(54) Sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych, przeciwciała naturalne

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data 1 numer zgłoszenia międzynarodowego , PCT/EP95/04239 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W096/14340, PCT Gazette nr 22/96 (11) (13) B1 (51) IntCl7 C12N 15/31 C07K 16/18 C07K 16/30 A61K 39/395 G01N 33/53 (54) Sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych, przeciwciała naturalne i preparaty cytotoksyczne (30) Pierwszeństwo: ,IT,MI94A (73) Uprawniony z patentu: ZETESIS S.P A, Milano, IT (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/97 (72) Twórcy wynalazku: Alberto Bartorelli, Milano, IT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/01 (74) Pełnomocnik: Ostrowska Elżbieta, POLSERVICE PL B1 ( 5 7 ) 1. Sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych rozpoznających białko, które można wyekstrahować z narządów ssaków, rozpoznawane przez przeciwciała monoklonalne wydzielane przez hybrydoma zdeponowane w ECACC pod numerami dostępu lub , obecne w około 92% ludzkich nowotworów o postaci stałej, znamienny tym, że polega na wykrywaniu immunokompleksu między tymi przeciwciałami naturalnymi a tymi, ewentualnie wyznakowanymi, białkami. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że immunokompleks wykrywa się stosując drugie wyznakowane przeciwciało, skierowane przeciwko antygenom danego gatunku. 3. Przeciwciała naturalne rozpoznające białka, które można wyekstrahować z narządów ssaków, rozpoznawane przez przeciwciała monoklonalne wydzielane przez hybrydoma zdeponowane w ECACC pod numerami dostępu lub i obecne w około 92% ludzkich nowotworów o postaci stałej. 4. Preparaty cytotoksyczne zawierające przeciwciała lub surowice hiperimmunologiczne, wytworzone poprzez immunizację zwierząt lub ludzi białkami, które można wyekstrahować z wątroby koziej, stosując kwas nadchlorowy, i rozpoznawane przez przeciwciała monoklonalne wydzielane przez hybrydoma zdeponowane w ECACC pod numerami dostępu lub

2 Sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych, przeciwciała naturalne i preparaty cytotoksyczne Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych rozpoznających białko, które można wyekstrahować z narządów ssaków, rozpoznawane przez przeciwciała monoklonalne wydzielane przez hybrydoma zdeponowane w ECACC pod numerami dostępu lub , obecne w około 92% ludzkich nowotworów o postaci stałej, znamienny tym, że polega na wykrywaniu immunokompleksu między tymi przeciwciałami naturalnymi a tymi, ewentualnie wyznakowanymi, białkami. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że immunokompleks wykrywa się stosując drugie wyznakowane przeciwciało, skierowane przeciwko antygenom danego gatunku. 3. Przeciwciała naturalne rozpoznające białka, które można wyekstrahować z narządów ssaków, rozpoznawane przez przeciwciała monoklonalne wydzielane przez hybrydoma zdeponowane w ECACC pod numerami dostępu lub i obecne w około 92% ludzkich nowotworów o postaci stałej. 4. Preparaty cytotoksyczne zawierające przeciwciała lub surowice hiperimmunologiczne, wytworzone poprzez immunizację zwierząt lub ludzi białkami, które można wyekstrahować z wątroby koziej, stosując kwas nadchlorowy, i rozpoznawane przez przeciwciała monoklonalne wydzielane przez hybrydoma zdeponowane w ECACC pod numerami dostępu lub * * * Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych, przeciwciała naturalne i preparaty cytotoksyczne. Preparaty te służą do wykrywania naturalnych przeciwciał rozpoznających białka, które można wyekstrahować z narządów ssaków, o masie cząsteczkowej wynoszącej około 14 kda, wykazujących działanie przeciwnowotworowe po podaniu gatunkom ksenogenicznym. W patencie W092/10197 opisano substancje białkowe, uzyskiwane poprzez ekstrakcję z narządów ssaków, szczególnie z wątroby, z zastosowaniem roztworu kwasu nadchlorowego i hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej. Wyizolowano i dokonano częściowego sekwencjonowania (włoskie zgłoszenie patentowe nr MI ) jednej ze wspomnianych substancji, o masie cząsteczkowej wynoszącej około 14 kda. Substancja ta okazała się głównym białkiem odpowiedzialnym za obserwowane właściwości biologiczne, a mianowicie za działanie przeciwnowotworowe i zdolność do podwyższania, po podaniu jej zwierzętom gatunków różnych od gatunku, od którego substancja pochodzi, poziomu przeciwciał zdolnych do rozpoznawania antygenów nowotworowych. We wspomnianym włoskim zgłoszeniu patentowym opisano również dwa przeciwciała monoklonalne, wydzielane przez hybrydoma, zdeponowane w Europejskim Zbiorze Hodowli Komórek Zwierzęcych (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wielka Brytania, pod numerami i , rozpoznające epitopy wspólne dla antygenów nowotworu i dla opisanego białka o masie cząsteczkowej 14 kda, pochodzącego z wątroby koziej (zwanego w dalszym ciągu niniejszego opisu UK-114), stosowane jako antygen przy wytwarzaniu hybrydoma.

