POLIMERAZY DNA- PROCARYOTA

Transkrypt

1 Enzymy DNA-zależne, katalizujące syntezę DNA wykazują aktywność polimerazy zawsze w kierunku 5 3 wykazują aktywność polimerazy zawsze wobec jednoniciowej cząsteczki DNA do utworzenia kompleksu z ssdna wymagają krótkiego startera DNA lub RNA z końcem 3 -OH - do syntezy DNA (wydłużania startera) wymagają obecności nukleotydów (deoksynukleozydo-trójfosforanów) Mogą wykazywać aktywność egzonukleaz (degradacja nukleotydów) zarówno wobec cząsteczek dwu-jak i jednoniciowego DNA oraz RNA DNA-Pol I: naprawa i synteza DNA DNA-Pol III: synteza nowej nici DNA DNA-Pol II, IV i V: korekta i naprawa enzymów Polimeraza I (polimeraza Kornberga) Nagroda Nobla z dziedziny fizjologii i medycyny (1959) za odkrycie mechanizmu syntezy biologicznej DNA i RNA otrzymywana z E. coli (gen pola) Arthur Kornberg Pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 109kD w komórce pełni funkcje naprawcze DNA polimerazy (stopień syntezy:16-20 nukleotydów/sek; długość amplifikowanego fragmentu na nici DNA: nukleotydów), wymagania: ph 7.4; jony Mg 2+ ; temp: o C egzonukleazy 5 3 dwuniciowego DNA lub kompleksów DNA- RNA 1

2 AKTYWNOŚĆ POLIMERAZY I Cut & Patch: cięcie polega na usunięciu startera RNA, a uzupełnianie polega na włączeniu (syntezie) wymaganych deoksynukleotydów Nick translation: polimeraza usuwa starter RNA lub błędy DNA, gdy porusza się wzdłuż DNA, a następnie wypełnia za nim wymaganymi deoksynukleotydami Mismatch repair (naprawa niesparowania): enzym rozpoznaje niepoprawnie sparowane zasady, obszar niedopasowania zostaje usunięty i zastąpiony właściwymi deoksynukleotydami Base excision repair (BER): glikozylaza DNA w miejscu pozbawionym puryny i pirymidyny (AP site), usuwa cukier i fosforan wraz z kilkoma dodatkowymi zasadami, a następnie polimeraza wypełnia lukę, przez dosyntetyzowanie wymaganych deksynukleotydów nick translation- aktywność egzonukleazy 5 3 Po nacięciu podwójnej helisy przez DNazęI powstaje znacznik - wolny koniec 3 OH, od którego polimeraza I rozpoczyna syntezę łańcucha, wykazując jednocześnie aktywność egzonukleazy w ten sposób zastępuje starą nić nicią nową aktywność egzonukleazy 3 5 Polimeraza IK (fragment Klenowa) otrzymywana z rekombinowanej E. coli polimerazy II (gen polb) lub po proteolizie (subtilizyną) polimerazy Kornberga Hans Klenow pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 75kD w komórce pełni funkcje naprawcze DNA polimerazy (stopień syntezy:40 nukleotydów/sek; długość amplifikowanego fragmentu na nici DNA: 1500 nukleotydów), wymagania: ph 7.4; jony Mg 2+ ; temp: o C Brak aktywności 5 3! 2

3 Wypełnianie dwuniciowego DNA z 5 - jednoniciowym lepkim końcem synteza drugiej nici ssdna aktywność polimerazy 5 3 Polimeraza III otrzymywana z bakterii E. coli zrekombinowanych plazmidem z genem polc Thermus aquaticus lub Pyrococcus wosei polipeptyd heteromultimeryczny o masie cząsteczkowej ok 900kD w komórce pełni funkcje replikacji DNA polimerazy (stopień syntezy: nukleotydów/sek; długość amplifikowanego fragmentu na nici DNA: > nukleotydów), odłącza się od matrycy po zakończeniu replikacji wymagania: ph 7.4; jony Mg 2+ ; temp: o C (opt. 80 o C)* egzonukleazy 5 3 jedno- i dwuniciowego DNA lub hybryd DNA-RNA Polimeraza III (typ Taq; typ Pwo) Taq (Thermus aquaticus), rozpad połowiczny w temperaturze 95 o C po ok. 90min. Brak aktywności egzonukleazy!! Pfu (Pyrrococcus furiosus), polimeraza o największej wierności syntezy! Vent lub Tli (Thermococcus litoralis), rozpad połowiczny w temperaturze 95 o C po ok. 7godz Pwo (Pyrrococcus woesei), polimeraza odpada od nici w przypadku, gdy natrafi na uracyl 3

4 aktywność polimerazy zawsze w kierunku 5 3 POLIMERAZY DNA- FAGI Polimeraza faga T4 otrzymywana ze zrekombinowanej E. coli lub zakażonych bakteriofagiem T4 polipeptyd o masie cząsteczkowej 114kDa DNA polimerazy wymagania: ph ; jony Mg 2+ ; temp: 37 o C degraduje nukleotydy od końca 3 tworząc lepkie końce 4

5 POLIMERAZY DNA- FAGI Polimeraza faga T7 otrzymywana z E. coli zakażonych bakteriofagiem T7 dimer o masie cząsteczkowej 96kDa (84kDa- produkt genu 5 faga T7, 12kDa tioredoksyna E.colibiałko zapobiegające zbyt wczesnej dysocjacji podczas replikacji) DNA polimerazy (stopień syntezy: 300 nukleotydów/sek) wymagania: ph ; jony Mg 2+ ; temp: 37 o C używana zamiennie z fragmentem Klenowa POLIMERAZY DNA- WIRUSY Odwrotna transkryptaza otrzymywana ze zrekombinowanej E. coli (gen AMVpol) lub od kurcząt infekowanych wirusem AMV (Avian Myeloblastosis Virus) dimer o masie cząsteczkowej ok 156kD DNA/RNA wymagania: jony Mg 2+ ; temp: 42 o C egzonukleazy 5 3 oraz 3 5 specyficznej dla RNA w hybrydzie DNA-RNA POLIMERAZY DNA- EUCARYOTA Polimeraza α polipeptyd heteromultimeryczny złożony z 4 podjednostek: 180kDa aktywność polimerazy DNA 55kDa i 48kDa tworzą razem prymazę 68kDa spaja kompleks DNA polimerazy- syntetyzuje startery złożone z 10 nukleotydów RNA (prymaza) i nukleotydów DNA (polimeraza) NIE MA AKTYWNOŚCI EGZONUKLEAZY 5

6 POLIMERAZY DNA- EUCARYOTA Polimerazy δ i ε główne polimerazy replikacyjne każda złożona z 4 podjednostek: δ- (p125, p66, p50, p12) ε- (p256, p80, p23, p22) DNA polimerazy Polimeraza δ odpowiada za replikację nici opóźnionej Polimeraza ε odpowiada za replikację nici wiodącej 6