Hybrydyzacja kwasów nukleinowych metodą Southerna

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Hybrydyzacja kwasów nukleinowych metodą Southerna"

Transkrypt

1 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych metodą Southerna

2

3 ENZYMY SŁUŻĄCE DO MANIPULACJI DNA KATEGORIA FUNKCJA CHARAKTERYSTYKA PRZYKŁADY POLIMERAZY synteza nowych polinukleotydów komplementarnych do istniejącej matrycy DNA lub RNA Posiadane aktywności: 5 3 polimerazy 3 5 egzonukleazy (korektorska) 5 3 egzonukleazy DNA polimeraza I E.coli Fragment Klenowa Sekwenaza Taq polimeraza Odwrotna transkryptaza NUKLEAZY degradacja cząsteczki DNA przez rozrywanie wiązań fosfodiestrowych łączących jeden nukleotyd z drugim - egzonukleazy - endonukleazy (przykład: endonukleazy restrykcyjne) Enzymy restrykcyjne zostawiają: - końce tępe - końce lepkie jednoniciowe fragm. na końcu 5 (np. Sau3AI, HinfI) lub 3 (np. PstI) LIGAZY łączenie ze sobą cząsteczek DNA przez syntezę wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami na końcach dwóch różnych cząsteczek lub na dwóch końcach pojedynczej cząsteczki Ligacja wymaga energii, której dostarcza się dodając ATP lub NAD do mieszaniny reakcyjnej, zależnie od typu używanej ligazy. ligaza DNA E.coli ligaza DNA z faga T4 ENYZMY MODYFIKUJĄC E KOŃCE zmienianie końców cząsteczek DNA lub RNA Fosfataza alkaliczna - usuwa gr. fosforanowe z końca 5 DNA (zapobieganie ligacji cząst. ze sobą) i RNA, nt-ów Kinaza polinukleotydowa T4 (z E.coli infekowanych T4): -5' kinaza, przenosząca g-fosforan z ATP na koniec 5'-OH cząsteczek ssdna, dsdna, ssrna lub dsrna -3' fosfataza, usuwająca grupy fosforanowe z końców 3' cząsteczek ssdna, dsdna, ssrna lub dsrna Deoksynukleotydylotransferaza terminalna (TdT) - matryco-niezależna polimeraza DNA, dosyntetyzująca deoksynukleotydy do końców 3'-OH na ssdna lub dsdna

4 Enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych Fosfataza alkaliczna Źródło: jelito cielęce (fosfataza CIP, ang. Calf Intestine Phosphatase), E. coli (fosfataza BAP, ang. Bacterial Alkaline Phosphatase) lub krewetek. Budowa: dimeryczny glikoproteid, złożony z dwóch identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej 69 kda. Zawiera cztery atomy cynku na cząsteczkę. CIP może być inaktywowany termicznie przez inkubację w 68 C, fosfatazę z krewetek w 65 C, natomiast BAP jest w tych warunkach stabilny. BAP jest również oporny na ekstrakcję fenolową. Właściwości: 5' fosfataza, usuwająca 5' grupę fosforanową z ssdna i dsdna, ssrna i dsrna oraz trifosforanów deoksy-/rybonukleotydów Zastosowanie: 1)defosforylacja końców dsdna przy przygotowywaniu wektorów do klonowania (fragmenty pozbawione grup fosforanowych na końcach nie mogą zamykać się w kółko w reakcji ligacji; zapobieganie autoligacji) 2) defosforylacja DNA lub RNA przed znakowaniem końców 5 za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 3) defosforylacja białek 4) Jako składnik w systemie immunodetekcji

5 Enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych Kinaza Polinukleotydowa T4 (PNK) Źródło: bakterie E. coli zakażone fagiem T4 lub rekombinant E. coli. Budowa: tetramer, złożony z identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej 33 kda. Właściwości: 1) 5' kinaza - przenosi g-fosforan z ATP na koniec 5'-OH cząsteczek ssdna, dsdna, ssrna lub dsrna 2) 3' fosfataza - usuwa gr. fosforanowe z końców 3' cząsteczek ssdna, dsdna, ssrna lub dsrna Zastosowanie: 1) Znakowanie końców 5' DNA lub RNA, szczególnie przed reakcjami sekwencjonowania metodą Maxama-Gilberta, enzymatycznym sekwencjonowaniem RNA, mapowaniem restrykcyjnym i " footprintingem" 2) Fosforylowanie syntetycznych oligonukleotydów 3) Usuwanie grup fosforanowych z końców 3'.

6 Kinaza Polinukleotydowa T4 (PNK) Kinaza polinukleotydowa katalizuje dwa typy reakcji: 1) Transfer fosforanu z ATP na koniec 5 cząsteczki DNA (lub RNA), która nie posiada reszty fosforanowej, ponieważ powstała w procesie chemicznej syntezy lub uległa defosforylacji (ang. "forward reaction"). 2) Wymiana fosforanu polega na przeniesieniu reszty fosforanowej z 5 końca cząsteczki DNA (lub RNA) na ADP przez enzym kinazę polinukleotydową. W kolejnym etapie PNK katalizuje przeniesienie fosforanu na inną cząsteczkę DNA (lub RNA), która nie posiada na 5 końcu reszty fosforanowej. (ang."exchange reaction") Częstotliwość katalizowania reakcji "forward" jest znacznie większa niż reakcji "exchange".

