom. owadzich)

32 Wektory hybrydowe serii ptriex

33 pbc1 Milk Expression Vector Kit Invitrogen

34

35 pbc1 Milk Expression Wydajny system ekspresji Produkcja białek rekombinowanych w mleku potomstwa Stabilne modyfikacje posttranslacyjne (niezależne od warunków)

36 pbc1 Milk Expression 1. Konstrukcja plazmidów rekombinantowych 2. Transformacja E. coli 3. Przygotowanie DNA plazmidowego 1. Odpowiednie stężenie DNA pikolitry na kom. jajową 2. Stężenie DNA 1-10 μg/ml (w przypadku stężenia mniejszego niż 1 μg/ml spada wydajność otrzymywania transgenów w przypadku stężenia większego niż 10 μg/ml spada przeżywalność embrionów)

37 pbc1 Milk Expression 1. Odpowiednia czystość DNA 1. Roztwór zawierający DNA musi być pozbawiony śladów fenolu, agarozy, enzymów, etanolu...) 2. Oczyszczanie 3. Elektroelucja z żelu agarozowego 4. Wirowanie w gradiencie CsCl 5. Mikrodializa 2. Odpowiedni skład buforów do mikroiniekcji 4. Do mikroiniekcji można używać 1. Superzwiniętego DNA 2. Linearnego DNA (5x większa wydajność integracji)

38 pbc1 Milk Expression 5. Konstrukcja myszy transgenicznych (CD-1) 1. mikrojniekcji poddaje się komórek jajowych 2. sprawdzenie przynajmniej 100 transgenicznych myszy 1. przeprowadzenie biopsji z ogona 3. sprawdzanie integracji całego transgenu (gwarancja unikania transgenów po rearanżacjach) 1. PCR 2. southern blot 6. Przygotowanie transgenicznych myszy do laktacji 7. Zbieranie mleka

39 pbc1 Milk Expression 7. Testowanie mleka: 1. rozcieńczenie 2. SDS PAGE 3. Western blot 8. Oczyszczanie rekombinowanych białek z mleka

40

41