GRADIENT TEMPERATUR TOUCH DOWN PCR. Standardowy PCR RAPD- PCR. RealTime- PCR. Nested- PCR. Digital- PCR.

Transkrypt

1 Standardowy PCR RAPD- PCR Nested- PCR Multipleks- PCR Allelospecyficzny PCR Touchdown- PCR RealTime- PCR Digital- PCR In situ (slide)- PCR Metylacyjno specyficzny- PCR Assembly- PCR Inverse- PCR GRADIENT TEMPERATUR TOUCH DOWN PCR 94 o C 94 o C 72 o C x30 56 o C 94 o C 94 o C 94 o C 60 o C 72 o C 72 o C x20-0,25 o C na cykl 56 o C x16 1

2 TOUCH DOWN PCR RAPD PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA) wykorzystywany gdy nie znamy sekwencji starterów; pozwala namnożyć losowe fragmenty o różnej długości; w reakcji stosuje się tylko jeden (losowy) starter. długość około 10 nukleotydów, zawartość par G/C musi być w granicach 50-80% nie może zawierać sekwencji palindromowych* 5 CAATCGCCGT 3 RAPD PCR Tube A-08 -GTGACGTAGG- Tube A-09 -GGGTAACGCC- Tube A-10 -GTGATCGCAG- Tube A-11 -CAATCGCCGT- Tube A-12 -TCGGCGATAG- Tube A-13 -CAGCACCCAC- Tube A-14 -TCTGTGCTGG- Tube A-15 -TTCCGAACCC- Tube A-16 -AGCCAGCGAA- Tube A-17 -GACCGCTTGT- Tube A-18 -AGGTGACCGT- 2

3 RAPD PCR starter A-11 DNA starter A-11 RAPD PCR SM Po amplifikacji z wybranym starterem otrzymujemy od kilku do kilkunastu fragmentów różnej długości dla danego osobnika (charakterystyczny wzór prążkowy) RAPD PCR 3

4 Wewnętrzny/ Zagnieżdżony PCR (Nested PCR) wykorzystywany przy niespecyficznej amplifikacji fragmentu; pozwala namnożyć w dwuetapowej reakcji PCR ściśle określony fragment; w reakcji stosuje się cztery lub trzy (semi-nested) startery. Nested PCR Produkt niespecyficzny Produkt po drugiej reakcji PCR Nested PCR 4

5 Nested PCR 1 2 M Multipleks PCR wykorzystywany do jednoczesnej amplifikacji wielu fragmentów w tej samej reakcji PCR; w reakcji stosuje się do 20 par starterów znakowanych fluorescencyjnie; stosowany również jako kontrola w reakcjach bez produktu Multipleks PCR 5

6 Multipleks PCR Multipleks PCR M Multipleks PCR 6

7 Allelo-specyficzny PCR (Allele Specific PCR) wykorzystywany do wykrywania mutacji punktowych SNP; pozwala na selektywne przyłączanie się starterów w zależności od sekwencji matrycy w reakcji stosuje się trzy startery, w tym dwa znakowane fluorescencyjnie Allelo-specyficzny PCR A allel 1 primer 1 C G produkt PCR allel 2 primer 1 C C primer 1 C brak produktu PCR B allel 1 primer 2 G G brak produktu PCR G C primer 2 allel 2 produkt PCR primer 2 G Allelo-specyficzny PCR AA AB BB 7

8 PCR (Assembly PCR) generuje duże amplikony z małych fragmentów; wykorzystywany przy tworzeniu syntetycznych genów/ genomów de novo lub przy zdegradowanych matrycach; wymaga znajomości sekwencji, która ma być powielona ASSEMBLY PCR Oligonukleotydy ok 50nt zaprojektowane tak aby zakładki względem obu nici miały długość ok 20nt Druga reakcja PCR ze starterami zewnętrznymi dopasowanymi do genu Amplikon o żądanej długości By Dhorspool (talk) - self-made, CC BY-SA 3.0 PCR w czasie rzeczywistym (Real Time PCR) wykorzystywany obserwowania przyrostu produktu PCR w czasie rzeczywistym (na bieżąco); pozwala na wykrycie amplifikacji na kilku kopiach matrycy; w reakcji stosuje się barwniki fluorescencyjne uwalniane lub włączane do nowopowstałych cząsteczek 8

9 SYBR green- interkalacja SYBR Green Specyficzność reakcji zależna od starterów Nie umożliwia przeprowadzenia reakcji typu multipleks Umożliwia zaobserwowanie dodatkowych produktówprzy niespecyficznych starterach Zafałszowania w odczycie fluorescencji (dimery, wszystkie dwuniciowe konformacje)- wielkość wykrywanych produktów dla różnych genów musi być BARDZO ZBLIŻONA BARDZO TANIA! Aktywne fluorochromy Transfer energii rezonansu fluorescencji (Fluorescence Resonance Enetgy Transfer- FRET) 1. Przeniesienie emisji: fluorochrom pierwszy (zwany reporterem lub donorem) w wyniku wzbudzenia falą świetlą o odpowiedniej długości, przenosi energię na fluorochrom drugi (wygaszacz lub akceptor), który następnie emituje kwant światła o innej długości Sondy- TaqMan TaqMan Specyficzność reakcji zależna od starterów i sondy Umożliwia przeprowadzenie reakcji typu multipleks Nie umożliwia zaobserwowania dodatkowych produktówprzy niespecyficznych starterach* NIE JEST TANIA ale przy zoptymalizowanej reakcji opłacalna 2. Wygaszenie emisji: Fluorochrom pierwszy (zwany reporterem lub donorem) jest wygaszany przez fluorochrom drugi (wygaszacz lub akceptor), który pochłania emisję fali reportera. Wzbudzenie emisji nastąpi dopiero po odłączeniu reportera od wygaszacza 9

10 PCR emulsyjny (Digital PCR) wykorzystywany obserwowania przyrostu produktu PCR w czasie rzeczywistym; pozwala na wykrycie amplifikacji na jednej kopii matrycy; w reakcji stosuje się rozwarstwienie matrycy w kroplach emulsji(roztwór micelarny) oraz barwniki fluorescencyjne; liczba micelek w których zaszła amplifikacja odpowiada bezpośrednio (1:1) liczbie kopii na początku reakcji DIGITAL PCR PCR in situ (Slide PCR) wykrywa niewielkie ilości rzadkich lub pojedynczych kopii sekwencji kwasów nukleinowych w zamrożonych lub zatopionych w parafinie komórkach lub w hodowlach tkankowych; weakcja zachodzi na szkiełku bezpośrednio na tkance/ w komórce, która nie jest poddana pełnemu procesowi ekstrakcji DNA a jedynie (co najwyżej) proteolizie; służy do wykrywania ściśle określonych sekwencji np. wirusów; Produkt reakcji jest widoczny po zastosowaniu standardowych protokołów immunocytochemicznych 10

11 SLIDE PCR Rodzaje kontroli PCR nazwa NTC bez matrycy (No Target Control) efekt Kontrola czystości odczynników do reakcji PCR PC- Kontrola pozytywna (Positive Control) Kontrola właściwego przebiegu reakcji PCR * IPC wewnętrzna kontrola pozytywna (Internal Positive Control) Kontrola właściwego przebiegu reakcji PCR ** Stosowana alternatywnie do PC NAC bez amplifikacji- (No Amplification Control) Kontrola z inhibitorem (wszystkie reagenty oraz matryca +inhibitor reakcji np. etanol)- kontrola jakości matrycy, czystości plastików oraz sprzętu 11