7 Kinaza polinukleotydowa (PNK) efektywność znakowania

8 Enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych Deoksynukleotydylotransferaza terminalna (TdT) Źródło enzymu: trzustka cielęca. Budowa: białkiem dimeryczne, złożone z dwóch niejednakowych podjednostek o masach cząsteczkowych 80 i 26 kda. Właściwości: 1) Matryco-niezależna polimeraza DNA, dosyntetyzująca deoksynukleotydy do końców 3'-OH na ssdna lub dsdna z uwolnieniem nieorganicznego fosforanu 2) Polimeryzacja rybonukleotydów (mała wydajność). Zastosowanie: 1) Tworzenie homopolimerowych ogonów na końcach fragmentów 2) Znakowanie końców 3' znakowanym 3'-dNTP, 3'-NTP lub dideoksy-ntp

9 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych: łączenie się na zasadzie komplementarności zasad nici DNA lub RNA pochodzących z dwóch różnych źródeł

10 Zastosowanie hybrydyzacji wyszukiwanie specyficznej sekwencji DNA - przeszukiwanie bibliotek (np. hybrydyzacja różnicowa, subtrakcja, SSH), wykrywanie i identyfikacja czynnika chorobotwórczego (dot blot), analiza porównawcza różnych szczepów bakteryjnych, w diagnostyce chorób genetycznych, oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną detekcję mrna (Nothern), globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema próbkami (mikromacierze), wizualizacji regionów ekspresji genów w organizmie (hybrydyzacja in situ), ustalenie wzoru polimorfizmu miejsc restrykcyjnych, np. ustalenie ojcostwa (Southern, RFLP).

11

12 Southern-blot Northern-blot Western-blot 1. Izolacja DNA 1. Izolacja RNA 1. Izolacja białka 2. Cięcie enzymem restrykcyjnym 2. Denaturacja (podgrzanie próbki 65ºC, formaldehyd, glioksal ) 2. Denaturacja w roztworze z SDS 3. Rozdzielanie na żelu (najczęściej agarozowym) 3.1. Denaturacja DNA w środowisku alkalicznym 3. Rozdzielanie na żelu (najczęściej agarozowym z formaldehydem) 3. Rozdział na żelu (zwykle poliakrylamidowym tzw. SDS- PAGE) Transfer na membranę nylonową lub nitrocelulozową (zwykle kapilarny) 5. Blokowanie niespecyficznie wiążących miejsc używając nadmiaru losowych fragm. DNA 6. Hybrydyzacja z wyznakowaną sondą DNA-ową lub RNA-ową 7. Odpłukanie niespecyficznie związanej sondy (przy dobranej ostrości płukania) 4. Transfer na membranę nylonową lub nitrocelulozową (zwykle kapilarny) 5. Blokowanie niespecyficznie wiążących miejsc używając nadmiaru losowych fragm. DNA lub trna oraz poli(t) 6. Hybrydyzacja z wyznakowaną sondą DNA-ową lub RNA-ową 7. Odpłukanie niespecyficznie związanej sondy (przy dobranej ostrości płukania) 4. Transfer na membranę nylonową lub nitrocelulozową (zwykle elektroforetyczny) 5. Blokowanie niespecyficznie wiążących miejsc używając nadmiaru niespecyficznego białka (np. BSA) 6. Hybrydyzacja z przeciwciałem 7. Odpłukanie niespecyficznie związanego przeciwciała 8. Autoradiografia lub phosphoimager 8. Autoradiografia lub phosphoimager 8. Autoradiografia lub enzymatyczna reakcja barwna

13 TRANSFER Southern-blot Northern-blot Neutralny Alkaliczny Neutralny Denaturacja: 1.5M NaCl 0.5N NaOH - - Depurynacja: 0.25N HCl Neutralizacja: 1.0M Tris HCl 1.5M NaCl Depurynacja: 0.25N HCl - Denaturacja: 0.4N NaOH - Transfer: 10xSSC lub 10xSSPE Transfer: 0.4N NaOH Transfer: 10xSSC lub 10xSSPE Płukanie membr.: (resztki agarozy) 2xSSC lub 2xSSPE Płukanie membr.: (resztki agarozy, zobojętnienie) 0.5M TrisHClpH 7.2, 1.0M NaCl Płukanie membr.: (resztki agarozy) 2xSSC lub 2xSSPE zapiekanie zapiekanie (nawet nie konieczne) zapiekanie (lepszy UV-crosslinking)

14

15 Oznaczenie orientacji żelu przed transferem

16 Różne rodzaje transferów Kapilarny do góry Kapilarny do dołu Kapilarny w obie strony Próżniowy Elektroforetyczny

17 Transfer kapilarny do góry 1kg glass plate tissue Whatman 3MM membrane inverted gel Whatman 3MM saturated glass plate solution

18 Transfer kapilarny do dołu cover bridge (wet blotting paper) tray with transfer solution blotting papers (3 wet) gel membrane blotting papers (4 dry and 1 wet on top) paper towels (2-3 cm)

19 Rodzaje membran Nitroceluloza Nylonowa Nylonowa + Pojemność μg/cm2 Wielkość fragmentów >400bp >50bp >50bp Bufor do transferu Neutralny, wysoka siła jonowa Niska siła jonowa, różne ph Niska siła jonowa, różne ph Wiązanie DNA do membrany Zapiekanie 2 godz. 80C, próżnia, Zapiekanie, UV, kuchenka mikrofalowa, zbędne przy transferze alkalicznym Zapiekanie, UV, kuchenka mikrofalowa, zbędne przy transferze alkalicznym

20 Izotopy stosowane do znakowania DNA 32 P (włączany w pozycji α lub γ): emituje promieniowanie β o energii 1,709 MeV (najwyższa energia spośród izotopów wykorzystywanych w doświadczeniach biologicznych), stosunkowo krótki okres półtrwania (14,3 dnia), sonda o wysokiej aktywności specyficznej - wysoka czułość i szybka detekcja, wykorzystywany w hybrydyzacjach, badaniach aktywności transkrypcji. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI: ekrany ochronne z pleksiglasu, rękawiczki, fartuch, dozymetr osobisty, próbki w ołowiankach, pojemnikach z pleksi

21 Izotopy stosowane do znakowania DNA 35 S energia promieniowania β 0,167 MeV, powstają związki organiczne o wysokiej lotności, łatwo wchłanialne i akumulowane (praca pod wyciągiem), okres półtrwania 87,4 dnia, ekrany ani osłony ołowiane nie wymagane, używany do sekwencjonowania DNA, w postaci siarczanu do badania metabolizmu białek, a w postaci metioniny do badań translacji.

22 Izotopy stosowane do znakowania DNA 33 P energia promieniowania β 0,0248 MeV, okres półtrwania 25,5 dnia, bardzo drogi.

