Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów:

Transkrypt

1 Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: 1. Otrzymanie pożądanego odcinka DNA z materiału genetycznego dawcy 2. Wprowadzenie obcego DNA do wektora 3. Wprowadzenie wektora, niosącego w sobie DNA dawcy do komórek biorcy, w taki sposób by DNA dawcy połączył się trwale z DNA biorcy

2 Wektor transformacji - niewielka cząsteczka DNA mająca zdolność przenoszenia obcego DNA oraz zdolność do autonomicznej replikacji.

3 Cechy dobrego wektora: 1. Dobrze poznany biologicznie i genetycznie 2. Zawiera pojedyncze miejsce restrykcyjne rozpoznawane przez przynajmniej jeden enzym restrykcyjny 3. Posiada geny tzw. markerów selektywnych 4. Miejsce restrykcyjne nie może znajdować się w pobliżu genów markerów selektywnych 5. Posiada co najmniej jedną sekwencję startu replikacji 6. Posiada gen tzw. replikacji luźnej 7. Nie zawiera genów stanowiących zagrożenie dla człowieka lub środowiska

4 Figure 2.17 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

5 Figure 2.18 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

6 Przygotowanie wektora transformacji DNA wektora rekombinacja in vitro 1. Trawienie tym samym enzymem restrykcyjnym DNA dawcy 2. Ligacja 3. Namnażanie Wektor zrekombinowany z insertem

7 Figure 2.15 (part 2 of 3) Genomes 3 ( Garland Science 2007)

8 Figure 2.15 (part 3 of 3) Genomes 3 ( Garland Science 2007)

9 Metoda transformacji roślin za pomocą Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens plazmid Ti (tumor inducing) choroba guzowatość korzeni (crown-gall) Agrobacterium rhizogenes plazmid Ri (root inducing) choroba włosowatość korzeni (hairy-gall)

10 Guzowate narośla (tumory) wywołane infekcją Agrobacterium tumefaciens

11

12 Schemat budowy plazmidu Ti LB i RB T-DNA Rejon vir ori KO tra

13 Cechy charakterystyczne T-DNA: 1. Ma zdolność trwałej integracji z genomem rośliny 2. Za przeniesienie i integrację T-DNA odpowiedzialne są sekwencje graniczne (LB i RB), które mają identyczną budowę i wyróżniają się zachowawczą lokalizacją we wszystkich typach plazmidów Agrobacterium 3. Usunięcie fragmentu DNA plazmidowego z obszaru między sekwencjami granicznymi i wstawienie w to miejsce DNA dawcy, nie zakłóca procesów przeniesienia i integracji T- DNA z DNA rośliny 4. Stanowi 5-10% DNA plazmidu

14 Markery Marker genetyczny gen występujący przynajmniej w dwóch łatwo rozróżnialnych postaciach (allelach), dziedziczenie którego można śledzić w czasie krzyżówki genetycznej, co umożliwia ustalenie pozycji genu na mapie

15 Cechy dobrego markera: 1. Silny polimorfizm (obecność wielu form allelicznych) 2. Dziedziczenie kodominujące 3. Wysoka frekwencja i równomierne rozłożenie w genomie 4. Neutralność selekcyjna (brak sprzężenia z genami obniżającymi płodność) 5. Wysoka powtarzalność 6. Prosta i szybka metoda wykrywalności

16 Rodzaje markerów 1. Markery cech morfologicznych 2. Markery molekularne Izoenzymy Markery DNA

17 Izoenzymy rozmaite molekularne formy enzymów o podobnej bądź identycznej specyficzności wobec substratu, występujące w tym samym organiźmie. Wg. Merket`a i Moller`a są to odmienne formy molekularne enzymów otrzymanych podczas separacji różnymi technikami rozdzielczymi.

18 Typy A i E reprezentują dwie homozygotyczne formy rodzicielskie izozymów o różnej ruchliwości elektroforetycznej. A B D E Typy B i D przedstawiają możliwe formy heterozygotyczne izozymów. Typ B otrzymujemy w przypadku, gdy badany enzym jest monomeryczny. Typ C spotykamy w przypadku, gdy badany enzym jest dimerem. Pośredni prążek powstaje z jednej podjednostki typu A i z jednej typu E oraz wykazuje pośrednią ruchliwość Typ D obrazuje cetramer. Trzy pośrednie prążki powstają przez elektroforetyczną. połączenie w różnych kombinacjach podjednostek typu A i E.

19 Marker DNA Sekwencja DNA występująca w dwóch lub większej liczbie łatwych do rozróżnienia wersji i której z tego powodu można użyć do zaznaczenia pozycji na mapie

20 Rodzaje markerów DNA Oparte na procesie hybrydyzacji: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Fingerprinting na bazie oligonukleotydów

21 Rodzaje markerów DNA Oparte na PCR (Polymerase Chain Reaction) RAPD STS CAPS AFLP

22 RAPD - random amplified polymorphic DNA (losowo amplifikowany polimorficzny DNA) reakcja PCR z jednym tylko starterem (12 nukleotydowy lub krótszy), który przyłącza się w sposób losowy do komplementarnych miejsc w zdenaturowanym DNA rezultat - wiele odcinków DNA, które rozdzielane są elektroforetycznie, a każdemu odcinkowi odpowiada jeden locus

23 STS ( sequence-tagged site) - miejsce znaczone sekwencyjnie stanowi unikatową w obrębie genomu, krótką sekwencję (ok pz) identyfikującą specyficzny locus amplifikacja STS wymaga zastosowania dwóch starterów długości ok. 20 nukleotydów produkt - jeden prążek na żelu elektroforetycznym (unikatowy region genomu), odpowiadający wielkością wyznaczonemu do amplifikacji fragmentowi

24 RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych Trawienie genomowego DNA enzymem restrykcyjnym o specyficznym miejscu rozpoznania Rozdział elektroforetyczny produktów trawienia

25 RFLP

26 RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych znakowanie radioaktywnymi cząstkami lub fluorochromami specyficznych sekwencji nukleotydów (sond) hybrydyzacja w celu identyfikacji genów lub określonych sekwencji