3 Obecnie stwierdzono, że przeciwciała naturalne, rozpoznające zarówno allogeniczne, jak i ksenogeniczne białka, które można wyekstrahować z narządów (zwłaszcza z wątroby), wykazujące wyżej opisane właściwości i obecne w około 92% nowotworów ludzkich o postaci stałej, krążą w surowicy ssaków. Wytwarzanie tych przeciwciał, obecnych zwykle w niskim mianie (<1/100) w surowicy zdrowych zwierząt lub ludzi, można pobudzać, wstrzykując odpowiedni antygen i wywołując znaczący wzrost miana i zdolności surowicy do wytwarzania działania cytotoksycznego przeciwko komórkom nowotworowym. Niezależnie od możliwych interpretacji obserwowanego działania i znaczenia obecności naturalnych przeciwciał przeciwko UK-114, interpretacji nie mających znaczenia dla niniejszego wynalazku, omawiane przeciwciała i sposoby ich wykrywania są korzystne w zastosowaniach diagnostycznych, rokowniczych i leczniczych. I tak, w pierwszym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób immunologicznego wykiywania naturalnych przeciwciał przeciwko UK-114. Przedmiotem niniejszego wynalazku są również oczyszczone przeciwciała przeciwko UK-114 i ich zastosowanie w diagnostyce, leczeniu i immunocytochemii. Sposoby wykrywania naturalnych przeciwciał są typu konwencjonalnego i mogą polegać na reakcjach bezpośrednich, kompetycyjnych lub typu sandwich. W protokołach można stosować techniki podłoży stałych lub techniki immunoprecypitacji. Przeciwciała i/lub antygeny typu UK-114, stosowane w immunotestach, znakuje się odpowiednio enzymami (np. w technikach ELISA) lub związkami radioaktywnymi lub fluorescencyjnymi, barwnikami lub pigmentami itd. Sygnał immunokompleksu można ewentualnie wzmacniać za pomocą systemu biotyna-awidyna. Dobór konfiguracji sposobu i odpowiednich materiałów pozostaje w zakresie umiejętności przeciętnego technika. Stwierdzono również, że przeciwciała przeciwko UK-114, obecne w surowicy pacjentów leczonych białkami opisanymi w W092/10197 lub oczyszczonym UK-114 wykazują in vitro i in vivo działanie cytotoksyczne i cytolityczne przeciwko ludzkim komórkom nowotworowym. Wynalazek, w kolejnym wykonaniu, zapewnia również kompozycję cytolityczną i cytotoksyczną, zawierającą przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, lub surowice hiperimmunologiczne, wytwarzane przez poddanie organizmów ludzkich lub zwierzęcych immunizacji za pomocą białek ekstrahowanych z wątroby koziej z zastosowaniem kwasu nadchlorowego i rozpoznawanych przez przeciwciała monoklonalne wydzielane przez hybrydoma zdeponowane w ECACC pod numerami dostępu lub In vivo, działanie cytotoksyczne osiąga szczyt kilka dni po podaniu antygenu (UK-114 lub UK-101) i powoli