23 Znakowanie sond DNA i RNA znakowanie końców 5 i 3 przemieszczanie pęknięć (nick translation) znakowanie metodą wydłużania startera (random primed labeling) za pośrednictwem PCR fotoznakowanie znakowanie RNA w systemie transkrypcji in vitro

24 METODY ZNAKOWANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH IN VITRO METODA TYP SONDY POZYCJA ZNACZNIKA WIELKOŚĆ SONDY GŁÓWNE ZASTOSOWANIA Random priming na matrycy DNA dsdna wewnętrzna nt Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek Random priming na matrycy RNA Oligo(dT) primining syntezy cdna na matrycy RNA ssdna lub hybrydy DNA- RNA ss cdna lub hybrydy cdna- RNA wewnętrzna nt Przeglądanie różnicowe bibliotek cdna; sondy odejmujące, DD - RT PCR (differential display), mapowanie mrna za pomocą nukleaz wewnętrzna nt sondy odejmujące, DD - RT PCR (differential display) PCR ssdna lub dsdna wewnętrzna zależna od wielkości produktu PCR Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek za pomocą hybrydyzacji; sonda reprezentuje specyficzną część genu docelowego Nick translation dsdna wewnętrzna 400 nt Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek Primer extension Startery uniwersalne (su) lub specyficzne (sp) Matryca ssdna Primer extension 2 pary starterów Matryca ssdna Transkrypcja in vitro na matrycy dsdna dsdna wewnętrzna określona długość, kiedy matrycą DNA bφ M13 lub fagemidu (su); Długość zależna od wielkości produktu PCR (sp; 150bp-2kb) dsdna wewnętrzna Zróżnicowana (zwykle nt) ssrna wewnętrzna Znakowane RNA określonej długości mapowanie mrna za pomocą nukleaz, Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek za pomocą hybrydyzacji; sonda reprezentuje specyficzną część genu docelowego Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek, hybrydyzacja in situ, mapowanie mrna za pomocą RNaz

25 Sposoby znakowania sond Znakowanie końców 5 Przeniesienie grupy fosforanowej z pozycji γ ATP na zdefosforylowany (przy użyciu alkalicznej fosfatazy) koniec 5 fragmentu RNA lub DNA za pomocą kinazy polinukleotydowej z faga T4. Jeżeli ATP jest wyznakowany w pozycji γ, to można w ten sposób znakować oligonukleotydy i fragmenty DNA. Metoda używana głównie do znakowania syntetycznych oligonukleotydów.

26 Sposoby znakowania sond Znakowanie końców 3 Przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA I uzupełnianie lepkich końców we fragmentach DNA, które powstały w wyniku cięcia endonukleazami restrykcyjnymi, pozostawiającymi wystające jednoniciowe końce 5. Przy użyciu enzymu terminalnej transferazy, która dołącza deoksyrybonukleotydy na końcu 3 jedno- lub dwuniciowych cząsteczek DNA.

27 Sposoby znakowania sond Znakowanie końców 3

28 Sposoby znakowania sond Reakcja przemieszczania pęknięć (nick translation) Nacięcie DNA z wytworzeniem 3 końcowej grupy OH przy użyciu DNazy I. DNA polimerazy I E. coli dodaje nukleotydy do wolnego końca 3' OH. W tym samym czasie, polimeraza I usuwa nukleotydy od końca 5' pęknięcia. Równoczesna eliminacja nukleotydów z końca 5' i dodatek nukleotydów do końca 3' powoduje przesuwanie się przerwy wzdłuż DNA, w kierunku 5' -> 3'.

29 Sposoby znakowania sond Znakowanie z wykorzystaniem starterów losowych (random priming)

30 Sposoby znakowania sond Transkrypcja in vitro Wykorzystuje się polimerazy RNA z bakteriofagów SP6, T3, T7, które wymagają obecności specyficznego fagowego promotora w wektorze, w którym znajduje się fragment DNA będący matrycą do produkcji sondy. Sondy tak wyprodukowane są niciowospecyficzne może być orientacja sens i antysens. Wektor do transkrypcji musi być zlinearyzowany za fragmentem aby zapobiec syntezie sondy z sekwencji wektora.

31 Związek Detekcja radioizotop fosforu 32 P w postaci znakowanych w pozycji α i γ trójfosforanów nukleozydów: np. najczęściej stosowany [γ] 32 P -dctp 1. zaczernienie filmu 2. akumulacja promieniowania na ekranie fosforowym - ekspozycja, uwolnienie nagrom.energii przez naświetlenie czerw. światłem i odczyt niebieskiej emisji digoksygenina (DIG) w postaci DIG-11-dUTP biotyna w postaci Biotin-11-dUTP 1. przeciwciało specyficzne do digoksygeniny z: - - alkaliczną fosfatazą, która min.rozkłada CSPD wyzwalając chemiluminescencję dającą zaczernienie filmu - - czymś innym np. fluoresceiną 1. streptavidyna z alkaliczną fosfatazą - czymś innym np. fluoresceiną fluoresceina w postaci Fluorescein-12-dUTP 1. wyznakowany kwas nukleinowy daje żółą fluorescencję (in situ hybrydyzacja) 2. przeciwciało specyficzne do fluoresceiny z alkaliczną fosfatazą tetrametylorodamina w postaci Tetramethyl-rhodamine-6-dUTP 1. wyznakowany kwas nukleinowy daje czerwoną fluorescencję, stosowana w in situ hybrydyzacji 2. przeciwciało specyficzne do tetrametylorhodaminy z alkaliczną fosfatazą

32 Czynniki wpływające na stopień hybrydyzacji temperatura optymalna dla hybrydyzacji hybrydów DNA-DNA w temp C niższej niż Tm, dla DNA-RNA C poniżej Tm; siła jonowa optymalna przy 1,5 M Na + ; skład zasad w wodnych roztworach AT są mniej stabilne niż GC; czynniki destabilizujące zwiększenie stężenia formamidu o 1% obniża Tm o 0,6 C; 6M mocznik obniża Tm o 30 C; niesparowane zasady każdy 1% niesparowania to 10 C spadek Tm, długość dupleksów efekt niekorzystny w przypadku sond dłuższych niż 500 pz. Tm - temperatura topnienia, która wyraża termiczną stabilność hybrydów kwasów nukleinowych

33 Warunki hybrydyzacji temp. 65ºC, około 1M NaCl temp.42ºc, około 1M NaCl i 50% formamid formamid destabilizuje wiązania wodorowe między łańcuchami kwasów nukleinowych stąd możliwe jest prowadzenie hybrydyzacji w niższej temperaturze Takie warunki pozwalają na uzyskanie stabilnych hybryd pomiędzy cząsteczkami kwasów nukleinowych o przeciętnej zawartości par G-C, o 100% komplementarności i na długich, kilkusetnukleotydowych odcinkach. Hybrydyzację krótkich fragmentów lub nie w pełni komplementarnych (od 100 do 65% zasad identycznych) prowadzi się w warunkach łagodniejszych tzn. w niższej temperaturze lub w wyższym stężeniu soli. Podobne zasady rządzą etapem odpłukiwania sondy.

