Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo?

Transkrypt

1 Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo?

2 Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych sekwencjach nukleotydów Hybrydyzacja zachodzi już przy komplementarnych odcinkach długości kilkunastu (17) nt W hybrydyzacji kwasów nukleinowych mogą powstawać struktury hybrydowe różnego typu: DNA:DNA RNA:RNA DNA:RNA

3 Jak za pomocą takiego zjawiska jakim jest hybrydyzacja kwasów nukleinowych pokazać np. lokalizację (położenie) genu w chromosomie?

4 Żeby wykorzystać hybrydyzację (jako narzędzie badawcze) należy spełnić przynajmniej dwa warunki: 1. Dysponować tzw. sondą molekularną czyli znanym, odpowiednio przygotowanym fragmentem DNA (lub RNA) 2. Umieścić docelowy kwas nukleinowy (np. chromosomalne DNA, w którym szukamy odcinka komplementarnego do sondy molekularnej) na specjalnym stałym nośniku - filtrze (membranie) (prawie zawsze konieczne.)

5 Sonda molekularna Sonda molekularna musi być wyznakowana czyli wyposażona w znacznik (radioaktywny lub nieradioaktywny), który umożliwi jej uwidocznienie a zarazem zlokalizowanie docelowej (czyli zhybrydyzowanej z nią) sekwencji

6 Sondy można znakować : radioaktywnie - do sondy włączany jest nukleotyd znakowany radioaktywnym izotopem 32 P, 35 S. Detekcja opiera się na autoradiografii przy zastosowaniu filmów wrażliwych na promieniowanie. znacznikami nieradioaktywnymi Związkami fluorescencyjnymi - emisja światła o określonej długości fali, wykorzystywane są związki tj. Rodamina, kumaryna czy fluoresceina. Detekcja odbywa się odpowiednich przyrządów optycznych np. kamer lub mikroskopów fluorescencyjnych. immunochemicznie, cytochemicznie - do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z haptenem (biotyną, digoksygeniną). Detekcja odbywa się przy pomocy przeciwciał specyficznych dla danego haptenu. Przeciwciała są sprzężone z umożliwiającymi ich uwidocznienie cząsteczkami: alkaliczną fosfatazą, peroksydazą.

7 Sposoby znakowania sond molekularnych reakcja przesunięcia pęknięć w DNA (ang. nick translation) W reakcji wykorzystuje się aktywność DNA polimerazy I E. coli, która dodaje nukleotydy do wolnego końca 3' OH utworzonego wcześniej w dwuniciowym DNA przez działanie DNazy I. W tym samym czasie, polimeraza I egzonukleolitycznie usuwa nukleotydy od końca 5' pęknięcia. Równoczesna eliminacja nukleotydów z końca 5' i dodatek nukleotydów do końca 3' powoduje przesuwanie się przerwy wzdłuż DNA, w kierunku 5' - 3'. Jeśli jeden z nukleotydów obecnych w reakcji zostanie zastąpiony nukleotydem radioaktywnym lub znakowanym nieizotopowo, to w wyniku reakcji uzyskuje się DNA wyznakowany z wysoką specyficzną aktywnością reakcja przypadkowego startu replikacji (ang. random priming) Reakcję wykorzystuje się do znakowania sond molekularnych. W pierwszym etapie denaturuje się dwuniciowe DNA i hybrydyzuje do 6-12 nukleotydowych oligonukleotydów, spełniających funkcję przypadkowych starterów syntezy DNA. Po związaniu starterów z jednoniciową matrycą, synteza DNA rozpoczynana się od końców 3 starterów z udziałem fragmentu Klenowa DNA polimerazy I.

8 Sondy molekularne możemy uzyskać przez wyznakowanie końców cząsteczek kwasów nukleinowych 5 przez przeniesienie grupy fosforanowej z ATP na zdefosforylowany koniec 5 fragment RNA lub DNA za pomocą np. T4 PNK (Kinazy Polinukleotydowej z bakteriofaga T4). Jeżeli ATP jest wyznakowany w pozycji γ, to można w ten sposób znakować oligonukleotydy i fragmenty DNA. Defosforylację DNA można przeprowadzić przy wykorzystaniu Fosfataz BAP (bacterial alkaline phosphatase), CIAP (calf intestine AP), SAP (shrimp AP).

9 3 przez wypełnienie cofniętego końca 3 na matrycy wystającego końca 5 po strawieniu enzymem restrykcyjnym używamy wyznakowanego nukleotydu oraz fragmentu Klenowa polimerazy DNA I 3 z użyciem terminalnej transferazy

10 Znakowane cząsteczki RNA transkrypcja in vitro Wykorzystuje się polimerazy RNA z bakteriofagów SP6, T3, T7, które wymagają obecności specyficznego fagowego promotora w wektorze, w którym znajduje się fragment DNA będący matrycą do produkcji sondy. Sondy tak wyprodukowane mogą być niciowo-specyficzne czyli w orientacji sens i antysens. Wektor do transkrypcji musi być zlinearyzowany za fragmentem aby zapobiec syntezie sondy z sekwencji wektora. Promotor fagowej polimerazy RNA Trawienie BamHI RNA polimeraza i NTP

11 Przygotowanie docelowego DNA (target DNA), w którym za pomocą sondy molekularnej będziemy szukać komplementarnych odcinków Najczęściej wygląda to tak: 1. Izolacja genomowego DNA 2. Podział na mniejsze fragmenty np. przez trawienie 3. Rozdział w żelu agarozowym 4. Transfer na specjalną membranę (stały nośnik)

12 1975 Edwin Southern Southern blotting Proces przenoszenia DNA z żelu na membranę to blotting Transfer na membranęblotting

13 SOUTHERN blotting

14 zdenaturowany kwas nukleinowy sonda molekularna musi być zdenaturowana!