zmniejsza się w następnych tygodniach. W przeciwieństwie do tego, miano przeciwciał przeciwko UK-114 typu IgG powoli rośnie w czasie, oceniane metodą ELISA. Można zatem sądzić, że pierwszy szczyt cytotoksyczności spowodowany jest przez przeciwciała typu IgM i/lub inne składowe surowicy, dotychczas niezidentyfikowane. Niemniej nie ulega kwestii znaczenie sposobów umożliwiających oznaczanie przeciwciał i/lub cytotoksyczności w celu zapewnienia odpowiedniego monitorowania leczenia. Przeciwciała według wynalazku, naturalne lub monoklonalne, można podawać pozajelitowo w dawkach dostatecznych dla uzyskania działania cytotoksycznego. Odpowiednie sposoby podawania są w zasadzie identyczne, jak znane ze stanu techniki sposoby podawania szczepionek, przeciwciał lub surowic hiperimmunologicznych. W niniejszym wynalazku, i następujących poniższych przykładach 2-4, podano dalsze wskazówki zastosowania diagnostycznego i leczniczego wyżej opisanych przeciwciał. Następujące przykłady ilustrują wynalazek bardziej szczegółowo. Przykład 1. Do 100 μl nadchlorowego wyciągu z wątroby koziej (W092/10197; UK-101) dodano 2,5% SDS i 5% merkaptoetanol. Próbki ogrzewano przez 5 minut do temperatury 100 C i 4 μl poddano analizie SDS-PAGE, stosując urządzenie PHAST SYSTEM (Pharmacia) na żelu poliakrylamidowym o gradiencie 8/25 (Pharmacia). Zamiast tego można stosować żele homogenne, nawet o wysokiej gęstości. Rozdzielone białka przeniesiono ele ktroforetycznie, stosując urządzenie Phast-Transfer (Pharmacia). Błonę nitrocelulozową (0,22 μ)

4 uprzednio zrównoważono w buforze Tris (25 mm) glicynowym (192 mm), do którego dodano 20% metanolu. Cykl przeprowadzono przy napięciu 5V przez 20 minut (I A/cm2). Następnie, po pasażu saturacyjnym, dla uniknięcia wiązania nieswoistego, błonę poddano inkubacji z badaną surowicą. Wiązanie ewentualnie obecnego przeciwciała wykrywa się za pomocą drugiego przeciwciała skierowanego przeciwko antygenom ludzkim, wyznakowanego odpowiednio do metody kolorymetrycznej, radioimmunometrycznej lub chemiluminescencyjnej. Przykład 2. Test immunoabsorpcji enzymozależnej (ELI SA) do wykrywania przeciwciał przeciwko UK-114 Zastosowano następujące bufory: (A) 50 mm dwuwęglanu sodowego o ph 8,5 (B) 50 mm fosforanu sodowego o ph 7,2 (C) 50 mm fosforanu sodowego o ph 7,4 0,1% (stężenie wagowe) NaN3 (D) 40 mm fosforanu potasowego o ph 7,4, 150 mm NaCl, 0,02% (stężenie wagowe) NaN3, 0,05% (objętościowo) Tween 20 (E) 50 mm fosforanu sodowego o ph 7,4, 0,1% (stężenie wagowe) NaN3, 0,1% (stężenie wagowe) BSA (F) 50 mm fosforanu sodowego o ph 7,4, 150 mm NaCl, 0,1% (stężenie wagowe) NaN3, 0,5% (stężenie wagowe) BSA wolnego od proteaz 0,05% (objętościowo) Tween 20, 0,5% (objętościowo) prawidłowej surowicy koziej. 