34 Zastosowanie hybrydyzacji Southern blot sprawdzanie ilości kopii genu, transgenu, jego architektury, sprawdzanie liczby miejsc integracji transgenu, sprawdzanie czy do genomu roślinnego trafiły inne niż T- DNA obszary plazmidu binarnego, sprawdzanie poprawności integracji transgenu, ocena polimorfizmu (RFLP), ocena poziomu metylacji genu, transgenu.

35 Transgen i miejsce jego integracji ptdna ycf15 orf92 orf79 orf115 trnl ndhb EcoRI 587pz 240pz 689pz EcoRI MroI TOPO ptdna aada 1300pz P. Brągoszewski, sonda z pbluescript z aada (odp. na Spec) z prom. rrna i term. psba - DNA z roślin transgenicznych i nietrangenicznych strawione EcoRI daje prążek 2200bp (podwójny) od prom. rrna i term. psba (prażek mocny - wszystkie plastydy dają taki obraz) - DNA z roślin transgenicznych daje dodatkowy prażek 3500 bp siła zależy od stopnia homoplazmiczności

36 Przykładowy wynik:

37 Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) locus D7S21 (MS31) DNA wyizolowany z próbek krwi został hydrolizowany enzymem restrykcyjnym Hinf1, rozdzielony w żelu agarozowym i poddany hybrydyzacji z sondą molekularną MS31. Wszystkie osoby poddane badaniu są heterozygotami. ścieżki 1-3, rodzina I (matka, dziecko, domniemany ojciec)

38 Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) ścieżki 1-3, rodzina I (matka, dziecko, domniemany ojciec) Ścieżka 4-6, rodzina II (matka, dziecko, domniemany ojciec)

39 Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) to metoda, która pozwala na wykrycie specyficznej sekwencji DNA w chromosomach, tkankach oraz pojedynczych komórkach.

40 Mikromacierze

41 Zastosowania mikromacierzy Mierzenie ilości transkryptu Genotypowanie Mierzenie liczby kopii DNA Identyfikowanie miejsc wiążących białka Etc.

42 Podstawowe rodzaje mikromacierzy Mikromacierze oligonukleotydowe (ang. oligo array) - na płytce naniesione są krótkie, na ogół nukleotydowe sekwencje sond. Mikromacierze cdna (ang. cdna array) - sondy znacznie dłuższe, zazwyczaj odpowiadające pełnym sekwencjom mrna. Mikromacierze o układzie dachówkowym (ang. tiled microarrays). ChIP on Chip Etc.

43 Tiled microarrays So-called tiled microarrays cover a genomic region (or the whole genome!) at high coverage. Probes are designed to cover virtually every basepair of the sequence, usually excluding only simple sequence repeats. In this way, there is no bias toward known transcribed regions. genomic sequence probes on array probe size and spacing determines the resolution

44 NSF Soybean Functional Genomics Steve Clough / Vodkin Lab Printing Arrays on 50 slides

45 GeneChip Probe Arrays nechip Probe Array Hybridized Probe Cell Single stranded, labeled RNA target Oligonucleotide probe * * * * * 24µm 1.28cm Millions of copies of a specific oligonucleotide probe >200,000 different complementary probes Image of Hybridized Probe Array

46 Hybridization chamber 3XSSC HYB CHAMBER ARRAY LIFTERSLIP SLIDE LABEL SLIDE LABEL Humidity Temperature Formamide (Lowers the Tm)

47 Szczegóły doświadczenia

48 Cy5 Cy3

49 Cy5 Cy3

50 Analiza danych

51 Przykład arkuszu z wynikami

52 Roślinne bazy danych mikromacierzy The Nottingham Arabidopsis Stock Centre's Stress Genomics Consortium The Arabidopsis Functional Genomics Consortium Soybean genomics and microarray database Complete Arabidopsis Transcriptome MicroArray database Tomato Expression Database Genevestigator

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Jaka jest lokalizacja tego genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych

Bardziej szczegółowo

Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo?

Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych sekwencjach nukleotydów

Bardziej szczegółowo

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych

Bardziej szczegółowo

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy, nukleazy

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy, nukleazy Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce) Najważniejsze

Bardziej szczegółowo

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, nukleazy

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, nukleazy Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce) Najważniejsze

Bardziej szczegółowo

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, nukleazy

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, nukleazy Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce) Najważniejsze

Bardziej szczegółowo

2015-11-18. DNA i RNA ENZYMY MODYFIKUJĄCE KOŃCE CZĄSTECZEK. DNA i RNA. DNA i RNA

2015-11-18. DNA i RNA ENZYMY MODYFIKUJĄCE KOŃCE CZĄSTECZEK. DNA i RNA. DNA i RNA Fosfataza alkaliczna CIP Calf Intestine Phosphatase- pochodzenie: jelito cielęce BAP Bacterial Alcaline Phosphatase- pochodzenie: E. coli SAP Shrimp Alcaline Phosphatase- pochodzenie: krewetki Pandalus

Bardziej szczegółowo

Ligazy. Zastosowanie ligazy w inżynierii genetycznej:

Ligazy. Zastosowanie ligazy w inżynierii genetycznej: Ligazy Katalizują tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi grupami 3 OH i 5 PO 4 w kwasach nukleinowych DNA lub RNA. W reakcji tworzą się wysokoenergetyczne pośredniki z udziałem NAD + lub ATP