15 W którym z wielu fragmentów restrykcyjnych dużej cząsteczki DNA znajduje się sklonowany przez nas gen? sklonowany przez nas gen

16 Zalety hybrydyzacji Southerna: sonda molekularna nie musi być w 100% identyczna do poszukiwanej sekwencji żeby mogła ja wykryć Manipulujący pewnymi parametrami samego procesu hybrydyzacji możemy uzyskiwać hybrydyzację cząsteczek, których podobieństwo sekwencji nie przekracza 50%. W przypadku hybrydyzacji Southerna nie jest w tym przypadku wymagana ekspresja docelowego odcinka DNA w komórkach gospodarza. Wady: czasochłonna i pracochłonna

17 Odmiany hybrydyzacji kwasów nukleinowych w zależności od rodzaju materiału genetycznego na nośniku i użytej sondy molekularnej: 1. DNA:DNA Hybrydyzacja Southerna (od nazwiska Edwina Southerna) 2. RNA-DNA (lub RNA-RNA- rzadko) typu northern (zupełnie inne zastosowanie niż hybrydyzacja Southerna!!!)

18 Warunki hybrydyzacji muszą być odpowiednio dobrane Tworzenie hybryd pomiędzy ssdna jest odwracalne i w roztworze zależy przede wszystkim od: Stężenia kwasów nukleinowych Siły jonowej - (niższe stężenie soli - niższa stabilność) optymalna przy stężeniu 1.5 M NaCl Temperatury i stężenia substancji destabilizujących helisę np. formamidu Czasu trwania hybrydyzacji

19 Czynniki kluczowe dla przebiegu hybrydyzacji 1. Stężenie kwasów nukleinowych Dla uwidocznienia unikalnej sekwencji DNA lub RNA potrzeba co najmniej 10 g materiału związanego z filtrem Stężenie sondy molekularnej w roztworze nie powinno przekraczać ng/ml. W niewielkim zakresie wzrost stężenia sondy poprawia wydajność hybrydyzacji, nadmiar sondy powoduje wysokie tło!!! Ilość przeniesionego na membranę DNA zależy od wielkości fragmentów i stężenia agarozy w żelu. Fragmenty poniżej 1 kpz ulegają transferowi w ciągu 1 godz. Większe fragmenty wolniej i mniej wydajnie, np. fragmenty powyżej 15 kpz wymagają co najmniej 18 godz. transferu

20 2. Siła jonowa roztworu w którym zachodzi hybrydyzacja: Optymalna hybrydyzacja zachodzi w roztworach o wysokim stężeniu soli Stosuje się roztwory takie jak 20 X SSC (zawiera m.in. 3 M NaCl) lub SSPE (zawiera m.in. 3.6 M NaCl) W/w roztwory stanowią podstawowy składnik buforów używanych do hybrydyzacji oraz do transferu.

21 3. Temperatura hybrydyzacji: temp.65-68ºc, około 1M NaCl lub temp.42ºc, około 1M NaCl i 50% formamid formamid destabilizuje wiązania wodorowe między łańcuchami kwasów nukleinowych stąd możliwe jest prowadzenie hybrydyzacji w niższej temperaturze Pozwalają na uzyskanie stabilnych hybryd pomiędzy cząsteczkami kwasów nukleinowych o przeciętnej zawartości par G-C, o 100% komplementarności na długich kilkuset nukleotydowych odcinkach. Są to ostre warunki hybrydyzacji ang. stringent Hybrydyzację krótkich fragmentów lub nie w pełni komplementarnych (poniżej 100 % zasad identycznych) prowadzi się w warunkach łagodniejszych (ang. relaxed lub low stringency) tzn. w niższej temperaturze lub w wyższym stężeniu soli. Podobne zasady rządzą etapem odpłukiwania sondy.

22 4. Czas trwania hybrydyzacji: z sondami DNA lub RNA 15 godz. w roztworach wodnych i 24 w roztworach z formamidem (dla genomowego DNA) Z sondami oligonukleotydowymi co najmniej 15 godz

23 Operując tymi parametrami możemy uzyskiwać hybrydyzację cząsteczek, których identyczność sekwencji nie przekracza 50%.

24 Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ FISH- pozwala bezpośrednio uwidocznić pozycję markera (czyli znanego odcinka DNA) w większej cząsteczce DNA np. chromosomie po hybrydyzacji z sondą fluorescencyjną.

25 Techniki hybrydyzacyjne można stosować także jako metody screeningu przeszukiwania dużej ilości rekombinantów/klonów w celu znalezienia właściwego, zawierającego poszukiwany odcinek DNA do potwierdzenia obecności zrekombinowanych fragmentów DNA w komórkach gospodarza

26 Hybrydyzacja kolonijna wykonujemy np. po transformacji komórek bakteryjnych bankiem plazmidowym. Po wysianiu na płytki replikuje się kolonie na filtr. Wykonuje się szereg czynności, które mają na celu przytwierdzenie bakterii, ich lizę i denaturację in situ a następnie poddaje się hybrydyzacji i autoradiografii. Dzięki zachowaniu szalki wzorcowej jesteśmy w stanie określić dokładnie kolonię, w której znajduje się hybrydyzujący fragment.

27 Hybrydyzacja łysinkowa - po transformacji komórek bakteryjnych populacją fagów i wysianiu ich na płytki, łysinki replikuje się na filtr. Przytwierdza się przeniesione fagi do filtru, hybrydyzuje z sondą i poddaje autoradiografii. Także w tym przypadku dzięki szalce wzorcowej jesteśmy w stanie zidentyfikować łysinki, których pozycje odpowiadają zaczernieniom na kliszy.