3,5 ml UK-114 (3,5 mg) w buforze A zmieszano z 9 µl Biotyny NHS-LC (S.p.A., Mediolan) w stężeniu 2 mg/ml w sulfotlenku dwumetylowym. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 22 C przez 3 godziny i dializowano przez 24 godziny w temperaturze 4 C przeciwko kilku zmianom stężenia bufora B w rurce dializacyjnej Spectrapor 6 (odcięcie 3500 D). Mikrozagłębienia pokryto 100 µl biotyny BSA (5 µg/ml w buforze E) na 24 godziny w temperaturze 4 C, następnie przepłukano i potraktowano 100 µi streptawidyny (5 (ig/ml w buforze E). Po drugiej inkubacji przez noc w temperaturze 4 C zagłębienia przepłukano i poddano obróbce 100 jol UK-114-biotyny w różnych stężeniach (2,1 i 0,5 (Jg/ml w buforze E) przez 24 godziny w temperaturze 4 C. Po przepłukaniu zagłębienia zablokowano. Podobnemu procesowi poddano zagłębienia nie pokryte antygenem z tym wyjątkiem, że zamiast etapu z roztworem UK-114-biotyny zastosowano trzeci etap inkubacji z buforem E. W etapie płukania dodawano trzykrotnie 300µ µl/zagłębienie bufora D. Blokowanie przeprowadzono dodając 300 µl bufora C zawierającego 10% sacharozy i różne czynniki blokujące: 1% i 5% bydlęcą albuminę surowicy, 1% glicynę, 1% BSA z dodatkiem 3% poliwinylopirolidonu, 5% prawidłowej surowicy koziej. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej roztwór blokujący usunięto, a zagłębienia wysuszono w komorze próżniowej, po czym przechowywano opakowane w folię polietylenową i aluminiową w temperaturze 4 C aż do użycia. Test ELISA Próbki surowicy i kontroli ujemnej rozcieńczono w stosunku 1:21 w buforze F przed wykonaniem testu. Do pokrytych zagłębień dodano 100 µl próbek i roztworów standardowych (1, 2, 4 i 8 U/ml w buforze F) i całość inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia we wstrząsarce poziomej ( obr./min). Zagłębienia przepłukano następnie czterokrotnie 300 jµi bufora D, a następnie 100 µl roztworu kozich przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkim IgG, wyznakowanych peroksydazą chrzanową rozpuszczonych w buforze Stabilgen w stosunku 1:3000. Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej we wstrząsarce poziomej ( obr./min) płytki przepłukano i wywołano, stosując 100 µl roztworu Blue Star (H20 2/TMB). Po inkubacji w temperaturze pokojowej (18-24 C) przez 15 minut reakcję zatrzymano, dodając 100 pi 1 M H2S04, i odczytano gęstość optyczną (OD), stosując fotometr o podwójnej długości fal, 450 i 630 nm, jako referencyjną długość fal. Próbki o OD wyższej od wzorca 8 U/ml poddawano przed badaniem dalszemu rozcieńczeniu. Stężenie próbek obliczano z krzywej standardowej.