Bardziej szczegółowo

Metody badania ekspresji genów

Metody badania ekspresji genów Metody badania ekspresji genów dr Katarzyna Knapczyk-Stwora Warunki wstępne: Proszę zapoznać się z tematem Metody badania ekspresji genów zamieszczonym w skrypcie pod reakcją A. Lityńskiej i M. Lewandowskiego

Bardziej szczegółowo

WEKTORY WAHADŁOWE ENZYMY W KLONOWANIU POLIMERAZY

WEKTORY WAHADŁOWE ENZYMY W KLONOWANIU POLIMERAZY WEKTORY WAHADŁOWE Replikują się w organizmach prokariotycznych i eukariotycznych (również ssaków) Złożone z fragmentów DNA charakterystycznych dla Procaryota i Eukaryota - pierwsza część zawiera ori i

Bardziej szczegółowo

POLIMERAZY DNA- PROCARYOTA

POLIMERAZY DNA- PROCARYOTA Enzymy DNA-zależne, katalizujące syntezę DNA wykazują aktywność polimerazy zawsze w kierunku 5 3 wykazują aktywność polimerazy zawsze wobec jednoniciowej cząsteczki DNA do utworzenia kompleksu z ssdna

Bardziej szczegółowo

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

POLIMERAZY DNA- PROCARYOTA

POLIMERAZY DNA- PROCARYOTA Enzymy DNA-zależne, katalizujące syntezę DNA wykazują aktywność polimerazy zawsze w kierunku 5 3 wykazują aktywność polimerazy zawsze wobec jednoniciowej cząsteczki DNA do utworzenia kompleksu z ssdna

Bardziej szczegółowo

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji

Bardziej szczegółowo

2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy

2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy Metody analizy DNA 1. Budowa DNA. 2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy 3. Klonowanie in vivo a. w bakteriach, wektory plazmidowe b. w fagach, kosmidy c. w drożdżach,

Bardziej szczegółowo

Inżynieria Genetyczna ćw. 3

Inżynieria Genetyczna ćw. 3 Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 3 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2018/2019

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna Podstawy

Biologia Molekularna Podstawy Biologia Molekularna Podstawy Budowa DNA Budowa DNA Zasady: Purynowe: adenina i guanina Pirymidynowe: cytozyna i tymina 2 -deoksyryboza Grupy fosforanowe Budowa RNA Budowa RNA Zasady: purynowe: adenina

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA

TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA DNA 28SRNA 18/16S RNA 5SRNA mrna Ilościowa analiza mrna aktywność genów w zależności od wybranych czynników: o rodzaju tkanki o rodzaju czynnika zewnętrznego o rodzaju upośledzenia szlaku metabolicznego

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu GENOMIKA FUNKCJONALNA Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu Adnotacja (ang. annotation) pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu analiza bioinformatyczna

Bardziej szczegółowo

Biologia medyczna, materiały dla studentów

Biologia medyczna, materiały dla studentów Zasada reakcji PCR Reakcja PCR (replikacja in vitro) obejmuje denaturację DNA, przyłączanie starterów (annealing) i syntezę nowych nici DNA (elongacja). 1. Denaturacja: rozplecenie nici DNA, temp. 94 o

Bardziej szczegółowo

Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA

Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA 1. Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gilberta 1977) 2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA - klasyczna metoda Sangera (Sanger

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================

Biologia Molekularna z Biotechnologią =============================================================================================== Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Przedmiot: Katedra Biologii Molekularnej Biologia

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

Przeglądanie bibliotek

Przeglądanie bibliotek Przeglądanie bibliotek Czyli jak złapać (i sklonować) ciekawy gen? Klonowanie genów w oparciu o identyczność lub podobieństwo ich sekwencji do znanego już DNA Sonda homologiczna (komplementarna w 100%)

Bardziej szczegółowo

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA

Bardziej szczegółowo

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6 RT31-020, RT31-100 RT31-020, RT31-100 Zestaw TRANSCRIPTME RNA zawiera wszystkie niezbędne składniki do przeprowadzenia syntezy pierwszej nici cdna na matrycy mrna lub całkowitego RNA. Uzyskany jednoniciowy

Bardziej szczegółowo

PCR. Aleksandra Sałagacka

PCR. Aleksandra Sałagacka PCR Aleksandra Sałagacka Reakcja PCR naśladuje proces replikacji DNA in vitro pozwala na amplifikację określonego krótkiego (kilkadziesiąt kilka tys.pz) fragmentu DNA obecnie najważniejsze narzędzie biologii

Bardziej szczegółowo

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo) W probówce (PCR) Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny

Bardziej szczegółowo

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA RP20R, RP100R RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA Rekombinowana termostabilna polimeraza DNA Taq zawierająca czerwony barwnik, izolowana z Thermus aquaticus, o przybliżonej

Bardziej szczegółowo

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu GENOMIKA FUNKCJONALNA Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu Adnotacja (ang. annotation) pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu analiza bioinformatyczna

Bardziej szczegółowo

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Mutacja Mutacja (łac. mutatio zmiana) - zmiana materialnego

Bardziej szczegółowo

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Ćwiczenie 3 Identyfikacja genetycznie modyfikowanych roślin w produktach spożywczych - jakościowe badanie obecności

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.

Bardziej szczegółowo

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu GENOMIKA FUNKCJONALNA Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu Adnotacja (ang. annotation) pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu analiza bioinformatyczna

Bardziej szczegółowo

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe wykorzystujące mikromacierze DNA Genotypowanie: zróżnicowane wewnątrz genów RNA Komórka eukariotyczna Ekspresja genów: Które geny? Poziom

Bardziej szczegółowo

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy PCR łańcuchowa reakcja polimerazy PCR - ang. polymerase chain reaction Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

O trawieniu restrykcyjnym

O trawieniu restrykcyjnym O trawieniu restrykcyjnym Enzymy II klasy, Mg 2+, dsdna z rozpoznawaną sekwencją, tępe, lepkie (kohezyjne) końce, warunki reakcji bufor o różnym stężeniu NaCl i określonym ph BSA -stabilizator 37 o C /lub

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych

Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA (powielonego techniką PCR i wyizolowanego z żelu agarozowego na poprzednich zajęciach) do wektora plazmidowego

Bardziej szczegółowo

Glimmer umożliwia znalezienie regionów kodujących

Glimmer umożliwia znalezienie regionów kodujących Narzędzia ułatwiające identyfikację właściwych genów GLIMMER TaxPlot Narzędzia ułatwiające amplifikację tych genów techniki PCR Primer3, Primer3plus PrimerBLAST Reverse Complement Narzędzia ułatwiające

Bardziej szczegółowo

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o ĆWICZENIE 2 Oznaczanie polimorfizmu cytochromu CYP2D6 za pomocą tradycyjnych metod biologii molekularnej: PCR-RFLP I. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (polymerase chain reaction) Technika PCR rozwinęła

Bardziej szczegółowo

ENZYMY RESTRYKCYJNE ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? nazewnictwo: EcoRV

ENZYMY RESTRYKCYJNE ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? nazewnictwo: EcoRV ENZYMY RESTRYKCYJNE Enzymy z klasy endonukleaz (hydrolaz), wykazujące powinowactwo do specyficznych fragmentów dwuniciowych cząsteczek DNA i hydrolizujące wiązania fosfodiestrowe w obu niciach Naturalnie

Bardziej szczegółowo

Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO

Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO Diagnostyka molekularna Dr n.biol. Anna Wawrocka Strategia diagnostyki genetycznej: Aberracje chromosomowe: Metody:Analiza kariotypu, FISH, acgh, MLPA, QF-PCR Gen(y) znany Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie,

Bardziej szczegółowo

Metody analizy genomu

Metody analizy genomu Metody analizy genomu 1. Mapowanie restrykcyjne. 2. Sondy do rozpoznawania DNA 3. FISH 4. Odczytanie sekwencji DNA 5. Interpretacja sekwencji DNA genomu 6. Transkryptom 7. Proteom 1. Mapy restrykcyjne

Bardziej szczegółowo

Definicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis)

Definicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis) Definicje Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Białka, które powstały w żywych organizmach (lub liniach komórkowych) w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA. Rekombinowany DNA jest

Bardziej szczegółowo

Genetyka, materiały dla studentów Pielęgniarstwa

Genetyka, materiały dla studentów Pielęgniarstwa Markery genetyczne: definicja Marker genetyczny jest to cecha, która może być wykorzystana do identyfikacji osobników lub gatunków. Cechy markerów genetycznych Monogeniczny: warunkowany przez jeden gen

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu DNA) Jest to reakcja powielania (replikacji)

Bardziej szczegółowo

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość*

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość* Poznao, 6 lutego 2012 r. Zapytanie ofertowe nr 001 /2012 dotyczące zakupu odczynników chemicznych do izolacji DNA i reakcji PCR GENESIS Polska Sp. z o.o Ul. Za Cytadelą 19, 61-659 Poznao NIP 778 13 56

Bardziej szczegółowo

ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? ENZYMY RESTRYKCYJNE- TYP I. nazewnictwo: EcoRV

ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? ENZYMY RESTRYKCYJNE- TYP I. nazewnictwo: EcoRV nazewnictwo: EcoRV ENZYMY RESTRYKCYJNE - pierwsza litera- rodzaj bakterii - druga i trzecia- gatunek - następna litera oznacza szczep lub typ - kolejne enzymy izolowane z danego szczepu lub typu otrzymują

Bardziej szczegółowo

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska Dane mikromacierzowe Mateusz Markowicz Marta Stańska Mikromacierz Mikromacierz DNA (ang. DNA microarray) to szklana lub plastikowa płytka (o maksymalnych wymiarach 2,5 cm x 7,5 cm) z naniesionymi w regularnych

Bardziej szczegółowo

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów:

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: 1. Otrzymanie pożądanego odcinka DNA z materiału genetycznego dawcy 2. Wprowadzenie obcego DNA do wektora 3. Wprowadzenie wektora, niosącego w sobie

Bardziej szczegółowo

METODY MOLEKULARNE STOSOWANE W TAKSONOMII

METODY MOLEKULARNE STOSOWANE W TAKSONOMII METODY MOLEKULARNE STOSOWANE W TAKSONOMII AUTOR: MAGDALENA DUDEK Taksonomia jest nauką, której głównym celem jest badanie, opisywanie oraz klasyfikacja organizmów. W oparciu o różnice i podobieństwa łączy

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa tel. 22 572 0735, 606448502

Bardziej szczegółowo

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7.2. Metody biologii molekularnej (technika PCR, sekwencjonowanie DNA) wykorzystywane w taksonomii roślin Autor: Magdalena Dudek

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3 PCR i trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi

Ćwiczenie 3 PCR i trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Katedra Biologii Molekularnej Biologia i Biologia Medyczna II rok Przedmiot: Biologia

Bardziej szczegółowo

Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji

Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią =================================================================

Bardziej szczegółowo

Instrukcja ćwiczeń Biologia molekularna dla II roku Analityki Medycznej. Reakcja odwrotnej transkrypcji. Projektowanie starterów do reakcji PCR.

Instrukcja ćwiczeń Biologia molekularna dla II roku Analityki Medycznej. Reakcja odwrotnej transkrypcji. Projektowanie starterów do reakcji PCR. INSTRUKCJA Ćwiczenie nr 5 Odczynniki: Sprzęt: 1. 5xNG cdna Buffer 2. 50 µm oligo(dt)20 3. NG dart RT mix l 4. Probówki typu Eppendorf 0,2 ml 5. Woda wolna od RNaz 6. Lód 1. Miniwirówka 2. Termocykler 3.