5 Oznaczanie miana u pacjentów poddawanych immunoterapii Ocena miana przeciwciał przeciwko UK-114 prowadzona u pacjentów poddawanych leczeniu UK-101 wykazuje odpowiedź przeciwciał większą od wartości podstawowych u 28% pacjentek z rakiem sutka i 46% pacjentów z rakiem okrężnicy po zaledwie 15 dniach po podaniu UK-101 (cztery wstrzyknięcia podskórne). Po 40 dniach od rozpoczęcia leczenia UK-101 u, odpowiednio, 63% i 97% pacjentów z rakiem okrężnicy i pacjentek z rakiem sutka można stwierdzić wzrost miana przeciwciał przeciwko UK-114 (fig. 1 i 2). Przykład 3. Działanie cytotoksyczne przeciwciał skierowanych przeciwko UK-114 na linie komórek nowotworowych Do badań cytotoksyczności zastosowano linie komórek nowotworowych KATO-III (rak żołądka) i NICH (drobnokomórkowy rak płuc), odpowiednio, dodatnie i ujemne w barwieniu powierzchniowym, przeciwciałem monoklonalnym wydzielanym przez hybrydoma P3D1DII, zdeponowanym w ECACC pod nr i króliczym przeciwciałem poliklonalnym skierowanym przeciwko UK-114 (rab), poprzez immunofluorescencję pośrednią. Cytotoksycz ność oceniano jako odsetek uwalniania 51Cr z linii komórkowych inkubowanych przez różny czas z różnymi stężeniami mab P3D1DII, króliczych Ab skierowanych przeciwko UK-114 (Rb anty-uk-114 Ab) lub całkowicie odmiennego przeciwciała monoklonalnego lub poliklonalnego, zastosowanego jako kontrola, w obecności źródła dopełniacza heterologicznego (świnka morska) lub homologicznego, lub w obecności oczyszczonych monocytów ludzkich. Stwierdzono, że zarówno mab P3D1DII, jak i rab anty-uk114 indukowały w KATO-III cytotoksyczność zależną od dopełniacza, której kontrolne, odmienne przeciwciała nie indukowały; cytotoksyczności tej nie stwierdzono również wtedy, gdy jako źródło dopełniacza stosowano surowice poddane inaktywacji cieplnej lub pozbawione C9. Cytotoksyczność pojawiała się znowu wtedy, gdy do surowicy pozbawionej C9 dodawano oczyszczone C9. Ponadto, Rb anty-uk-114 Ab indukowało zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC) przy zastosowaniu jako punktu docelowego KATO-III, natomiast odmienne Rb Ab takiej cytotoksyczności nie indukowało. Preabsorpcja anty-uk-114 Ab przy zastosowaniu oczyszczonego antygenu znosiła cytotoksyczność indukowana przez przeciwciała. Dla NICH, przeciwnie, nie obserwowano cytotoksyczności zależnej od dopełniacza ani ADCC. Wyniki te sugerują że przeciwciała anty-uk-114 wykazują potencjalną cytotoksyczność zależną od dopełniacza i cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał w liniach komórek nowotworowych wykazujących na powierzchni ekspresję antygenu UK-114. Przykład 4. Cytotoksyczność in vivo przeciwciał przeciwko UK-114 u nagich myszy po przeszczepie ksenogenicznym linii ludzkich komórek nowotworowych Nagim myszom podano podskórnie 1 x 106 ludzkich komórek gruczolakoraka okrężnicy HT29. Po 8 godzinach myszom podano w miejsce nowotworu po 0,2 ml króliczej surowicy hiperimmunologicznej skierowanej przeciwko UK-114 (miano 1/12), wytworzonej przez króliki immunizowane UK-114. Leczenie powtarzano w dniach 7, 11, 14, 18, 21 i 25 od podania komórek nowotworowych. Drugiej grupie myszy podawano, w podobny sposób, surowice od pacjentów nowotworowych, u których stwierdzano kliniczną odpowiedź na podawanie UK-114 i którzy wytwarzali przeciwciała przeciwko UK-114. Grupa kontrolna otrzymywała tylko rozczynnik. W grupie leczonej wykazano statystycznie znamienny wzrost długości życia i zmniejszenie przyjmowania się nowotworów. Stwierdzono również znamienne wydłużenie latencji nowotworu w grupie leczonej w porównaniu z grupą kontrolną. Dla przykładu w poniższej tabeli podano wyniki uzyskane przy stosowaniu króliczej surowicy odpornościowej i surowicy ludzkie

6 Leczenie Przyjęcie się nowotworu Latencja (dni) Przeżycie (dni) Kontrola 12/ Królicza surowica anty-uk-114 2/ Ludzka surowica anty-uk-114 5/ FIG. 1 Wzrost stężenia przeciwciał skierowanych przeciwko OK 114 u pacjentów z rakiem okrężnicy podczas leczenia UK 101 czas leczenia (dni) FI G. 2 Wzrost stężenia przeciwciał skierowanych przeciwko OK 114 u pacjentek z rakiem sutka podczas leczenia UK 101 czas leczenia (dni) Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.