Bardziej szczegółowo

KŁOPOTY Z POLIMERAZĄ KŁOPOTY Z POLIMERAZĄ KŁOPOTY Z POLIMERAZĄ. SPECYFICZNOŚĆ (Specificity)

KŁOPOTY Z POLIMERAZĄ KŁOPOTY Z POLIMERAZĄ KŁOPOTY Z POLIMERAZĄ. SPECYFICZNOŚĆ (Specificity) - Specyficzność (specyficzne wiązanie się TYLKO do startera- wcześniej związanego z matrycą) - Termostabilność (utrzymanie aktywności pomimo powtarzającego się cyklicznie wzrostu temperatury) - Wierność

Bardziej szczegółowo

SPECYFIKACJA TECHNICZNA AGAROZ

SPECYFIKACJA TECHNICZNA AGAROZ SPECYFIKACJA TECHNICZNA AGAROZ D1 LOW EEO i D1 MEDIUM EEO, D1 HIGH EEO D1 LOW EEO GQT; (Genetic Quality Tested) D2 HIGH GELLING TEMPERATURE D5 HIGH STRENGTH GEL Agaroza LM Agaroza LM GQT; (Genetic Quality

Bardziej szczegółowo

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Metody amplifikacji kwasów nukleinowych dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej pj j w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Amplifikacja

Bardziej szczegółowo

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo) W probówce (PCR) Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan

Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan Klasyczna metoda PCR jest metodą jakościową, nie ilościową co np.

Bardziej szczegółowo

Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Hybrydyzacja w diagnostyce molekularnej drhab Beata Krawczyk dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Bardziej szczegółowo

Nowoczesne systemy ekspresji genów

Nowoczesne systemy ekspresji genów Nowoczesne systemy ekspresji genów Ekspresja genów w organizmach żywych GEN - pojęcia podstawowe promotor sekwencja kodująca RNA terminator gen Gen - odcinek DNA zawierający zakodowaną informację wystarczającą

Bardziej szczegółowo

Substancje stosowane do osadzania enzymu na stałym podłożu Biotyna (witamina H, witamina B 7 ) Tworzenie aktywnej powierzchni biosensorów

Substancje stosowane do osadzania enzymu na stałym podłożu Biotyna (witamina H, witamina B 7 ) Tworzenie aktywnej powierzchni biosensorów SEKWECJWAIE ASTĘPEJ GEERACJI- GS Losowa fragmentacja nici DA Dołączanie odpowiednich linkerów (konstrukcja biblioteki) Amplifikacja biblioteki na podłożu szklanym lub plastikowym biosensory Wielokrotnie

Bardziej szczegółowo

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać

Bardziej szczegółowo

Markery klasy II -Polimorfizm fragmentów DNA (na ogół niekodujących): - RFLP - VNTR - RAPD

Markery klasy II -Polimorfizm fragmentów DNA (na ogół niekodujących): - RFLP - VNTR - RAPD Marker genetyczny- polimorficzna cecha jakościowa organizmu, którą charakteryzuje proste dziedziczenie (mendlowskie) oraz którą można dokładnie identyfikować metodami analitycznymi. Markery klasy I - Antygeny

Bardziej szczegółowo

SYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki

SYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki SYLABUS 1.1. PODSTAWOWE INFORMACJE O PRZEDMIOCIE/MODULE Nazwa przedmiotu/ modułu Biologia molekularna Kod przedmiotu/ modułu* Wydział (nazwa jednostki prowadzącej kierunek) Nazwa jednostki realizującej

Bardziej szczegółowo

GRADIENT TEMPERATUR TOUCH DOWN PCR. Standardowy PCR RAPD- PCR. RealTime- PCR. Nested- PCR. Digital- PCR.

GRADIENT TEMPERATUR TOUCH DOWN PCR. Standardowy PCR RAPD- PCR. RealTime- PCR. Nested- PCR. Digital- PCR. Standardowy PCR RAPD- PCR Nested- PCR Multipleks- PCR Allelospecyficzny PCR Touchdown- PCR RealTime- PCR Digital- PCR In situ (slide)- PCR Metylacyjno specyficzny- PCR Assembly- PCR Inverse- PCR GRADIENT

Bardziej szczegółowo

TECHNIKI WYKORZYSTYWANE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHORÓB JEDNOGENOWYCH TECHNIQUES USED IN MOLECULAR DIAGNOSTICS OF MONOGENIC DISORDERS

TECHNIKI WYKORZYSTYWANE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHORÓB JEDNOGENOWYCH TECHNIQUES USED IN MOLECULAR DIAGNOSTICS OF MONOGENIC DISORDERS Nowiny Lekarskie 2006, 75, 5, 486 490 ALINA LICZBAŃSKA, ANNA WOŹNIAK, ANNA WAWROCKA, MACIEJ R. KRAWCZYŃSKI TECHNIKI WYKORZYSTYWANE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHORÓB JEDNOGENOWYCH TECHNIQUES USED IN MOLECULAR

Bardziej szczegółowo

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 7 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych

Ćwiczenie 7 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Ćwiczenie 7 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA (powielonego techniką PCR i wyizolowanego z żelu agarozowego na poprzednich zajęciach) do wektora plazmidowego

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA.

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA. SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA. SPIS TREŚCI: 1. Wprowadzenie. 2. Części lekcji. 1. Część wstępna. 2. Część realizacji. 3. Część podsumowująca. 3. Karty pracy. 1. Karta

Bardziej szczegółowo

Inżynieria genetyczna

Inżynieria genetyczna Inżynieria genetyczna i technologia rekombinowanego DNA Dr n. biol. Urszula Wasik Zakład Biologii Medycznej Inżynieria genetyczna świadoma, celowa, kontrolowana ingerencja w materiał genetyczny organizmów

Bardziej szczegółowo

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu np. w porównaniu z analizą trankryptomu:

Bardziej szczegółowo

Zestawy do izolacji DNA i RNA

Zestawy do izolacji DNA i RNA Syngen kolumienki.pl Gotowe zestawy do izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych Zestawy do izolacji DNA i RNA Katalog produktów 2012-13 kolumienki.pl Syngen Biotech Sp. z o.o., 54-116 Wrocław, ul. Ostródzka

Bardziej szczegółowo

Bioinformatyczna analiza danych. Wykład 1 Dr Wioleta Drobik-Czwarno Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt

Bioinformatyczna analiza danych. Wykład 1 Dr Wioleta Drobik-Czwarno Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt Bioinformatyczna analiza danych Wykład 1 Dr Wioleta Drobik-Czwarno Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt Sprawy organizacyjne Prowadzący przedmiot: Dr Wioleta Drobik-Czwarno koordynator przedmiotu,

Bardziej szczegółowo

Prowadzący: dr Lidia Boss znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II)

Prowadzący: dr Lidia Boss znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II) Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ============================================================================

Bardziej szczegółowo

Mikrosatelitarne sekwencje DNA

Mikrosatelitarne sekwencje DNA Mikrosatelitarne sekwencje DNA Małgorzata Pałucka Wykorzystanie sekwencji mikrosatelitarnych w jądrowym DNA drzew leśnych do udowodnienia pochodzenia materiału dowodowego w postępowaniu sądowym 27.09.2012

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)

ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) Celem ćwiczenia jest wprowadzenie mutacji punktowej do genu

Bardziej szczegółowo

Prokariota i Eukariota

Prokariota i Eukariota Prokariota i Eukariota W komórkach organizmów żywych ilość DNA jest zazwyczaj stała i charakterystyczna dla danego gatunku. ILOŚĆ DNA PRZYPADAJĄCA NA APARAT GENETYCZNY WZRASTA WRAZ Z BARDZIEJ FILOGENETYCZNIE

Bardziej szczegółowo

SYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki

SYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki SYLABUS 1.1. PODSTAWOWE INFORMACJE O PRZEDMIOCIE/MODULE Nazwa przedmiotu/ modułu Biologia molekularna z elementami inżynierii genetycznej Kod przedmiotu/ modułu* Wydział (nazwa jednostki prowadzącej kierunek)

Bardziej szczegółowo

TRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów

TRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów Eksparesja genów TRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów Przepisywanie informacji genetycznej z makrocząsteczki DNA na mniejsze i bardziej funkcjonalne cząsteczki pre-mrna Polimeraza RNA ETAP I Inicjacja

Bardziej szczegółowo

IZOLACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH WARUNKI ZALICZENIA PRZEDMIOTU- 7 ECTS PRZEDMIOT PROGOWY!!!

IZOLACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH WARUNKI ZALICZENIA PRZEDMIOTU- 7 ECTS PRZEDMIOT PROGOWY!!! WARUNKI ZALICZENIA PRZEDMIOTU- 7 ECTS PRZEDMIOT PROGOWY!!! W1-4p W2-4p W3-4p W4-4p W5-4p W6-4p W7-4p W8-4p W9-4p W10-4p min 21p wyjściówka I 40p wyjściówka II 40p egzamin I egzamin II min 21p 60p 60p min

Bardziej szczegółowo

Inżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka

Inżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka Inżynieria genetyczna- 6 ECTS Część I Badanie ekspresji genów Podstawy klonowania i różnicowania transformantów Kolokwium (14pkt) Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka Kolokwium (26pkt) EGZAMIN

Bardziej szczegółowo

Biochemia: Ćw. 11 Metoda RT-PCR

Biochemia: Ćw. 11 Metoda RT-PCR Ćwiczenie 11 METODA RT-PCR Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych: bromek etydyny T+ EDTA Xi etanol, 96% F kwas octowy, 96% C -merkaptoetanol N, T Tris Xi UWAGI WSTĘPNE Praca z kwasami

Bardziej szczegółowo

Metody inżynierii genetycznej SYLABUS A. Informacje ogólne

Metody inżynierii genetycznej SYLABUS A. Informacje ogólne Metody inżynierii genetycznej A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Kod Rodzaj Rok studiów /semestr

Bardziej szczegółowo

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu w porównaniu z analizą trankryptomu:

Bardziej szczegółowo

PCR PCR. Model replikacji semikonserwatywnej

PCR PCR. Model replikacji semikonserwatywnej PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy (Polymerase Chain Reaction) amplifikacja (namnożenie wielu kopii cząsteczki kwasu nukleinowego) w pierwotnej wersji wykorzystująca model replikacji semikonserwatywnej

Bardziej szczegółowo

października 2013: Elementarz biologii molekularnej. Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II

października 2013: Elementarz biologii molekularnej. Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II 10 października 2013: Elementarz biologii molekularnej www.bioalgorithms.info Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II Komórka: strukturalna i funkcjonalne jednostka organizmu żywego Jądro komórkowe: chroniona

Bardziej szczegółowo

AmpliTest Babesia spp. (PCR)

AmpliTest Babesia spp. (PCR) AmpliTest Babesia spp. (PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla pierwotniaków z rodzaju Babesia techniką PCR Nr kat.: BAC21-100 Wielkość zestawu: 100 oznaczeń Objętość pojedynczej reakcji:

Bardziej szczegółowo

mikrosatelitarne, minisatelitarne i polimorfizm liczby kopii

mikrosatelitarne, minisatelitarne i polimorfizm liczby kopii Zawartość 139371 1. Wstęp zarys historii genetyki, czyli od genetyki klasycznej do genomiki 2. Chromosomy i podziały jądra komórkowego 2.1. Budowa chromosomu 2.2. Barwienie prążkowe chromosomów 2.3. Mitoza

Bardziej szczegółowo

Inżynieria genetyczna Ćwiczenie 3

Inżynieria genetyczna Ćwiczenie 3 Inżynieria genetyczna Ćwiczenie 3 Metoda PCR została opracowana w 1987 r. przez grupę Naukowców z Cetus Corporation w USA. Firma Roche odkupiła od Cetus Corp. prawa do PCR za 300 mln $ Autor K. Mullis

Bardziej szczegółowo

WETERYNARIA Ćwiczenia laboratoryjne X DNA i RNA

WETERYNARIA Ćwiczenia laboratoryjne X DNA i RNA WETERYNARIA Ćwiczenia laboratoryjne X DNA i RNA (1) Rozdział RNA oraz fragmentów DNA metodą elektroforezy w żelu agarozowym, określenie wielkości fragmentów DNA (produktów PCR) na podstawie porównania

Bardziej szczegółowo

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy, nukleazy

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy, nukleazy Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce) Najważniejsze

Bardziej szczegółowo

Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych Nr kat. PK25N Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do wykrywania spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych dwie oddzielne reakcje PCR 2x50 reakcji PCR (50 µl), włączając w to kontrole Zestaw

Bardziej szczegółowo

Wykład 14 Biosynteza białek

Wykład 14 Biosynteza białek BIOCHEMIA Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka semestr III Wykład 14 Biosynteza białek WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH

Bardziej szczegółowo